专利名称：一种低温蛋白酶及其生产方法与生产专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种低温蛋白酶，它的生产方法及其生产专用菌株。
背景技术：
蛋白酶是一类非常重要的工业用酶，占工业用水解酶的60％左右。已广泛用于食品、洗涤、皮革、饲料等工业。目前，为了提高衣物的洗净率，常在洗涤剂中添加蛋白酶，以分解去除粘附于被洗衣物上的蛋白质及其它污垢(Sung-Hoo等，EP1304372，2003；Aronson等US 4,959,179，1990)。
理想的洗涤剂用蛋白酶是在洗涤中可充分发挥蛋白酶活性的蛋白酶。目前洗衣粉中的蛋白酶一般都是中温蛋白酶，最适酶活温度一般在50℃以上，要达到最佳效果，洗涤用水要在50-60℃。我国的洗涤方法是以低温洗涤为主，近来为了节省能源，欧美国家也出现了洗涤温度低温化的倾向，中温蛋白酶由于在低温条件下酶活低，效率差，达不到最佳应用效果，只有增加用量才能达到最佳应用效果。因此理想的洗涤剂用蛋白酶是在低温下也能充分发挥作用的蛋白酶。
根据Margsin等人(Margesin等，J.Basic Microbiol 31377-383，1991)的定义，低温酶是指最适催化温度在30℃左右，在0℃左右仍有一定催化效率的一类酶。低温蛋白酶的最适酶活温度一般在40℃以下，它具有最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点。因而在洗涤剂、饲料、皮革、食品加工等工业应用中有着中温蛋白酶无法取代的优越性。低温蛋白酶已越来越受到人们的重视。自20世纪70年代以来，世界上已有许多实验室在从事低温蛋白酶的研究。有些低温蛋白酶已用于工业生产(Margesin等，J.Biotech 331-14，1994)。
低温蛋白酶通常由嗜冷菌(Psychrophiles)和耐冷菌(Psychrotrophiles)产生。Margesin等(J.Basic Microbiol 31377-383，1991)从海拔2100m的高山泥土中分离的低温黄单胞菌(Xanthomonas maltopholia)产生的低温碱性金属蛋白酶，最适酶活温度50℃，最适pH值8.0，在40℃下保温1小时，酶活性下降5％，该高山低温菌产生的蛋白酶特性与中温蛋白酶差异不大。Shibata等[Biosci.Biotech.Biochem.61710-715，1997]报道，从海洋贝壳中分离的低温交替单胞菌(Alteromonassp.3696)产生的低温碱性金属蛋白酶，最适酶活温度40℃，最适pH8.5-9.0，40℃下15min，酶活下降20％。Hoshino等[Letters in Applied Microbiology，2570-72，1997]从海洋冷水鱼的消化道中分离的低温假单胞菌(Pseudomonas sp.)产生的金属蛋白酶最适酶活温度为25℃，40℃下1小时，酶活丧失75％，是目前已经报道的低温金属蛋白酶中酶活最大、酶活温度最低、热稳定性最差的蛋白酶。陈秀兰等(海洋科学254-8，2001)从深海淤泥中分离的耐冷假单胞菌(Pseudomonas sp.SM9913)所产的低温蛋白酶，最适酶活温度35℃，最适pH9.0，40℃下10min，酶活即丧失85％。目前报道的低温蛋白酶在低温条件下催化效率高，但热稳定性差，在40℃下保温1小时，酶活就丧失75％[Hoshino等Letters in Applied Microbiology，2570-72，1997]。
发明创造内容本发明的目的是提供一种能够在低温条件下产生具有较高酶活性的低温蛋白酶的菌株。
能够产生低温蛋白酶的菌株可以是与假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3在DNA杂交中显示70％以上同源性的菌株；优选为假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3。假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3已于2003年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1021。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC № 1021自冰山泥样中分离得到。菌种筛选培养基为(g/L)蛋白胨，10；酵母提取物，5；NaCl，10；K2HPO4，1；CaCl2，0.7；MgSO4，0.2；脱脂奶粉，5；pH7.0-7.2。假单胞菌(Pseudomonassp.)C15-3 CGMCC № 1021菌落为圆形，光滑，乳黄色，稍粘；细胞为杆状，革兰氏阴性菌；生长pH值范围是6.0-9.0，最适7.5；温度范围10-35℃，最适20℃。
本发明的另一个目的是提供一种在低温条件下具有较高活性的低温蛋白酶及其生产方法。
