专利名称：一种生物工程法生产谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明涉及用L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸为底物，用CGMCC1231微生物菌株，发酵生产谷胱甘肽合成酶I(GSH-I)和谷胱甘肽合成酶II(GSH-II)进行生物催化反应合成谷胱甘肽的一种生物工程法生产谷胱甘肽的方法。
谷胱甘肽是一种具有重要生物功能的活性三肽。有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种型式，在生物体内起主要作用的是还原型谷胱甘肽。谷胱甘肽，Glutathione，是一种重要的生化药物和食品添加剂，具有多方面重要的生物功能。是人体代谢酶甘油醛磷酸脱氢酶、乙二醛酶及磷酸丙糖脱氢酶的辅酶，参与体内三羧酸循环及糖代谢，使人体获得高能量，并能激活各种酶。如体内的巯基酶、胆碱脂酶等，从而促进糖、脂肪及蛋白质代谢，并在体内γ-谷氨酰基循环中提供谷氨酰基，维持细胞的正常代谢与细胞膜的完整性，也能与亲电子基、氧自由基等毒性物质结合，具有广泛的抗氧化作用。人体中谷胱甘肽的数量增加后，对抗老化、心血管、消化系统、中毒、传染病和免疫力、癌症、呼吸系统和新陈代谢都有帮助。在临床上谷胱甘肽用于中毒性肝炎和感染性肝炎的治疗；抑制白内障以及角膜与视网膜疾病的改善；有机物及重金属的解毒；癌症辐射和化疗的保护；对肾衰、尿毒症、糖尿病并发症、神经病变、外科手术后恢复、肿瘤和艾滋病也是有效的联合用药。
谷胱甘肽还是一种重要的生物抗氧化剂。在食品加工业中，谷胱甘肽不仅可在肉制品、奶制品、面制品、婴儿食品等方面起着抗氧化、强化氨基酸、增强食品风味、提高食品质量等重要作用。更为重要的是谷胱甘肽是制备功能性食品的理想添加剂。在发达国家，被认为是21世纪最有希望的保健食品之一，被称为长寿因子和抗衰老因子。
多年来，谷胱甘肽的需求主要依赖进口。尤其在发达国家，谷胱甘肽除用于医药领域外，已作为生物活性添加剂，广泛应用于食品的加工领域，并实现产品化生产。随着我国医疗保健事业和食品加工业的发展，供需矛盾会非常突出。生物工程法生产谷胱甘肽更具有实际意义。
背景技术：
谷胱甘肽制备方法有以下几种1.萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有谷胱甘肽的动植物组织中进行谷胱甘肽的分离提取。
2.化学合成法生产周期长，操作复杂，分离困难，成本高，并且存在着环境污染等问题。
3.发酵法国内未有产业化生产企业。
4.酶法本发明采用CGMCC1231微生物菌株，酶促反应合成生产谷胱甘肽。具有工艺简单、环境友好、生产周期短、反应温和、相对投资少，产品纯度高。
发明内容
本发明采用立体专一性的CGMCC1231菌株酶促反应合成谷胱甘肽，不要求对底物合成彻底，反应时间短，未合成的部份底物经过处理可以回用。
本发明所用的CGMCC1231菌株。目前可达到的水平为产酶发酵时间1～3天，酶促反应的一次转化率为25～40％，产品的提取收率为45～58％，谷胱甘肽的含量≥98％。
本发明的目的是提供一种高产的含有谷胱甘肽合成酶I(GSH-I)和谷胱甘肽合成酶II(GSH-II)的CGMCC1231微生物菌株，提供一种新的生物工程法生产谷胱甘肽的方法。所得到的酶促反应合成的谷胱甘肽，经提取精制后，谷胱甘肽的含量≥98％。
本发明通过下列方案来实现(1)本发明的方法采用发明人提供的亲株，再通过特定的诱变、筛选、优化、复筛出突变菌株，即能高产含谷胱甘肽合成酶I(GSH-I)和谷胱甘肽合成酶II(GSH-II)的微生物突变菌株。此菌株已于2004年10月11日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号CGMCC1231，作为酶源的菌株。
(2)菌株经斜面活化，发酵培养，用其湿菌体作为酶源。
(3)以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸作为酶促反应的底物。
