专利名称：猪瘟病毒感染性cDNA及其构建方法
技术领域：
本发明涉及猪瘟病毒感染性cDNA及其构建方法，特别是适合猪瘟病毒疫苗开发的猪瘟病毒感染性cDNA及其构建方法。
背景技术：
猪瘟是严重危害养猪业的重要传染病之一，被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病。猪瘟病毒的感染，可导致各生长阶段猪的死亡，这不仅会造成巨大的经济损失，而且也阻碍了我国猪肉制品走向国际市场。猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒，其基因组为长约12.3kb的单股正链RNA，编码4个结构蛋白和7个非结构蛋白。猪瘟病毒与宿主细胞的相互关系比较复杂，对其致病机理的研究进展缓慢。感染性cDNA是指通过RT-PCR(反转录-聚合酶链式扩增反应)扩增RNA病毒基因组的cDNA片段，然后利用其限制性酶切位点，将cDNA片段顺次相连并克隆于合适的载体，获得基因组全长cDNA克隆，以其转染适宜宿主细胞，全长cDNA在细胞内转录并包装成感染性病毒粒子。感染性cDNA是研究病毒的复制、病毒的基因产物的功能和阐明病毒致病机理等方面极具价值的工具。如通过对病毒基因组进行定点突变以产生特定的突变体病毒，也可以缺失或替换基因组的任意部分以产生突变体在分子水平上直接特定的病毒基因对病毒的复制、毒力和免疫等生物学功能。另外，从cDNA得到的感染性转录体，也将为研究病毒适应细胞及其致弱的分子基础提供帮助，借此可以制造有效的弱毒疫苗而无毒力反强的危险，为研制新型的基因工程苗提供新的思路。虽然目前国外已经报道有数个感染性cDNA构建成功(Moormann RJM et al.，J. Virol.70763-770，1996；Meyers G etal.，J.Virol.701588-1595，1996；Ruggli N et al.，J.Virol.703478-3487，1996)，并用于研究病毒单个蛋白的功能，取得了一些可喜的进展，但是，由于基因功能、致病机理、遗传变异的复杂性，这些感染性cDNA并不适合我国猪瘟病毒疫苗的开发。
发明内容
本发明的目的在于建立一个适合我国猪瘟病毒情况的猪瘟病毒的基因操作技术平台，加快我国猪瘟的研究和防制步伐，深入的开展猪瘟病毒的基因功能、致病机理、遗传变异和新型疫苗的研制等方面的研究。
为了达到上述目的，实施以下技术方案一种猪瘟病毒cDNA，是以猪瘟病毒RNA为模板，反转录合成的cDNA；该cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点。
所述限制性酶切位点可以是SrfI(购自德国Stratagene公司)酶切位点或Sal I酶切位点；所述5’端上游最好具有Not I酶切位点；所述RNA最好是从感染猪瘟病毒的兔脾组织中提取的C-株RNA一种构建猪瘟病毒感染性cDNA的方法，其步骤包括根据猪瘟病毒RNA设计反转录用带有酶切位点的特异性引物；以所述RNA为模板，反转录合成cDNA，同时，使cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点；利用PCR(聚合酶链式扩增反应)和nPCR(多巢聚合酶链式扩增反应)技术分段扩增所述cDNA各片段；将扩增后的cDNA各片段分别克隆入质粒载体；将所述cDNA各片段连接，构成带有基因组全长cDNA的质粒载体；纯化回收全长cDNA。
本发明的猪瘟病毒cDNA，因在5’端导入了Not I酶切位点和T7 RNA聚合酶启动子序列，3’末端具有单一的限制性酶切位点，能产生精确的3’末端，从而能够在分子水平上通过突变、插入、缺失和替换来研究猪瘟病毒的复制机理、毒力及其决定因素和致弱机制、致病机理、基因产物的功能、宿主嗜性以及核酸疫苗、标记疫苗等新型疫苗的研究开发，是进一步研究和防制猪瘟的极有价值的工具。
图1是表示覆盖基因组的7个cDNA片段；图2是表示构建全长cDNA的技术流程图。
具体实施例方式
实施例首先，根据猪瘟病毒RNA设计用于反转录的带有酶切位点的特异性引物，各引物如下P15’ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTATACGAGGTTAGTTCATTCTC3’1-23N1’5’CTAGTCGACTTTACTCCTTCCACCACGATC3’998-1018N15’AGGTACATAGCATGCTGGATACC3’1218-1240P25’ATGAGAAGGACAGCAGAACTAGGCC3’961-985P2’5’ACAGCAGAACTAGGCCACCTGA3’970-991N2’5’ATGTCGACGCCCAATCTTTCATCTGATGCATGC3’3236-3260N25’CTTTAGGTCTGCATGGCATAGGG3’3260-3282P35’TAACACGACTGTCAAGGTGCATGCAT3’3218-3243P3’5’TCAAGGTGCATGCATCAGATG3’3229-3249N3’5’TAGTCGACACATAACACCTAGCTCCTTCC3’5471-5491N35’ATGGCTCCTTTAGTCCCTGATATGT3’5512-5536P45’TACACACACCAAGGTGGCATCAGTT3’5313