专利名称：一种黑曲霉及用其酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法
技术领域：
本发明涉及由人参皂甙大量制备稀有低极性人参皂甙及其甙元的方法，特别提供了一种人工驯化的YLY菌(黑曲霉Aspergillus niger v.Tiegh)，及用其发酵和制备稀有人参皂甙的方法。
本发明还提供了一种用上述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法。
本发明黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法中，黑曲霉培养条件粗旷，营养要求不严格；可生长于任何培养基中如选择性强的查氏琼脂、查氏酵母膏琼脂、麦芽汁琼脂、高氏培养基或普通、非选择性的各种培养基。优选查氏琼脂、查氏酵母膏琼脂、麦芽汁琼脂、高氏培养基。
本发明黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法中，培养基中人参皂甙所占的比例为0.1～30％，酵解温度25-45℃，酵解时间2小时～7天。
本发明黑曲霉酵解人参皂甙酵制备稀有低极性人参皂甙的方法中，可以通过酵解天然人参二醇型皂甙，得到稀有人参皂甙CK；通过酵解人参皂甙Rb2，得到稀有人参皂甙CY；通过酵解人参皂甙Rc，得到稀有人参皂甙Mc；通过酵解人参皂甙Re，得到稀有人参皂甙Rg1；通过酵解人参皂甙Rg3，得到稀有人参皂甙Rh2；通过酵解人参皂甙Rg2、Rf，得到稀有人参皂甙Rh1；通过酵解人参总皂甙，得到人参皂甙甙元原人参二醇和原人参三醇；通过酵解人参皂甙Rk1、Rg5，得到人参皂甙Rk2、Rh3，及甙元3β-O-达玛烷-20(22)，24-二烯、3β-O-达玛烷-20(21)，24-二烯。
实施以上操作过程，本发明所提供的黑曲霉菌还可用于酵解其它糖甙类化合物如三七皂甙、绞股蓝皂甙、芍药甙、柴胡皂甙、黄芩甙、黄芪甙、去羟栀子甙等，制备相应的水解产物。
本发明所用黑曲霉菌是将各种来源的黑曲霉菌转入含有人参皂甙的培养基中，经传代培养、驯化、筛选得到的能够酵解产生稀有人参皂甙及其甙元的菌株，经中国科学院微生物研究所鉴定为黑曲霉Aspergillus niger v.Tiegh.。该菌为好氧型，孢子生殖的革兰氏阳性杆菌；菌丝体为白色，全部落于培养基内部。镜检结果表明，该菌分生孢子梗发生于基质，在CA上发生于表面菌丝，分子孢子初为球形；孢梗茎120-300×9-10.8μm，壁平滑；顶囊球形，近球形，36-72μm，全部表面可育；产孢结构双层，梗茎14.4-21.6×5.4-7.2μm，瓶梗安瓿形，8.1-10.8×2.5-3.0μm；分生孢子球形，直径3.6×6.4μm，表面明显棘刺状。在查氏琼脂(CA)上，25℃，7天，菌落直径25-27mm，较厚，表面辐射状沟纹较多；质地绒状兼稍絮状；分生孢子结构少量，黄橄榄色；菌丝体白色；无渗出液和可溶性色素；反面黄白色。在查氏酵母膏琼脂(CYA)上，25℃，7天，菌落直径70-72mm，较厚，表面具有较多辐射状沟纹；质地绒状；分生孢子结构大量，褐黑色；菌丝体全部于培养基内部；无渗出液和可溶性色素，反面浅黄。在麦芽琼脂(WA)上，25℃，7天，菌落直径70-72mm，较厚，表面具有大量辐射状皱纹；质地绒状；分生孢子结构大量，褐黑色；菌丝体全部于培养基内部；无渗出液和可溶性色素；反面褐色。
本发明为人参二醇类皂甙的发酵水解、制备低极性人参皂甙提供了一种来源方便、价格低廉的黑曲霉菌，用该菌株制备低极性人参皂甙工艺便捷、成本低、回收率高。使用本方法制备的低极性人参皂甙含量≥95％，甙元收率≥80％。
实施例1从潮湿的软木上分离得到暗黑色的菌苔，无菌取下；在查氏平板上涂板，分出单菌落。将菌落接种到查氏液体培养基中，传代三次后，转入含有人参皂甙的培养基中，传代、驯化，经36代培养，得到能够酵解人参皂甙、产生稀有人参皂甙及甙元的菌株---YLY菌，送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC 0751，保藏日为2002年6月14日。
实施例2将YLY菌接种于加入30克人参皂甙Rb1的无糖查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养24小时，培养混合液经高温灭活。用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到人参皂甙CK 10克，经检验人参皂甙CK含量≥95％。
实施例3YLY菌接种于加入30克人参皂甙Rd的无糖查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养24小时，培养混合液经高温灭活。用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到纯品人参皂甙CK 15克，经检验人参皂甙CK含量≥95％。
实施例4YLY菌接种于加入30克人参皂甙Rb2的无糖查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养24小时，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到人参皂甙CY 18克，经检验人参皂甙CY含量≥95％。
实施例5YLY菌接种于加入30克Rc的无糖查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养24小时，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化，远红外干燥，得到人参皂甙Mc16克，经检验人参皂甙Mc含量≥95％。
实施例6YLY菌接种于加入30克Re的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养24小时，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到人参皂甙Rg120克，经检验人参皂甙Rg1含量≥95％。
实施例7YLY菌接种于加入30克Rg2的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养24小时，培养混合液液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到人参皂甙Rh119克，经检验人参皂甙Rh1含量≥95％。