(4)将(2)的酶源加入(3)的底物，并加入葡萄糖和硫酸镁进行酶促反应合成谷胱甘肽，经溶剂萃取、浓缩、脱色、精制制成谷胱甘肽。
菌种及其诱变从发明人实验室保藏的微生物菌株中，选择一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)E478C菌株。再对该菌株按常规方法进行紫外线、Co60诱变处理。即把菌株制成菌悬液置于培养皿中，在无菌和搅拌条件下以紫外灯30cm距离照射1～5分钟；浓菌液用Co60照射，照射剂量5～12万伦琴，时间为10～30分钟。照射后的菌液无菌操作接种于突变平板培养基培养3～7天后，转接于筛选平板培养基培养2～5天，挑选菌落进行优化，复筛出突变菌株。
经诱变获得的突变菌株菌落为矿烛色、大而厚、湿润黏稠、表面较光滑、容易挑起、边缘圆整；细胞呈卵圆形，其单倍体和双倍体都能以芽殖方式繁殖，有时长假菌丝；圆形子囊和子囊孢子；厌氧下发酵糖类会产生乙醇。并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)E6322.3C32.28菌株，与亲株相比，形态特征一致。但产菌量增加了25％，工艺条件可操作范围宽，适应性强，酶促反应稳定。该菌株已于2004年10月11日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号CGMCC1231。
产酶菌株的培养和发酵斜面培养配制含葡萄糖0.5～10％，牛肉膏0.5～5.0％，蛋白胨0.5～5％，琼脂1.5～2.0％，PH5～9，培养基各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，下同。110～121℃灭菌20～50分钟，灭菌后冷却，制成斜面，无菌操作接种，20～40℃培养3～7天。
产酶培养配制含葡萄糖0.1～10％、蛋白胨0.5～5％、牛肉膏0.5～5％、生物素0.01～0.05％，玉米浆0.5～5％、PH5～9，110～121℃灭菌20～50分钟，灭菌后冷却，无菌操作接种，接种量为5～10％，20～40℃，200～230r/min，培养1～3天。
谷胱甘肽酶促反应活力的测定取100mL发酵液，分离菌体，加入含4％葡萄糖的水溶液配制成L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸各0.02mol/L浓度的底物60mL，置摇床22～25℃，200rpm进行酶促反应30分钟，提取液用ALLOXAN试剂法检测谷胱甘肽含量。酶活力单位的定义在上述条件下，每分钟酶促反应合成谷胱甘肽1μmol量的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。
谷胱甘肽的ALLOXAN试剂法测定使用0.24mol/L ALLOXAN试剂；0.1mol/L甘氨酸溶液；0.24mol/L、PH7.6磷酸缓冲液与谷胱甘肽样品反应20分钟使谷胱甘肽衍生化，此时用紫外分光光度计于305nm处测定吸光度值。
酶促合成培养后的菌体作为酶源，以L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物，底物浓度各为0.01～1mol/L，葡萄糖浓度为2～15％，硫酸镁0.02～0.1％，湿菌体为5～20％，酶促反应温度为20～40℃，酶促反应合成时间为3～24小时。在此条件下所得的含谷胱甘肽的提取液用ALLOXAN试剂法测定表明，酶促反应合成的主要成份为谷胱甘肽。
谷胱甘肽的提取及纯化酶促反应合成提取液，主要成份为谷胱甘肽，含有未转化的氨基酸底物，还含有一些无机盐杂质及色素，可先用适当的溶剂萃取除去未转化的氨基酸底物，分离出已转化的谷胱甘肽，再用适当溶剂萃取提取，并进行脱盐及脱色处理或重结晶方法来加以精制，从而得到高纯度、高质量的谷胱甘肽产品。
本发明的主要优点是选育一种能高产含有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I)和谷胱甘肽合成酶(GSH-II)的CGMCC1231菌株，提供一种工艺简单的生物工程法生产谷胱甘肽的方法。所得到的酶促合成产物谷胱甘肽，经提取精制后，谷胱甘肽的含量≥98％。
