专利名称：利用转化柠檬酸合成酶基因培育磷高效水稻的方法
技术领域：
本发明属于基因工程和水稻分子育种技术领域。具体地说涉及到应用转基因方法将外源柠檬酸合成酶基因(CS)导入水稻受体，通过增加柠檬酸的合成与分泌，增强水稻对低磷的耐性，培育一种磷高效水稻新品种或者创造新资源的方法。
背景技术：
世界范围内土壤有效磷的缺乏已不同程度地影响了作物的生长和产量。长期以来，植物营养与施肥研究多采用改土、施肥等措施提高土壤肥力，这不但增加了农业的成本，而且化肥的大量施用也加重了环境，尤其是水体的污染。常规的磷高效水稻资源筛选及杂交育种也是当今磷高效水稻育种的主要方法，但由于其受有性杂交亲本资源的限制，应用这种育种方法培育磷高效水稻品种的困难越来越大。基因工程方法的应用，使人们得以在基因资源的利用上突破了生物学上物种的界限。虽然植物基因工程在改良作物的抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂、品质、杂交制种技术等方面取得了较大的成功，但在提高作物对土壤磷的高效利用方面至今仍未找到有效途径。利用转基因手段培育低投入、高产出，能大范围推广应用的磷高效水稻新品种，已成为我国农业持续发展的一个重要的战略措施。
植物本身具有耐低磷胁迫的机制，主要涉及根系对难溶性磷的活化、对低浓度有效磷的高效吸收以及对吸收的磷的有效利用等。根系对难溶性磷的活化的机制较多，但主要有两种一是利用土壤中的难溶性有机磷的机制，即根系分泌酸性磷酸酶(Apase)和RNA酶(Rnase)以释放PO43-；二是利用难溶性无机磷(FePO4，AlPO4等)有关的机制，即根系分泌有机酸(主要是柠檬酸、苹果酸、草酰乙酸、琥珀酸等)以螯合Fe、Al、ca等金属离子从而释放PO43-。其中，根系分泌有机酸以活化土壤中难溶性无机磷，这是植物较为有效的解除磷胁迫的途径(Lipton等，Citrate，malate and succinate concentration in exudatesfrom P-sufficient and P-stressed Medicago sativa L.Seedlings.Plant Physiol，1987，85315-317)。在羽扇豆(Gardner等，.The acquisition of phosphorus by Lupinus albusL.III The probable mechanism by which phosphorus movement in the soil/root interfaceis enhanced.Plant soil，1983，70107-124)、牧草(Lipton等.Citrate，malate andsuccinate concentration in exudates from P-sufficient and P-stressed Medicagosativa L.Seedlings.Plant Physiol，1987，85315-317)、油菜(Hoffland等，Biosynthesis and root exudation of citric and malic acids in phosphate starved rapeplants.New Phytol.1992，122675-680)等作物中，都发现有机酸的分泌与磷释放及抗铝毒的相关性。Dinkelaker等(Dinkelaker等，Citric acid excretion and precipitationof calcium citrate in the rhizosphere of white lupin(Lupinus albus L.).Plant CellEnviron，1989，12285-292)报道了土壤在缺磷条件下可诱导白羽扇豆形成簇生根，光合作用同化碳的23％以柠檬酸的形态从簇生根区分泌进入根际，这些柠檬酸一方面提高了土壤中难溶性磷化合物的溶解度，使难溶性磷得以释放；另一方面，柠檬酸与Al3+的稳定的螯合也减轻或消除了铝对植物根系的毒害。1997年，de la Fuente等人将假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的柠檬酸合成酶基因导入到烟草和木瓜中超表达(de la FuenteJ M，Ramirez-Rodrigez V，Cabrera-Ponce J S，Herrera-Esterella L.Aluminum tolerancein transgenic plants by alteration in citrate synthesis.Science，1997，2761566-1568)，其根系柠檬酸合成能力比对照提高10倍以上，根系分泌的柠檬酸比对照高出4倍以上，转基因植株在300μm铝浓度的培养基上生根并正常生长，而对照植株在50μm铝浓度下就不能生根。