-5337P4’5’ATCAGTTCAGTGGACCATGTC3’5331-5351N4’5’ATGTCGACGTAACACCTGATTCTATCGCG3’6497-6517N45’CAATCGTGACAGCCATTCTCTTCAG3’6609-6633P55’AGAGTACTTGGACATTGCTGG3’6287-6307P5’5’ATGCGGCCGCGGCAGTGGAGACAGCAAAGAAATTG3’6371-6395N5’5’GTAACCGTAGCAGCGGGAATCTCTT3’9094-9118N55’TTAGTCCCTGGATATTGGCCT3’9377-9388P65’CTCAAAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’8997-9021P6’5’ATTAGCGGCCGCAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’9002-9021N6’5’CTTCTCATTCTTTGGGATCGC3’10692-10712N65’TCGTTGACGTCCCTCTTCTCATTCT3’10702-10726P75’AACTGGAGAGAGGAATAAACAGG3’10546-10568P7’5’TAGCGGCCGCATAAACAGGAAGGGTGCTGCT3’
10560-10580N75’ATGTCGACGCCCGGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTCC3’12286-12310。
其中，P表示正向，N表示反向，各引物后的数字表示酶切位置。
从感染猪瘟病毒的兔脾组织(猪瘟C-株毒，为中国兽药监察所的兔脾淋组织毒第480代，系中国农科院兰州兽医研究所保存)中提取猪瘟病毒(C-株)基因组RNA(使用TRIzol(R)Reagent Total RNA Isolation Reagent试剂盒，GIBCOBRL公司出品)，用上述特异性引物分7段反转录cDNA各片段。然后，利用PCR和nPCR技术分7段扩增cDNA各片段，如图1所示，5’端至3’端依次分别命名为F1、F2……F7，其中各片段在基因组中的位置为F11-1028，F2970-3260，F33229-5491，F45497-6633，F56371-9118，F69002-10712，F710530-12310。如图2所示，利用图1所示的工具酶分别将所得片段克隆入质粒pMD18-T(购自Taraka公司)或pGEM-T Easy(购自Promega公司)载体中并测序，其中F3和F4克隆入质粒pMD18-T，形成质粒pMD1 8-T/F34；再采用图2所示的限制性内切酶(购自Promega和Taraka公司)和T4 DNA连接酶(购自上海生工公司)，将F1、F2、F 34片段连接并克隆于pGEM-5Zf(+)后，得到重组质粒pGEM-5ZF(+)/F1-4；将片段F5、F6和F7连接并克隆于pGEM-5ZF(+)中，得到重组质粒pGEM-5Zf(+)/F5-7；最后将连接片段F1-4和F5-7连接并克隆于pGEM-5Zf(+)中，得到基因组全长cDNA pGEM-5Zf(+)/F1-7，经测序验证正确。
用限制性内切酶SrfI将全长cDNA pGEM-5Zf(+)/F1-7线性化(即将环形质粒用酶切开，成为线形)，并用低熔点琼脂糖凝胶回收；用MEGAscript T7kit(购自Ambion Inc公司)体外转录，并用RNA电泳分析转录出的全长基因组RNA占的比例大小。用无RNA酶的DNA核酸酶RQ1(购自Promega公司)去除DNA模板，经蛋白酶K(购自Taraka公司)处理后，进行RNA纯化(RNA纯化试剂盒，购自QIAGEN公司)，分成小份，置-70℃备用。转染时，先用OPTI-MEMI培养基(购自GIBCOBRL公司)清洗SK-6细胞(约70％融合度，兰州兽医研究所病毒室保存)，再用DMRIE-C(购自Invitrogen公司)进行转染；转染细胞传代数次后，采用直接荧光抗体染色(猪瘟荧光素标记抗体购自中国兽药监察所)和夹心ELISA(Classical Swine Fever Virus Antigen Test Kit，IDEXX)等方法鉴定其具有感染性。
权利要求
1.一种猪瘟病毒cDNA，是以猪瘟病毒RNA为模板，反转录合成的cDNA；该cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点。
2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒cDNA，其特征在于，所述限制性酶切位点是Srf I酶切位点或Sal I酶切位点。
3.根据权利要求1或2所述的猪瘟病毒感染性cDNA，其特征在于，所述5’端上游具有Not I酶切位点。
4.根据权利要求1或2所述的猪瘟病毒cDNA，其特征在于，所述RNA是从感染猪瘟病毒的兔脾组织中提取的C-株RNA。