本发明的工艺流程示意图见说明书附图。
具体实施例方式
下面的实施例对本发明作详细说明实施例1斜面培养培养基为牛肉膏10g、蛋白胨10g、葡萄糖5g、琼脂20g、加水至1000ml、PH6.5、121℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，无菌操作接入菌种CGMCC1231，25℃培养5天，作为斜面活化种子。
产酶培养培养基为0.3％葡萄糖、1.0％蛋白胨、0.5％牛肉膏、生物素0.02％、0.5％玉米浆、PH6.5，装液量为250mL的三角瓶装液50mL，121℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，无菌操作接入斜面种子，置摇床28℃，200～230r/min培养1～3天，离心得到湿菌体。
实施例2酶促反应液用含有0.02mol/L甘氨酸、0.02mol/LL-谷氨酸、0.02mol/LL-半胱氨酸、4％葡萄糖，硫酸镁0.1％。反应液中按100g/L，加入按实施例1方法制备的湿菌体，22～25℃置摇床，200～230r/min，按时取样，用ALLOXAN试剂法测量酶促合成谷胱甘肽含量，酶促反应合成时间为3～24小时。如此反复重复3次，得到酶促合成结果见表2，表2结果表明，3～72小时酶促反应合成后，得到的平均转化率为30.5％。经萃取后得到粗品谷胱甘肽含量≥90％。
表2 反复分批酶转化的结果
实施例3按实施例2的方法，配制酶促反应液，加按实施例1的方法制备湿菌体，按实施例2的方法酶促合成反应所得的100mL谷胱甘肽含量0.09mol/L的浓缩液，用体积比为1∶2～4的乙醇萃取，分离萃取相，蒸发回收乙醇，得到谷胱甘肽粗品1.77g，用ALLOXAN试剂法检测谷胱甘肽含量≥90％，提取率为58％。粗品用乙醇提取、脱色、冷冻结晶、真空干燥，得到白色晶状粉末谷胱甘肽的纯品1.36克，精制的收率为85％，谷胱甘肽含量≥98％。
实施例4按实施例1方法，用15L的发酵罐发酵产酶，按实施例2的方法，配制酶促反应液，置15L罐进行酶促反应，按实施例3方法进行产物提取，结果为酶活达到1.02U/g干菌体，酶促反应转化率为35％，粗品谷胱甘肽含量≥90％。，提取率为56％。
权利要求
1.一种含有谷胱甘肽合成酶I(GSH-I)和谷胱甘肽合成酶II(GSH-II)的微生物突变菌株，它是CGMCC1231菌株。
2.一种生物工程法生产谷胱甘肽的方法，包括(1)将权利要求书1所述的菌株，进行常规培养，发酵，获得湿菌体作为酶源；(2)以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸作为酶促反应的底物；(3)将(1)的湿菌体加入到(2)的底物酶促反应合成谷胱甘肽。
3.根据权利要求书2所述的方法，其特征在于步骤(3)中的底物浓度各为0.01～1mol/L，葡萄糖2～15％，硫酸镁0.02～0.1％，加入湿菌体为5～20％，酶促反应的温度为20～40℃，酶促反应合成时间为3～24小时。
4.根据权利要求书2所述的方法，其特征在于产酶发酵培养的培养基为葡萄糖0.1～10％，蛋白胨0.5～5.0％，生物素0.01～0.05％，玉米浆0.5～5.0％，牛肉膏0.5～5％，PH5～9，温度20～40℃，培养1～3天。
全文摘要
本发明涉及一种生物工程法生产谷胱H肽的方法，该方法采用发明人筛选的亲株并通过特定的诱变筛选优化复筛出突变菌株，能高产含谷胱甘肽合成酶I(GSH－I)和谷胱甘肽合成酶II(GSH－II)的CGMCC1231微生物菌株为酶源，以L－谷氨酸、L－半胱氨酸、甘氨酸为底物，并加入葡萄糖和硫酸镁，酶促合成生产谷胱甘肽；酶促反应的一次转化率为25～40％，分离纯化的产品收率为45～58％，谷胱甘肽含量≥98％。
文档编号C12P21/02GK1760359SQ20041007936
公开日2006年4月19日 申请日期2004年10月17日 优先权日2004年10月17日
发明者王旻, 刘景晶, 吴梧桐, 许激扬 申请人:肖强, 杨群伟, 肖敏君