本发明所提供的低温蛋白酶，是通过发酵培养与假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC № 1021在DNA杂交中显示70％以上同源性的菌株得到的；优选为发酵培养假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC № 1021得到的。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC № 1021所产的低温蛋白酶分子量为41000道尔顿，作用温度范围为10-50℃，作用pH为5-9；该低温蛋白酶的最适酶活温度为30℃，最适pH为8；该低温蛋白酶的最大酶活为29U/ml，在40℃时的半衰期为30min，在40℃下保温10min，残留酶活为最大酶活的75％；该低温蛋白酶对pH变化不明显。
一种生产低温蛋白酶的方法，是发酵培养与假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC № 1021在DNA杂交中显示70％以上同源性的菌株，并自其发酵液中获得低温蛋白酶；优选为发酵培养假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021，并自其发酵液中获得低温蛋白酶。
生产本发明的低温蛋白酶的培养基，可广泛使用包括碳源、氮源和无机盐在内的通常用于培养细菌，特别是用于培养假单胞菌的培养基，培养条件通常为培养温度15-35℃，pH6-9，培养时间10-72小时，优选为培养温度20℃，pH7，培养时间36小时。由此产生的蛋白酶分泌在发酵液中，通过分离、精制等常规获得酶的方法，从上述的培养液中收集低温蛋白酶，即通过离心或过滤法获得发酵上清液，通过盐析、柱层析等方法纯化酶制品。
本发明的低温蛋白酶稳定性较好，适合用于洗涤剂、饲料、皮革、食品加工等工业。如果用本发明的低温蛋白酶代替洗衣粉中的中温蛋白酶，可以提高洗涤效率，节省酶用量，具有广阔的工业前景。
图1为C15-3菌株产生的低温蛋白酶的反应温度和相对活性的关系曲线图2为C15-3菌株产生的低温蛋白酶的反应pH和相对活性的关系曲线图3为C15-3菌株产生的低温蛋白酶的热稳定性曲线图4为C15-3菌株产生的低温蛋白酶的pH稳定性曲线具体实施方式
实施例1、假单胞菌C15-3(Pseudomonas sp.C15-3)的分离筛选及鉴定(1)假单胞菌C15-3(Pseudomonas sp.C15-3)的分离筛选将采自我国东海的深海沉积泥样2克放在50毫升含玻璃珠的无菌生理盐水中，振荡打散，取上清液用无菌生理盐水稀释后涂筛选培养基平板，10℃下培养3天左右，观察结果，形成透明圈者为产酶菌株；将筛得到的菌株接种液体培养基，18℃振荡培养36小时，测定发酵液的蛋白酶活力，筛选出酶最适反应温度在40度以下的低温蛋白酶产生菌株C15-3。菌种筛选培养基(g/L)蛋白胨，10；酵母提取物，5；NaCl，10；K2HPO4，1；CaCl2，0.7；MgSO4，0.2；脱脂奶粉，5；pH7.0-7.2。
(2)假单胞菌C15-3(Pseudomonas sp.C15-3)的分类鉴定使用细菌常用鉴定方法进行菌株特性测定(东秀珠等，常见细菌系统鉴定方法，北京科学出版社，2001)。该菌株的生理生化特性及形态特征如下最适生长温度为20℃，最高生长温度为35℃；菌落为圆形，光滑，乳黄色，稍粘；细胞为杆状，革兰氏阴性菌；生长pH值范围是6.0-9.0，最适7.5；温度范围10-35℃，最适20℃；菌株C15-3氧化酶试验、触酶试验、脲酶试验阳性，能还原硝酸盐，可以在胞内积聚PHB。氧化分解碳水化合物。不产生吲哚和H2S。水解酪蛋白、明胶。16S rDNA序列相似性最相近的菌株为假单胞菌(Pseudomonastrivialis)；基于上述结果，菌株C15-3是假单胞菌(Pseudomonas)属的一个成员，命名为假单胞菌属C15-3菌株(Pseudomonas sp.C15-3)。
实施例2、低温蛋白酶的制备、纯化及其特性(1)低温蛋白酶的制备于250ml三角烧瓶中，加入100ml液体发酵培养基，2％(v/v)接种量接入假单胞菌C15-3(Pseudomonas sp.C15-3)，置20℃、220rpm旋转摇床振荡培养48小时。以稀释的培养液在600nm下的OD值测定菌体的生长，并测定酶活力。产酶发酵培养基(g/L)蛋白胨，10；酵母提取物，5；NaCl，10；K2HPO4，1；CaCl2，0.7；MgSO4，0.2；脱脂奶粉，5；pH7.0-7.2。
(2)低温蛋白酶的纯化①粗酶液的制备1升发酵液于5000g，4℃条件下离心15分钟，弃掉沉淀，上清液中加入硫酸铵使其达到80％的饱和度，不断搅拌在4℃过夜，然后，12000g的条件下离心20分钟。弃掉上清，沉淀溶于缓冲液A中(50mM K2HPO4-KH2PO4，pH 7.0)，并在缓冲液A中透析4小时，用于进一步的酶纯化过程。
②DEAE-纤维素层析透析过的酶液被加到预先用缓冲液A平衡好的DEAE-纤维素柱(2.5×50cm)，然后用500ml 0.2-1M的线性NaCl梯度洗脱DEAE-纤维素柱，以5ml每管收集流出液。合并活性部分，然后用蔗糖浓缩。
③Bio-Gel P150柱层析浓缩酶液加至预先用缓冲液A平衡过的Bio-Gel P150层析柱(1.5cm×100cm)上，用平衡缓冲液洗脱并分部收集，流速12ml/h。
