抗体疫苗缀合物及其用途的制作方法

专利名称：抗体疫苗缀合物及其用途的制作方法
相关申请本申请要求2003年1月31日申请的美国临时专利申请第60/443,979号的优先权。上述申请的全部内容通过引用结合到本文中。
背景技术：
免疫应答起始于专职抗原呈递细胞(APC)水平，此类细胞包括存在于机体组织中的树突细胞(DC)和巨噬细胞(Mg)。DC表达高水平的细胞表面分子和与T淋巴细胞相互作用的补体受体，从而诱导有效的免疫应答。DC也分泌细胞因子、趋化因子和蛋白酶，这些物质启动免疫应答并使细胞和体液两种免疫的扩增达到顶点。
DC在其表面表达结合抗原片段的主要组织相容性复合体(MHC)分子。表达识别这类抗原-MHC复合体的T细胞受体(TCR)的T细胞成为活化的并启动免疫级联。一般而言，有两种类型的MHC分子，MHC I类和MHC II类分子。MHC I类分子将抗原呈递给特异性分化群(CD)8+T细胞，MHC II类分子将抗原呈递给特异性CD4+T细胞。
为有效治疗许多疾病，特别是癌，疫苗必须引发有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，亦称细胞毒性T细胞应答。细胞毒性T细胞主要包括在MHC I类情况下识别抗原的CD8+T细胞。与MHC I类分子有关的抗原加工明显与MHC II类分子的不同。外源性递送到APC的抗原主要与MHC II类分子一起加工。与此相对，由于MHC I类分子位于细胞内，内源性递送到APC的抗原主要与MHC I类分子一起加工。这不仅对APC成立，对所有表达MHC I类分子，并在它们的表面连续展示与MHC I类分子相关的内源产生的抗原的有核细胞也成立。
由于这个原因，当病毒或肿瘤抗原作为结合在MHC I类分子上的肽被展示时，表达独特蛋白的感染病毒的细胞或肿瘤细胞可被CTL靶向。然而，在特定条件下，DC也能使外源抗原进入内部区室结合到MHC I类分子上，致使它们经由MHC I类和II类两种途径呈递给T细胞。此过程称为交叉敏化或交叉呈递。
因此，尽管抗体介导应答已经证明对具体疾病的给人留下深刻印象的预防或治疗功效，但当针对具体分泌的或细胞表面抗原时，许多疾病的最有效免疫疗法看来都要求T细胞介导免疫应答，尤其是CTL应答。由于有效的CTL应答并不限于细胞外抗原，所以有可能开发不为有效抗体靶的基于抗原的治疗疫苗。因此，响应疾病相关抗原而发生的CTL新的产生方法具有重大意义，因为，一般认为这些细胞对许多疫苗是至关重要的，并对大多数治疗性癌疫苗是必不可少的。
至今，一种已经过测试的接种方法使用抗原肽进行免疫。此免疫方法绕过抗原摄取和加工的需求，并依赖所述肽直接结合到已经表达在APC表面的MHC I类分子的能力。尽管此方法已经清楚地显示出患者体内CTL诱导的证据，但是该方法有一些限制。所述抗原肽一定要预先建立，不同的肽要求具有不同MHC单元型的个体，并且肽在体内存活期短。
另一种已经过测试的接种方法使用抗体-抗原复合物。Paul等(62)表明，特异性针对所给抗原的抗体会增加小鼠针对所述抗原的体液免疫应答，大概通过将免疫复合物传递给表达在APC上的IgG的Fc受体(FcγR)。Wernersson及其同事(63)用免疫复合物研究个体FcγR在增强体内免疫应答中的作用。他们的研究证明FcγRI足以介导增强的免疫应答。然而，这类免疫复合物并不特异性靶向APC，虽然它们也在许多与抗原呈递无关细胞上结合Fc受体，由此降低抗原递送的效率。
后来的研究已经使用了将抗原选择性地靶向APC上的各种受体的抗体，并且已经证明这类选择性给予能够诱导体液应答(66，67)。此外，在MHC I类情况下，已经表明结合到DC上FcR上的免疫复合物被加工并呈递(64，65)。此外，许多这类FcR-靶向方法是受限制的，因为FcR被表达在许多非APC例如血小板和嗜中性白细胞上。理想条件下，特异性靶向APC并能够诱导有效MHC I类限制性CTL应答，以及诱导有效MHC II类-限制性TH应答的疫苗可在治疗某些疾病上提供增强的功效。
类似地，甘露糖基化抗原已经表现出诱导体液免疫应答和T细胞介导免疫应答，例如CTL应答。然而，甘露糖基化抗原不特异性靶向APC，原因在于其它甘露糖结合蛋白非常丰富。而且，甘露糖基化蛋白由未成熟DC通过大胞饮机制内化。因此，通过抗原的甘露糖基化产生的机制和免疫应答的性质与通过用抗体将抗原特异性靶向甘露糖受体所产生的截然不同。
由于现有方法并没有有效和特异地靶向APC，许多治疗用疫苗要求从患者中纯化DC，接触抗原后再回输给同一患者。
因此，存在能够有效靶向APC和产生抗原特异性T细胞介导免疫应答(包括抗原特异性CTL应答，其为有效治疗许多疾病所必需的)改进疫苗的需要。