2000年，JoséLópez-Bucio等人在烟草中超量表达柠檬酸合成酶基因(JoséLópez-Bucio，Octavio Matínez de la Vega，Arturo Guevara-Barcía，and LuisHerrera-Estrella.Enhanced phosphorus uptake in transgenic tobacco plants thatoverproduce citrate.Nature Biotechnology 2000，18(4)450-453)，结果表明，转基因植株对磷的吸收能力大大增强，植株株高、果实干重、叶面积以及生物学产量等指标都显著强于对照；Koyama等(Koyama等，Overexpression of mitochondrial citrate synthasegene improve the growth of carrot cells in Al-phosphate medium.Plant Cell Physiol，1999，40482-488)在胡萝细胞中超表达线粒体柠檬酸合成酶后发现，在AlPO4的培养基上，植株对Pi的吸收显著提高。2000年，Koyama等再次将线粒体柠檬酸合成酶基因导入拟南芥(Koyama等，Overexpression of mitochondrial citrate synthase in Arabidopsisthaliana improved growth on a phosphorus-limited soil.Plant cell physiol，2000，41(9)1030-1037)，发现根部分泌的柠檬酸比对照高出3倍，对Pi的吸收能力也大大提高，在对Al3+毒害的耐性方面，转基因植株也显著强于对照。
然而，与其它作物相比，水稻在酸性土壤或缺磷环境下根系分泌的柠檬酸很少(Takashi Otani等.，)。因而，通过转基因技术，将外源柠檬酸合成酶基因导入到水稻中，将会有效提高水稻对低磷的耐性。
发明内容
本发明的目的就是通过转基因技术，从细菌中克隆柠檬酸合成酶基因(Citratesynthase，CS)将改造后的外源柠檬酸合成酶基因导入到水稻受体中，然后通过杂交育种的方法筛选对低磷有耐性和提高柠檬酸合成的水稻新品种或新种质。
本发明通过以下技术方案实现以聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法，从假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组中克隆柠檬酸合成酶基因的氨基酸编码序列，加以遗传改造后，通过转基因方法，将目的基因转入水稻受体中，获得大量的转基因植株，结合PCR和分子杂交方法，生理生化分析方法和缺磷盆栽及相关农艺性状的考查，在自交后代中选育有效分蘖数明显增多，单株产量较大提高的转基因株系，选育磷高效品种和创造育种新资源。其操作步骤如下
一种培育磷高效水稻的方法，其特征在于a.利用聚合酶链式反应(PCR)的方法从假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)中克隆柠檬酸合成酶(Citrate synthase，CS)基因的编码序列；b.通过基因工程的方法构建适合于在植物中表达的重组基因的表达载体；c.利用转基因方法将外源柠檬酸合成酶基因导入水稻受体，获得转化植株；d.借助报告基因和PCR方法鉴定阳性转化株，进一步用分子杂交方法鉴定阳性转化株的整合拷贝数，将含1至少数几个拷贝的转化株自交结实，分单株收种；e.对上季选留的种子进行磷胁迫种植，挑选有希望的株系，利用PCR方法鉴定阳性单株，自交留种；f.对收获的种子进行磷胁迫种植，进一步考察其耐低磷的能力和农艺性状，从表型稳定、耐低磷及农艺性状有较大改善的2-3个株系中选择其纯合的单株；g.进一步培育成新品系或育种新资源。
本发明的优点在于1、利用超表达外源柠檬酸合成酶基因提高植株对低磷的耐性，创造一种磷高效水稻育种的新方法；2、本方法可以直接应用于其它磷高效作物新品种和新资源的创造；3、采用转基因方法，结合分子生物学技术，品种选育的周期短、效率高。
详细的技术细节由以下实施例给出，但并不是限制本发明的保护范围。
具体的实施方式实施例1柠檬酸合成酶基因编码序列的克隆a.根据Lynda等(Lynda，Gilles F.Molgat and Harry W.Duckworth.Cloning，sequencing，and expression of the gene for NADH-sensitive citrate synthase ofPseudomonas aeruginosa.J Bacteriol，1989，171(10)5542-5550)报道的假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)柠檬酸合成酶基因编码序列设计引物P1(5’-GCGGA TCCATGGCT GAC AAA AAA GCG-3’)和P2(5’-CGGGA TCCTCA GCC GCG ATC CTT GAG-3’)。
引物中分别设计了一个BamHI内切酶识别位点，以便于基因的改造；b.用PCR克隆的方法从假单孢杆菌(编号为Pa 1.112，该菌株由中国科学院微生物研究所购得)基因组中克隆柠檬酸合成酶基因编码序列(实施例1的a部分已公开了该基因的核苷酸序列)；c.经BamHI酶切，连入载体pBluescript-SK，命名为pBS-CS；d.利用编码序列中5’端的一个KpnI酶切位点，选择正向插入的pBS-CS(正向插入时多克隆位点上的SmaI和XbaI酶切位点分别位于编码序列的5’端和3’端)，命名为pBS-CS1，测序验证。