粗酶液经盐析，DEAE柱层析，分子筛柱层析后，比活力由原来的50.6U/mg提高到635.2U/mg，纯化了12.6倍。
(3)低温蛋白酶的特性利用已知的蛋白质化学标准方法测定该低温蛋白酶的基本特性；酶活力测定方法为使用酪蛋白为底物进行蛋白酶活性测定[张树政.酶制剂工业.北京科学出版社，1984，387-449]，酶活力为在一定温度下，每分钟催化酪蛋白水解生成1毫克酪氨酸的酶量为1个活力单位(U)。
①最适酶活温度在底物酪蛋白浓度为2％，pH8.0下，测定C15-3所产蛋白酶在10-50℃范围内不同温度下的酶活。结果如图1所示，表明该低温蛋白酶的最适酶活温度为30℃。
②最适pH用pH5.0至pH10.0的不同的缓冲液稀释酶液，分别加入相应pH的2％的酪蛋白，在30℃下测定酶活力，结果如图2所示，表明C15-3所产的低温蛋白酶在pH8时的酶活最高。
③热稳定性将酶液加到磷酸盐缓冲液(50mM K2HPO4-KH2PO4，pH 7)中，并在不同温度的恒温水浴中保温，在不同的时间取样，然后按照标准的酶活测定方法测定酶活。温度对酶稳定性的影响表示为在一定时间后残存酶活所占原来酶活的百分比，C15-3所产低温蛋白酶的热稳定曲线如图3所示，表明该低温蛋白酶在40℃时的半衰期为30min，在40℃下保温10min，残留酶活为最大酶活的75％。
④pH稳定性将酶液加到不同pH的缓冲液中，并在30℃的恒温水浴中保温，在不同的时间取样，然后按照标准的酶活测定方法测定酶活。pH对酶稳定性的影响表示为在一定时间后残存酶活所占原来酶活的百分比，C15-3所产低温蛋白酶的pH稳定性如图4所示，表明C15-3所产的低温蛋白酶对pH变化不明显。
权利要求
1.一种假单胞菌，是假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021或与假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021在DNA杂交中显示70％以上同源性的菌株。
2.根据权利要求1所述的假单胞菌，其特征在于所述菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021。
3.一种低温蛋白酶，是通过发酵培养假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC№1021或与假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021在DNA杂交中显示70％以上同源性的菌株得到的。
4.根据权利要求3所述的低温蛋白酶，其特征在于所述菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021。
5.根据权利要求3所述的低温蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶的分子量为41000道尔顿，作用温度范围为10-50℃，作用pH为5-9。
6.一种生产低温蛋白酶的方法，是发酵培养假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3CGMCC №1021或与假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021在DNA杂交中显示70％以上同源性的菌株，并自其发酵液中获得低温蛋白酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)C15-3 CGMCC №1021。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021的发酵培养条件为培养温度15-35℃，pH6-9，培养时间10-72小时。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述发酵培养条件为培养温度20℃，pH7，培养时间36小时。
10.假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15-3 CGMCC №1021在生产低温蛋白酶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种低温蛋白酶及其生产方法与生产专用菌株，目的是提供一种能够在低温条件下产生低温蛋白酶的菌株，用该菌株生产得到的低温蛋白酶及其生产方法。能够产生低温蛋白酶的菌株可以是假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15－3CGMCC№1021或与假单胞菌(Pseudomonas sp.)C15－3 CGMCC №1021在DNA杂交中显示70％以上同源性的菌株。本发明的低温蛋白酶作用温度低、稳定性较好，适合用于洗涤剂、饲料、皮革、食品加工等工业。
文档编号C12N9/52GK1611596SQ200310103398
公开日2005年5月4日 申请日期2003年10月30日 优先权日2003年10月30日
发明者马延和, 薛燕芬, 张云华, 谢华, 曾艳, 周培谨 申请人:中国科学院微生物研究所