发明概述本发明提供基于抗体的疫苗和产生有效治疗许多疾病所必需的抗原特异性T细胞介导免疫应答的方法。具体地说，有效抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答通过用结合到表达于APC的特定受体上的抗体，将一种或多种蛋白抗原靶向抗原呈递细胞(APC)来诱导。优选的受体包括C-凝集素，尤其是表达于树突细胞(DC)和巨噬细胞两者上的人甘露糖受体。如本发明的方法所证明，用抗体-抗原缀合物靶向甘露糖受体导致经由MHC I类和II类两种途径加工抗原。因此，抗原特异性CTL(例如CD8+T细胞)被诱导，其它重要的效应T细胞，包括辅助T细胞(例如CD4+T细胞)也被诱导。
因此，一方面，本发明通过形成抗原和结合到人APC上的单克隆抗体(例如结合到表达于人APC上的人甘露糖受体上的单克隆抗体)的缀合物，提供一种诱导或增强针对抗原的CTL应答的方法。然后，使缀合物在体内或活体外与APC接触，致使抗原以诱导或增强针对抗原的CTL应答(例如CD8+细胞毒性T细胞介导的应答)的方式被内化、加工并呈递给T细胞。在一个优选实施方案中，这也用来诱导针对抗原的辅助T细胞应答(例如CD4+辅助T细胞介导的应答)。因此，免疫应答经由MHC I类和MHC II类两种途径诱导。APC也可与佐剂、刺激树突细胞增殖的细胞因子和/或免疫刺激剂接触以进一步增强免疫应答。
不少合适的抗体可用于本发明缀合物中，包括但不限于来源于任何物种(例如人、鼠、兔等)的抗体和/或基因工程和重组表达的抗体(例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体)。优选的抗体包括人单克隆抗体。用于本发明的抗体也可包括任何抗体同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE，尽管优选的抗体为IgG同种型。抗体可为全抗体或其抗原结合片段，包括例如Fab、F(ab′)2、Fv和单链Fv片段。
用于本发明的优选抗体包括结合到人甘露糖受体上的人单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体由人重链和人κ轻链核酸编码，该核酸在其可变区中包含分别示于SEQ ID NO3和SEQ ID NO7的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO3或SEQ ID NO7同源性足够高的核苷酸序列，致使抗体保持结合到树突细胞上的能力。
另一些优选的人抗体包括以结合到人甘露糖受体上并具有人重链可变区和人κ轻链可变区为特征的抗体，可变区包含分别示于SEQID NO4和SEQ ID NO8的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO4或SEQID NO8同源性足够高的氨基酸序列，致使抗体保持结合到树突细胞上的能力。
另一些本发明具体人抗体包括包含互补决定区(CDR)的抗体，互补决定区具有人重链和轻链CDR1区、人重链和轻链CDR2区及人重链和轻链CDR1区，其中(a)人重链CDR1、CDR2和CDR3区包含选自图8中显示的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列(SEQ ID NO13、14、15)，及其保守序列修饰(conservative sequence modifications)；和(b)人轻链CDR1、CDR2和CDR3区包含选自图9中显示的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列(SEQ ID NO16、17、18)，及其保守序列修饰。
得自具体种系序列的抗体，例如，用人免疫球蛋白序列从系统中获得的抗体，如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因文库获得的抗体，也包括在本发明中。
用于本发明的人抗体可在宿主细胞中重组产生，例如含有抗体重链和轻链编码核酸的转染瘤(例如由无限增殖化CHO细胞或淋巴细胞组成的转染瘤)，或者直接得自表达抗体的杂交瘤(例如其包括得自转基因非人类动物如转基因小鼠的B细胞，其基因组包含编码抗体的人重链转基因和人轻链转基因，并且与无限增殖化细胞融合)。在一个具体实施方案中，抗体由杂交瘤产生，或者由含有人重链和人轻链核酸的宿主细胞(例如CHO细胞)转染瘤产生，所述人重链和人轻链核酸分别包含核苷酸序列SEQ ID NO3和7，及其保守修饰。
用于本发明的合适抗原包括任何抗原或其抗原部分，其为保护性或治疗性免疫应答所必需的，包括例如各种肿瘤和感染性疾病。具体的抗原其中可选自人绒毛膜促性腺激素β亚单位(βhCG)、Gp100、前列腺相关抗原(PSA)、Pmel-17、来源于结肠、肺、胰腺、乳腺、卵巢和生殖细胞的肿瘤细胞抗原、病毒蛋白、细菌蛋白、糖类和真菌蛋白。根据本发明，这类抗原结合抗体以形成高度有效的抗体疫苗缀合物。
