专利名称：利用嗜热真菌生产热稳定糖化酶的方法
(一)发明领域本发明涉及利用嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus)生产热稳定糖化酶的方法。
(二)发明背景糖化酶是一种具有外切活性的淀粉酶，可将淀粉、糊精和糖原水解为葡萄糖，是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之一，已广泛应用于轻工、医药、环保、食品加工、饮料工业等方面，受到业内的高度重视，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。目前国内外糖化酶主要由嗜温真菌生产，它们产生的糖化酶热稳定差，酶活力低；另一方面，用嗜温真菌发酵生产糖化酶，普遍存在杂菌污染，使糖化酶的生产和应用受到很大限制。
发明内容本发明的目的是提供利用嗜热真菌生产热稳定糖化酶的一种方法。用该方法生产的热稳定糖化酶，不仅生产成本低、酶回收率高、无环境污染，而且可以有效防止常温发酵条件下普遍存在的杂菌污染问题。嗜热真菌是真核生物生长上限温度最高的一种真菌。发明人从嗜热真菌中经筛选获得高产热稳定糖化酶的优良菌株。该嗜热真菌菌株产生的热稳定糖化酶最适作用温度70℃，最适作用pH5-7。在60℃条件下24小时不丧失活性，70℃的半衰期45分钟，80℃的半衰期20分钟，是目前发现的热稳定最高的糖化酶，比国内外市场上应用的糖化酶产品有高的热稳定性，具研究开发价值。其次，利用嗜热真菌发酵生产糖化酶是在高温条件(45-50℃)下进行，可以有效地防止杂菌的污染，在控制发酵污染方面具有重要意义。
本发明采取下列技术来实现(1)利用嗜热真菌的分离技术，真菌经过筛选获得高产热稳定糖化酶的优良菌株；(2)采用玉米粉为主要碳源、酵母膏为主要氮源制成液体培养基；(3)将产酶菌株接入含有液体培养基的发酵罐中，在45-50℃、pH5-7条件下发酵72小时；(4)发酵液过滤后，经硫酸铵沉淀、透析脱盐后，得到浓缩酶液，最终酶活50000单位/毫升。
(四)发明效果由于采用嗜热真菌优良菌株生产热稳定糖化酶，优良菌株糖化酶产量比原始菌株提高12％；高温有效地防止了杂菌污染。将该糖化酶用于淀粉的糖化，酶用量减少21％，糖化时间缩短，降低了成本，提高了效益。
(五)发明附1嗜热真菌生产热稳定糖化酶工艺流程中1是准备菌种，2是组配培养基，3是发酵，4是酶液浓缩，5是成品。
(六)发明最佳实施例菌种嗜热真菌优良菌株培养基玉米粉10％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，自来水配制。
发酵条件发酵罐10升，温度45-50℃，pH5-7，发酵周期72小时，发酵液过滤得到原酶液。
酶液浓缩原酶液经硫酸铵沉淀、透析脱盐后，得到浓缩酶液，最终酶活50000单位/毫升。
将菌种接种到PDA平板上45-50℃培养7天后，制成孢子悬浮液(孢子数106/毫升)，然后将孢子悬浮液接入到含上述培养基的10升发酵罐中，在45-50℃条件下，通风10.8，搅拌100-120转/分钟，发酵72小时，发酵液在4℃下1500g离心15分钟，上清液为原酶液。原酶液加固体硫酸铵至饱和度80％，静置24小时后，在4℃条件下10000g离心30分钟，弃上清，沉淀加50mM磷酸缓冲液(pH7.0)溶解，利用透析袋在50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中透析24小时(中间更换一次缓冲液)后，4℃ 10000g离心15分钟，弃沉淀，上清液用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)和1％苯甲酸钠调浓度，使酶液糖化酶活性单位达到50000单位/毫升，苯甲酸钠浓度为0.1％。
嗜热真菌优良菌株热稳定糖化酶进行淀粉糖化，糖化时间缩短。传统的淀粉糖化过程由于使用的糖化酶热稳定性差，糖化的温度必须从90℃降低到55-60℃后，才能加糖化酶。利用该热稳定糖化酶，糖化的温度从90℃降低到70℃以后，就可加入糖化酶进行糖化，加之高温条件糖化速度加快，因此糖化时间缩短。另一方面，由于该糖化酶的热稳定性，克服了高温失活的困难，所需酶量减少21％，降低了成本，提高了效益。
权利要求
1.一种利用嗜热真菌生产热稳定糖化酶的方法，其特征在于真菌培养基的成份及其重量比为玉米粉10％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，用自来水配制。
2.根据权利要求1所述的一种利用嗜热真菌生产热稳定糖化酶的方法，其特征在于培养基的发酵温度为45-50℃，PH5-7，发酵时间72小时，将发酵液过滤后获得原酶液。
3.根据权利要求1所述的一种利用嗜热真菌生产热稳定糖化酶的方法，其特征在于将原酶液经硫酸铵沉淀、透析脱盐后获得浓缩酶液。
全文摘要
本发明涉及嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus)热稳定糖化酶的生产方法，其生产工艺是嗜热真菌经过紫外线和亚硝基胍诱变等处理，筛选获得高产热稳定糖化酶的优良菌株。将嗜热真菌优良菌株接入含有玉米粉为主要碳源、酵母膏为主要氮源制成液体培养基的发酵罐中，在45－50℃、pH5－7的条件下发酵72小时。发酵液过滤后，经硫酸铵沉淀、透析脱盐后，得到浓缩酶液，最终酶活50000单位/毫升。应用上述酶制剂进行淀粉糖化生产，糖化时间缩短，酶量减少21％，效益显著。
文档编号C12N1/14GK1456667SQ0311256
公开日2003年11月19日 申请日期2003年6月11日 优先权日2003年6月11日
发明者李多川 申请人:山东农业大学