专利名称：制备对映体纯对羟基苯甘氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备对映体纯对羟基苯甘氨酸的新方法。
背景技术：
对映体纯对羟基苯甘氨酸是半合成β-内酰胺抗生素的重要侧链，用于合成羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄、头孢哌酮、头孢罗奇以及头孢羟胺唑等。目前对映体纯对羟基苯甘氨酸的生产国内外大都采用如下两种方法一种是用对氧基苯甲酸法、对羟基苯甲醛法或乙醛酸法合成外消旋对羟基苯甘氨酸，然后对外消旋体进行拆分；其中外消旋体的合成工艺成熟，外消旋体的拆分为技术难度大的关键步骤。迄今，拆分对羟基苯甘氨酸的方法有化学法、诱导结晶法和酶法，其中化学法和结晶法有步骤多，成本高、收率低等弊端，酶法因其反应条件温和、高效、高选择性及成本低而颇受青睐；另一种方法是用海因酶催化对羟基苯海因开环水解成N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸，后者经亚硝酸水解成相应的对映体纯对羟基苯甘氨酸。该法已被广泛采用，所用的酶价格昂贵，且亚硝酸的使用带来较严重的环境污染问题。因此，研究开发对羟基苯甘氨酸拆分新工艺具有重大的实践意义。
近年来，离子液替代易造成环境污染的有机溶剂作为新兴的绿色反应介质已成为研究的热点。离子液具有可忽略的蒸气压、高稳定性，可溶解许多极性或非极性的有机、无机化合物，易于与其它物质分离，可循环利用等优良特性。研究结果表明，许多酶如蛋白酶、脂肪酶在离子液中具有较高的催化活性、选择性及稳定性(Trends Biotechnol.2003，21131-138)。因此，离子液作为反应介质用于有机合成、生物催化与生物合成等领域中有着广泛的应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术工艺存在的问题，提供一种离子液中酶促对羟基苯甘氨酸酯不对称水解的方法，利用木瓜蛋白酶催化对羟基苯甘氨酸甲酯的高效不对称水解制备高对映体纯度的对羟基苯甘氨酸，该方法使用离子液1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(BMIM·BF4，可与水相混溶)和磷酸缓冲液的混合体系作反应介质，对环境污染小，易从反应混合体系中方便地分离出产物。由于离子液具有可忽略的蒸气压，在减压的条件下进行水解反应，可在线分离出副产物甲醇，提高对羟基苯甘氨酸的产率和对映体纯度。
本发明的制备对映体纯对羟基苯甘氨酸的方法，包括如下步骤(1)在反应器中依次加入离子液BMIM·BF4、磷酸缓冲液(pH7.0，50mmol/L)、对羟基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；离子液在混合体系中的含量为0-40％，底物对羟基苯甘氨酸甲酯浓度为50-500mmol/L，酶量为120-840Units；(2)在温度为25-60℃、振荡速度为130-220rev./min、常压-0.04MPa下反应22-36小时后，超滤除掉反应混合物中的悬浮颗粒和酶，分离得到产物L-对羟基苯甘氨酸。
本发明的较佳方案包括如下步骤(1)在反应器中依次加入离子液BMIM·BF4、磷酸缓冲液(pH7.0，50mmol/L)、对羟基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；离子液在混合体系中的含量为0-20％，底物对羟基苯甘氨酸甲酯浓度为100-400mmol/L，酶量为360-840Units；(2)在温度为40-60℃、振荡速度为160-200rev./min、常压-0.6MPa)下反应24-32小时后，超滤除掉反应混合物中的悬浮颗粒和酶，分离得到产物L-对羟基苯甘氨酸。
最佳方案是将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在减压条件下(压力约0.04MPa)，置于45℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h。分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率高达49.8％，对映体纯度高达98％。
所述分离产物L-对羟基苯甘氨酸的方法可以是常规的分离方法。发明人经过探索性试验，提供的分离产物L-对羟基苯甘氨酸的方法包括如下步骤——加入乙酸乙酯，萃取残留的未反应的D-对羟基苯甘氨酸甲酯，真空蒸馏，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-对羟基苯甘氨酸；——加入浓盐酸(8.0mol/L)于离子液/水混合体系中，pH值降至2.0左右，振荡数分钟后，产物L-对羟基苯甘氨酸沉淀下来，过滤、干燥，就可获得对映体纯对羟基苯甘氨酸。
本发明与现有技术相比具有如下优点反应条件温和、环境污染小、反应过程简单易控、产物易分离；反应体系中木瓜蛋白酶的催化活性、对映体选择性及稳定性均很高；在减压条件下，L-对羟基苯甘氨酸的产率49％以上，对映体纯度98％以上。
具体实施例方式
实施例1将4ml含0％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.4mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，加入乙酸乙酯，萃取残留的未反应的D-对羟基苯甘氨酸甲酯，真空蒸馏，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-对羟基苯甘氨酸；加入浓盐酸(8.0mol/L)于离子液/水混合体系中，pH值降至2.0左右，振荡数分钟后，产物L-对羟基苯甘氨酸沉淀，过滤、干燥获得对映体纯对羟基苯甘氨酸的产率38.5％，对映体纯度95％。
实施例2将4ml含10％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.4mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，获得L-对羟基苯甘氨酸的产率44.7％，对映体纯度95.1％。
实施例3将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.4mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率47.2％，对映体纯度95.7％。
实施例4将4ml含15％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.4mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率45.7％，对映体纯度92.9％。
实施例5将4ml含20％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入1.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和700mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，压力为0.6MPa下，置于60℃、200rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应32h后，加入乙酸乙酯，萃取残留的未反应的D-对羟基苯甘氨酸甲酯，真空蒸馏，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-对羟基苯甘氨酸；加入浓盐酸(8.0mol/L)于离子液/水混合体系中，pH值降至2.0左右，振荡数分钟后，产物L-对羟基苯甘氨酸沉淀下来，过滤、干燥获得对映体纯对羟基苯甘氨酸的产率43.8％，对映体纯度92.4％。