另一方面，本发明提供具体包括与结合人甘露糖受体的抗体连接的βhCG的抗体疫苗缀合物。在一个实施方案中，所述缀合物包含与βhCG连接的人重链，例如本文所述的其重链包含SEQ ID NO10中所示的氨基酸序列的B11-βhCG缀合物。也提供单链形式的B11-βhCG缀合物，其包含SEQ ID NO12中所示的氨基酸序列。
本发明还提供含有一种或多种本发明抗体疫苗缀合物的组合物(例如药物组合物)。
所述组合物可额外包括一种或多种佐剂或其它已知增强免疫应答和/或增加APC活性的试剂。
根据下文的发明详述和所附权利要求书，本发明其它特征和优点将会是显而易见的。
附图简述

图1显示分子缀合物(SEQ ID NO11和12)图谱，该缀合物编码含有与βhCG抗原连接的单链B11抗体的融合蛋白(pB11sfv-βhCG)。
图2显示分子缀合物(SEQ ID NO9和10)图谱，该缀合物编码含有与βhCG抗原连接的全B11抗体的融合蛋白(βhCG-B11构建体)。
图3是分子缀合物的示意图。抗原与完整抗体的重链发生遗传性融合。
图4是流式细胞术研究的图，显示βhCG-B11构建体特异性结合表达MR的培养的人DC。
图5是一幅曲线图，显示βhCG-B11构建体诱导βhCG特异性细胞毒性T细胞。
图6是一幅柱状图，显示βhCG-B11构建体诱导βhCG特异性细胞毒性T细胞。
图7是一幅柱状图，显示βhCG-B11构建体诱导T辅助应答。
图8显示带有指定CDR区(SEQ ID NO13、14和15)的人单克隆抗体B11的重链V区核苷酸序列(SEQ ID NO3)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图9显示带有指定CDR区(SEQ ID NO16、17和18)的人单克隆抗体B11的轻(κ)链V区核苷酸序列(SEQ ID NO7)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
图10是根据运用基于网络的预测算法(BIMAS & SYFPEITHI)分析，显示βhCG-B11构建体的预测T细胞表位的示意图。发现T细胞表位潜在结合HLA-A2、HLA-B7和HLA-DR分子。根据βhCG-B11的B11区段，也预测了一些表位。在长37个氨基酸的C端肽中没有鉴定出T细胞表位。
图11是一幅曲线图，显示对βhCG-B11构建体特异性的CTL识别由DC呈递的scFv形式的抗原，B11sfv-βhCG。
图12显示人单克隆抗体B11重链V区的氨基酸序列(SEQ IDNO4)和种系序列(SEQ ID NO30)即VH5-51种系，并将其进行比较。
图13显示人单克隆抗体B11重链V区的核苷酸序列(SEQ IDNO3)和种系序列(SEQ ID NO29)即VH5-51种系，并将其进行比较。
图14显示带有指定CDR区的人单克隆抗体B11轻(κ)链V区的氨基酸序列(SEQ ID NO8)和种系序列(SEQ ID NO32)即Vκ5-L15种系，并将其进行比较。
图15显示带有指定CDR区的人单克隆抗体B11轻(κ)链V区的核苷酸序列(SEQ ID NO7)和种系序列(SEQ ID NO31)即Vκ5-L15种系，并将其进行比较。
发明详述本发明基于这样的发现用针对特定细胞受体的抗体将抗原靶向抗原呈递细胞(APC)，可以产生重要的T细胞介导的免疫应答。准确地说，为了有效治疗癌症和感染性疾病等多种疾病，疫苗必须诱发有效的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，在MHC I类情况下主要由识别抗原的CD8+T细胞所介导。为了优化免疫，优选伴有其它重要的效应T细胞功能，包括诱导抗原特异性辅助T细胞，例如在MHC II类途径情况下识别抗原的CD4+T细胞。因此，有效的疫苗应当诱导抗原特异性CTL，优选与其它T细胞介导免疫应答一道经由多种MHC途径诱导抗原特异性CTL。
因此，本发明提供新型基于抗体的疫苗缀合物和诱导或增强抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)应答的方法。本发明疗法使用包含抗体的分子缀合物，所述抗体结合到带有抗原的抗原呈递细胞(APC)上，例如树突细胞(DC)和巨噬细胞。
靶向APC的抗体是本领域已知的，并且包括例如靶向APC上I类或II类主要组织相容性(MHC)决定簇的抗体(78，79，81，83)。其它抗体包括靶向APC上Fc受体的抗体(77，79，80，81，82，83)，以及B细胞上的表面免疫球蛋白(84)。
在一个本文示例性的具体实施方案中，分子缀合物包括结合到人DC上甘露糖受体(MR)上的与βhCG抗原连接的抗体。这类缀合物可与APC在体内或活体外接触以产生所需的CTL应答。