实施例8YLY菌接种于加入30克Rg3的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养3日，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到人参皂甙Rh211克，经检验人参皂甙Rh2含量≥95％。
实施例9YLY菌接种于加入30克Rg5的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养24小时，培养液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到人参皂甙Rh310克，经检验Rh3含量≥95％。
实施例10YLY菌接种于在加入30克Rk1的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养24小时，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到人参皂甙Rk29克，经检验Rk2含量≥95％。
实施例11YLY菌接种于在加入30克Rg3的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养5日，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到原人参二醇10克，经检验原人参二醇含量≥95％。
实施例12YLY菌接种于加入30克Rg1的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养5日，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到原人参三醇12克，经检验原人参三醇含量≥95％。
实施例13YLY菌接种于加入30克Rk1的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养5日，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到3β-O-达玛烷-20(22)，24-二烯6克，经检验3β-O-达玛烷-20(22)，24-二烯含量≥95％。
实施例14YLY菌接种于加入30克Rg5的无糖的查氏培养基(1000ml)中培养，37℃下培养5天，培养混合液经高温灭活，用水饱和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，经正相制备色谱(流动相为氯仿/甲醇的混合液)分离纯化；远红外干燥，得到3β-O-达玛烷-20(21)，24-二烯5克，经检验3β-O-达玛烷-20(21)，24-二烯含量≥95％。
权利要求
1.一种由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的黑曲霉，保藏号为CGMCC 0751，保藏日为2002年6月14日。
2.一种用权利要求1所述黑曲霉酵解人参皂甙酵制备稀有低极性人参皂甙的方法。
3.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于所述培养基为查氏琼脂、查氏酵母膏琼脂、麦芽汁琼脂或高氏培养基。
4.按照权利要求3所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于培养基中，人参皂甙所占的比例为0.1～30％，酵解温度25-45℃，酵解时间2小时～7天。
5.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解天然人参二醇型皂甙，得到稀有人参皂甙20-O-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇，简称CK。
6.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人参皂甙Rb2，得到稀有人参皂甙20-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇，简称CY。
7.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人参皂甙Rc，得到稀有人参皂甙20-O-α-L-呋喃阿拉伯糖-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇，简称Mc。
8.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人参皂甙Re，得到稀有人参皂甙Rg1。
9.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人参皂甙Rg3，得到稀有人参皂甙Rh2。
10.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人参皂甙Rg2、Rf，得到稀有人参皂甙Rh1。
11.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人参总皂甙，得到人参皂甙甙元原人参二醇和原人参三醇。
12.按照权利要求2所述黑曲霉酵解人参皂甙制备稀有低极性人参皂甙的方法，其特征在于；黑曲霉酵解人参皂甙Rk1、Rg5，得到人参皂甙Rk2、Rh3，及甙元3β-O-达玛烷-20(22)，24-二烯、3β-O-达玛烷-20(21)，24-二烯。
13.一种用权利要求1所述黑曲霉酵解糖甙的方法，包括三七皂甙、绞股蓝皂甙、芍药甙、柴胡皂甙、黄芩甙、黄芪甙、去羟栀子甙等各种植物糖甙。
全文摘要
一种保藏号为CGMCC 0751的黑曲霉，及用该黑曲霉酵解人参皂甙酵制备稀有低极性人参皂甙的方法。培养基选自查氏琼脂、查氏酵母膏琼脂、麦芽汁琼脂、高氏培养基。培养基中，人参皂甙所占的比例为0.1～30％，酵解温度25－45℃，酵解时间2小时～7天。本发明为人参二醇类皂甙的发酵水解、制备低极性人参皂甙提供了一种来源方便、价格低廉的黑曲霉菌，用该菌株制备低极性人参皂甙工艺便捷、成本低、回收率高。使用本方法制备的低极性人参皂甙含量≥95％，甙元收率≥80％。
文档编号C12N1/14GK1465694SQ0213240
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月20日 优先权日2002年6月20日
发明者杨凌, 何克江, 杨义, 李芳 , 都绛英, 杨 凌 申请人:中国科学院大连化学物理研究所