实施例6将4ml含40％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，在常压下，然后加入0.4mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率18.6％，对映体纯度56.3％。
实施例7将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.2mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应32h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率46.5％，对映体纯度95.3％。
实施例8将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率47.9％，对映体纯度96.2％。
实施例9将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.8mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应30h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率45％，对映体纯度93.6％。
实施例10将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入2.0mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应36h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率17.3％，对映体纯度80.2％。
实施例11将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和100mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率18.4％，对映体纯度96.3％。
实施例12将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率47.9％，对映体纯度96.6％。
实施例13将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和700mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率48.1％，对映体纯度96.1％。
实施例14将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于25℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应36h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率47.5％，对映体纯度95.6％。
实施例15将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于45℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率48.4％，对映体纯度96.9％。
实施例16将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于60℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应22h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率35.2％，对映体纯度83.3％。
实施例17将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、130rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率45.0％，对映体纯度95.4％。
实施例18将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常压下，置于40℃、220rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率47.3％，对映体纯度96.4％。
实施例19将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在减压条件下(压力约0.04MPa)，置于45℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸的产率49.8％，对映体纯度98％。
权利要求
1.一种制备对映体纯对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤(1)在反应器中依次加入离子液BMIM·BF4、磷酸缓冲液(pH7.0，50mmol/L)、对羟基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；离子液在混合体系中的含量为0-40％，底物对羟基苯甘氨酸甲酯浓度为50-500mmol/L，酶量为120-840Units；(2)在温度为25-60℃、振荡速度为130-220rev./min、常压-0.04MPa下反应22-36小时后，超滤除掉反应混合物中的悬浮颗粒和酶，分离得到产物L-对羟基苯甘氨酸。
2.根据权利要求1所述的制备对映体纯对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤(1)在反应器中依次加入离子液BMIM·BF4、磷酸缓冲液(pH7.0，50mmol/L)、对羟基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；离子液在混合体系中的含量为0-20％，底物对羟基苯甘氨酸甲酯浓度为100-400mmol/L，酶量为360-840Units；(2)在温度为40-60℃、振荡速度为160-200rev./min、常压-0.6MPa)下反应24-32小时后，超滤除掉反应混合物中的悬浮颗粒和酶，分离得到产物L-对羟基苯甘氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的制备对映体纯对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于分离产物L-对羟基苯甘氨酸的方法包括如下步骤——加入乙酸乙酯，萃取残留的未反应的D-对羟基苯甘氨酸甲酯，真空蒸馏，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-对羟基苯甘氨酸；——加入浓盐酸(8.0mol/L)于离子液/水混合体系中，pH值降至2.0左右，振荡数分钟后，产物L-对羟基苯甘氨酸沉淀下来，过滤、干燥就可获得对映体纯对羟基苯甘氨酸。
4.根据权利要求4所述的制备对映体纯对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于将4ml含12.5％(v/v)离子液BMIM·BF4/磷酸缓冲液(50mmol/L，pH7.0)混合体系装入具塞的三角瓶中混合均匀，然后加入0.6mmol对羟基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在减压条件下(压力约0.04MPa)，置于45℃、160rev./min的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，分离获得L-对羟基苯甘氨酸。
全文摘要
本发明涉及一种制备对映体纯对羟基苯甘氨酸的方法，包括在反应器中依次加入离子液BMIM·BF
文档编号C12P13/04GK1693471SQ20041005191
公开日2005年11月9日 申请日期2004年10月25日 优先权日2004年10月25日
发明者宗敏华, 娄文勇, 许若 申请人:华南理工大学