为使本发明更易于理解，首先定义某些术语。其它的定义在发明详述中给出。
本文所用的术语“抗原呈递细胞(APC)”是指一类免疫细胞，该细胞能够以能被免疫系统识别的方式内化并加工抗原，致使抗原决定簇作为MHC相关复合体呈递在细胞表面(例如MHC I类限制性细胞毒性T淋巴细胞和/或MHC II类限制性辅助T淋巴细胞)。使得细胞起APC作用的两个必要性质为加工吞入细胞的抗原的能力和表达MHC基因产物的能力。APC的实例包括树突细胞(DC)、单核吞噬细胞(例如巨噬细胞)、B淋巴细胞、皮肤朗格汉斯细胞(Langerhans cells)和人体中的内皮细胞。
本文所用的术语“树突细胞(DC)”，包括未成熟DC和成熟DC和能够分化成DC的相关骨髓样祖细胞或相关抗原呈递细胞(例如单核细胞和巨噬细胞)。DC表达高水平的细胞表面分子和与T淋巴细胞相互作用的补体受体(例如C型凝集素，诸如甘露糖受体)，因此能够诱导有效的免疫应答。DC也分泌细胞因子、趋化因子和蛋白酶，这些物质能够启动免疫应答并使细胞免疫和体液免疫的扩增达到顶点。DC也在其表面表达结合抗原片段的主要组织相容性复合体(MHC)分子。识别这些抗原-MHC复合体的T细胞成为活化的并启动免疫级联。在一个优选实施方案中，本发明分子缀合物的抗体部分结合到树突细胞上，导致树突细胞内化所述缀合物。
术语“巨噬细胞甘露糖受体”或“MR”是指C型凝集素受体家族成员，其特征在于胞外部分重复的糖识别域(CDR)和含有两种推定网格蛋白打靶序列的短胞质尾区(34，35，37)。此外，MR含有N端丰富的半胱氨酸和纤连蛋白域。甘露糖受体的不同域具有特异性结合各种配体的能力，包括溶酶体酶、微生物、垂体激素、糖胺聚糖和硫酸化血型抗原(38-40)。
“MHC分子”包括两类分子，MHC I类和MHC II类。MHC I类分子将抗原呈递给特异性CD8+T细胞，MHC II类分子将抗原呈递给特异性CD4+T细胞。外源性递送到APC的抗原主要与MHC II类分子一起加工。与此相对，内源性递送到APC的抗原主要与MHCI类分子一起加工。但是，在特殊情况下，除MHC II类分子以外，DC具有独特的能力使外源抗原进入内部区室以结合到MHC I类分子上。这一过程称为“交叉敏化”或“交叉呈递”。
本文所用的术语抗原“交叉呈递”是指经由APC上的MHC I类和II类两种分子将外源蛋白抗原呈递给T细胞。
本文所用的术语“T细胞介导的应答”是指所有由T细胞，包括效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞)介导的应答。T细胞介导的应答包括例如T细胞细胞毒性和增殖。
本文所用的术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+T细胞介导。
本文所用的术语“抗体”包括全抗体或其抗原结合片段(包括例如Fab、F(ab′)2、Fv和单链Fv片段。合适的抗体包括任何形式的抗体，例如鼠抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体和任何类型的抗体同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE同种型。本文所用“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别。
全抗体含有通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(在本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个区组成。每条轻链由轻链可变区(在本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个CL区组成。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为“互补决定区(CDR)”，该区散在更保守的区域中，所述保守区称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基端到羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链可变区和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体恒定区可介导免疫球蛋白结合到宿主组织或因子上，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