实施例2重组基因及表达载体的构建
a.用SmaI和XbaI酶对质粒pBS-CS1进行双酶切，回收酶切产物；b.同时将含有增强表达的双35S启动子及3’端调控序列的载体pRTL2-NS用SmaI和XbaI酶进行双酶切，回收酶切产物；c.两种酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，重组质粒命名为pRTL2-Cs；d.对重组质粒pRTL2-CS用HindIII酶切，回收酶切产物；同时用HindIII酶切双元Ti质粒载体pCAMBIA1301，并作去磷酸化处理，回收酶切产物；e.两种酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，将重组的双元Ti质粒载体命名为p1301-CS；f.将p1301-CS导入农杆菌EHA105菌株，用于侵染植物愈伤。
实施例3盆栽用缺磷土壤有效磷含量的测定用钼锑抗法(华中农业大学教学实验用书《土壤化学实验指导书》，1993年，华中农业大学教材科)测定盆栽用缺磷土壤中有效磷的含量为2.25mg/kg。为了提高土壤中全磷的含量，我们在土壤中按1/1000的比例增施磷矿粉。经测定，磷矿粉中有效磷的含量为11.76mg/kg。
实施例4水稻品种“合江19”的耐磷性鉴定将水稻品种“合江19”进行盆栽，实验设33ppm和66ppm 2个磷梯度，4次重复，每个重复3棵苗，分蘖后期(约播种后50天)进行分蘖数调查，结果如下表1 水稻品种“合江19”在不同磷梯度下分蘖数统计
实施例5农杆菌Ti质粒介导的遗传转化a.将水稻品种“合江19”的成熟胚在N6培养基上诱导愈伤组织，并用N6培养基继代培养20天；b.将生长旺盛、鲜黄色的颗粒性愈伤组织接入含1％葡萄糖和100μM乙酰丁香酮的1/2N6培养基上预培养4-5天；c.将新活化的处于对数生长期的农杆菌菌液浸泡经过预培养的愈伤组织，30分钟后用灭菌的吸水纸吸干愈伤组织上的菌液，再接入新的预培养基上，置19℃-21℃温度下培养2-3天；d.用无菌水充分洗涤共培养后的愈伤组织，吸干后接入含250mg/L羧苄青霉素和50mg/L潮霉素选择培养基上进行抗性筛选，每两星期继代一次；e.将新长出的抗性愈伤转入含50mg/L潮霉素的分化培养基上再生植株；f.再生植株移入1/2 MS培养基上生根，然后移入钵中盆栽，一星期后再移入大田。
实施例6转基因植株的筛选及理想转基因新材料的培育a.对移入大田的“合江19”的抗性再生植株取叶片作GUS报告基因分析；同时取叶片抽提DNA，作PCR检测及分子杂交方法鉴定转基因植株，将拷贝数为1-3个的转基因株自交结实，单株收种；b.将上季选留的种子进行磷胁迫(phosphorus stress)种植，利用PCR方法鉴定阳性单株，结合植株耐低磷能力和农艺性状的考察，得到12个合江19的转化株系，自交留种；c.继续从上季收获的种子按株系和单株编号进行磷胁迫种植。进一步对植株耐低磷能力和农艺性状进行考察，从中选择表型稳定、耐低磷能力和农艺性状有较大改善的2-3个纯合单株；d.进一步培育成新品系或用于回交育种的供体亲本。
实施例7磷胁迫种植水稻植株的农艺性状考察将表型稳定、耐低磷能力和农艺性状有较大改善的纯合候选单株种子再进行磷胁迫全生育期盆栽，考种结果如下表2柠檬酸合成酶转基因水稻(本发明)与对照的农艺性状比较 注设计4次重复，每个重复3株苗
权利要求
1.一种培育磷高效水稻的方法，其特征在于a.利用聚合酶链式反应(PCR)的方法从假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)中克隆柠檬酸合成酶(Citrate synthase，CS)基因的编码序列；b.通过基因工程的方法构建适合于在植物中表达的重组基因的表达载体；c.利用转基因方法将外源柠檬酸合成酶基因导入水稻受体，获得转化植株；d.借助报告基因和PCR方法鉴定阳性转化株，进一步用分子杂交方法鉴定阳性转化株的整合拷贝数，将含1至少数几个拷贝的转化株自交结实，分单株收种；e.对上季选留的种子进行磷胁迫种植，挑选有希望的株系，利用PCR方法鉴定阳性单株，自交留种；f.对收获的种子进行磷胁迫种植，进一步考察其耐低磷的能力和农艺性状，从表型稳定、耐低磷及农艺性状有较大改善的2-3个株系中选择其纯合的单株；g.进一步培育成新品系或育种新资源。
全文摘要
本发明公开了一种利用转基因技术培育磷高效水稻的方法，属于基因工程和植物新品种选育技术领域。其特征在于将来源于细菌的柠檬酸合成酶基因(Citrate synthase，CS)导入水稻受体，借助报告基因、聚合酶链式反应(PCR)检测和分子杂交鉴定出转基因植株，考查后代植株对土壤无效磷的吸收情况和农艺性状，选育分蘖数明显增多、产量有较大提高、耐低磷的转基因水稻株系，进而培育磷高效水稻品种和创造育种新资源。
文档编号C12N15/09GK1500875SQ02149378
公开日2004年6月2日 申请日期2002年11月15日 优先权日2002年11月15日
发明者张启发, 周泽民, 林拥军, 贺立源, 徐才国 申请人:华中农业大学