5.一种构建猪瘟病毒cDNA的方法，其步骤包括1)根据猪瘟病毒RNA设计反转录用带有酶切位点的特异性引物；2)以所述RNA为模板，反转录合成cDNA，同时，使cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点；3)利用PCR和nPCR技术分段扩增所述cDNA各片段；4)将扩增后的cDNA各片段分别克隆入质粒载体；5)将所述cDNA各片段连接，构成带有基因组全长cDNA的质粒载体；6)纯化回收全长cDNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述特异性引物及其酶切位置如下P15’ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTATACGAGGTTAGTTCATTCTC3’1-23N1’5’CTAGTCGACTTTACTCCTTCCACCACGATC3’998-1018N15’AGGTACATAGCATGCTGGATACC3’1218-1240P25’ATGAGAAGGACAGCAGAACTAGGCC3’961-985P2’5’ACAGCAGAACTAGGCCACCTGA3’970-991N2’5’ATGTCGACGCCCAATCTTTCATCTGATGCATGC3’3236-3260N25’CTTTAGGTCTGCATGGCATAGGG3’3260-3282P35’TAACACGACTGTCAAGGTGCATGCAT3’3218-3243P3’5’TCAAGGTGCATGCATCAGATG3’ 3229-3249N3’5’TAGTCGACACATAACACCTAGCTCCTTCC3’ 5471-5491N35’ATGGCTCCTTTAGTCCCTGATATGT3’ 5512-5536P45’TACACACACCAAGGTGGCATCAGTT3’ 5313-5337P4’5’ATCAGTTCAGTGGACCATGTC3’ 5331-5351N4’5’ATGTCGACGTAACACCTGATTCTATCGCG3’ 6497-6517N45’CAATCGTGACAGCCATTCTCTTCAG3’ 6609-6633P55’AGAGTACTTGGACATTGCTGG3’ 6287-6307P5’5’ATGCGGCCGCGGCAGTGGAGACAGCAAAGAAATTG3’6371-6395N5’5’GTAACCGTAGCAGCGGGAATCTCTT3’ 9094-9118N55’TTAGTCCCTGGATATTGGCCT3’ 9377-9388P65’CTCAAAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’ 8997-9021P6’5’ATTAGCGGCCGCAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’ 9002-9021N6’5’CTTCTCATTCTTTGGGATCGC3’ 10692-10712N65’TCGTTGACGTCCCTCTTCTCATTCT3’ 10702-10726P75’AACTGGAGAGAGGAATAAACAGG3’ 10546-10568P7’5’TAGCGGCCGCATAAACAGGAAGGGTGCTGCT3’ 10560-10580N7 5’ATGTCGACGCCCGGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTCC3’12286-12310；其中，P表示正向，N表示反向。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分段扩增是分成7个片段进行扩增的，其中各片段的位置依次为1-1028、970-3260、3229-5491、5497-6633、6371-9118、9002-10712、10530-12310。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纯化回收全长cDNA是采用限制性内切酶Srf I将带有全长cDNA的质粒载体线性化，并用低熔点琼脂糖凝胶回收。
9.根据权利要求5～7之一所述的方法，其特征在于，所述质粒载体采用pGEM-5Zf(+)。
10.根据权利要求5～7之一所述的方法，其特征在于，所述RNA是从感染猪瘟病毒的兔脾组织中提取的C-株RNA。
全文摘要
本发明的目的在于建立一个适合我国猪瘟病毒情况的猪瘟病毒的基因操作技术平台。为了达到该目的，本发明的猪瘟病毒cDNA，是以猪瘟病毒RNA为模板，反转录合成的cDNA；该cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点。构建猪瘟病毒感染性cDNA的方法步骤包括根据猪瘟病毒RNA设计反转录用带有酶切位点的特异性引物；以所述RNA为模板，反转录合成cDNA；分段扩增所述cDNA各片段；将扩增后的cDNA各片段分别克隆入质粒载体；将所述cDNA各片段连接，构成带有基因组全长cDNA的质粒载体；纯化回收全长cDNA。
文档编号C12N15/34GK1539976SQ20031010341
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月31日 优先权日2003年10月31日
发明者刘湘涛, 胡建和, 谢庆阁, 尚佑军 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所