优选的本发明抗体包括人抗体，例如具有IgG1(例如IgG1k)重链和κ轻链的人抗体。其它优选的本发明抗体结合人DC，例如结合人DC上C型凝集素受体的抗体，如人DC上的MR。在一个具体实施方案中，所述抗体为人单克隆抗体，该抗体结合到经SDS-PAGE测定分子量约为180kD的人巨噬细胞甘露糖受体(在本文亦称“人B11抗原”)上。产生这类抗体的方案描述于WO 01/085798，其所述内容通过引用结合到本文中。具体人抗体包括包含分别如SEQ ID NO2和SEQ ID NO6中所示的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的抗体，或者与SEQ ID NO2或SEQ ID NO6同源性足够高的氨基酸序列，致使所述抗体保持结合到树突细胞上的能力。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)，是指一种或多种保持特异性结合到抗原(例如树突细胞上的抗原)上能力的抗体片段。已经证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体片段执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1区组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL区和VH区组成的Fv片段，(v)由VH区组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的VL和VH两个区由独立的基因编码，但是它们可以连接在一起，方式为用重组方法，通过合成接头使它们以单一蛋白链形式产生，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。这类单链抗体也意指包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内。这些抗体片段用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同方式筛选所述片段的实用性。
本文所用术语“人抗体”，是用来包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不为人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如随机或体外定点诱变或由体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用的术语“人抗体”，不是用来包括抗体中来源于另一哺乳动物种系(例如小鼠)的CDR序列例如已经移植到人构架序列中的抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位表现出单一结合特异性和结合亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性的抗体，其可变区和恒定区来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的得自转基因非人类动物(例如转基因鼠，其基因组包含人重链转基因和轻链转基因)的B细胞。
本文所用的术语“重组人抗体”，包括所有由重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，例如(a)从转移了人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化可表达所述抗体的宿主细胞分离的抗体，例如，从转染瘤分离的抗体，(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过任何涉及剪接人免疫球蛋白基因序列到其它DNA序列上的其它方法制备、表达、创建或分离的抗体。这类重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，可对这类重组人抗体进行体外诱变(或当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，当得自人种系VH和VL序列并与其相关时，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列可以不是天然存在于体内人抗体种系库中的序列。
本文所用的“特异性结合”是指结合到预定抗原上的抗体。典型地，所述抗体以解离常数(KD)10-7M或更少结合，并且结合到预定抗原上的KD比其结合到非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)而不是预定抗原或密切相关抗原上的KD值至少低两倍。短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
本文所用的术语“高亲和性”，对于IgG抗体而言，是指抗体KD为10-8M或更小，更优选为10-9M或更小，甚至更优选为10-10M或更小。然而，“高亲和性”结合可因其它抗体同种型而变化。例如，“高亲和性”结合，对于IgM同种型而言，是指抗体KD为10-7M或更小，更优选为10-8M或更小。
本文所用的术语“K缔合”或“Ka”，是指具体抗体-抗原相互作用的缔合率，而本文所用术语“K解离”或“Kd”，是指具体抗体-抗原相互作用的解离率。本文所用术语“KD”，是指解离常数，其得自Kd与Ka之比值(即Kd/Ka)并表示为摩尔浓度(M)。
本文所用的术语“βhCG”是指人绒毛膜促性腺激素的β亚单位，并且包括任何得自βhCG序列(SEQ ID NO20)的全抗原、其抗原性片段、其等位变异体和任何多态变异体。βhCG为建立成功妊娠所必需的激素。除妊娠之外，这种抗原的表达主要限于生殖细胞肿瘤，以及大量的腺癌。
本文所用的术语“核酸分子”，包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为单链或双链，但优选为双链DNA。
本文所用的术语“分离的核酸分子”，是指编码本发明分子缀合物或其部分(例如SEQ ID NO9和11或其部分，诸如抗原或抗体部分(即VH、VL或CDR))的核酸。分离的核酸分子是指编码分子缀合物的核苷酸序列中不含其它污染核苷酸序列(例如不编码任何部分分子缀合物的核苷酸序列)的核酸分子。
如本文所公开和所要求，SEQ ID NO1-28中所示的序列可包括“保守序列修饰”，即核苷酸和氨基酸序列修饰，其不显著影响或改变由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的分子缀合物的功能特征，例如构建体抗体部分的结合性质或抗原部分的免疫原性。这类保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。修饰可通过本领域已知标准技术引入SEQ ID NO1-28中，例如定点诱变和PCR介导诱变。保守氨基酸取代包括氨基酸残基由具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域定义。这些家族包括带碱性侧链氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、带酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分枝侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，预测的非必需氨基酸残基在人抗DC抗体中优选用相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。
或者，在另一个实施方案中，在所有或部分分子缀合物编码序列中随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且所得修饰的分子缀合物可用来筛选合适的功能活性。
因此，本文公开的由核苷酸序列编码的分子缀合物，和/或含有本文公开的氨基酸序列的分子缀合物(即SEQ ID NO1-28)，包括由经过保守修饰的类似序列编码或含有所述类似序列核苷酸序列的基本类似的缀合物。具体地说，至于可产生何等基本类似抗体用于基于部分(即重链可变区和轻链可变区)序列(即SEQ ID NO3、4、7或8)的分子缀合物的讨论提供如下。
就核酸而言，术语“基本同源”表示两个核酸或其明确序列，当任选比对和比较时是相同的，在至少约80％的所述核苷酸中，通常至少约90％-95％，更优选至少约98％-99.5％的核苷酸中带有适当的核苷酸插入或缺失。
两个序列间的百分同一性为由所述序列共享的相同位置数的函数(即％同源性＝相同位置数/总位置数×100)，考虑到空位数，以及每个空位的长度等，两个序列最佳比对需要引入的空位。序列比较和两个序列间百分同一性的确定可用数学算法完成，如以下非限制实例所述。
两个核苷酸序列间的百分同一性可用GCG软件包中GAP程序(在http//www.gcg.com上提供)确定，该软件包使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位加权以及1、2、3、4、5或6的长度加权。两个核苷酸序列间的百分同一性也可用E.Meyers和W.Miller算法(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))确定，该算法已经结合到用PAM120权重残基表、空位长度12罚分和4空位罚分的ALIGN程序(2.0版)中。此外，两个氨基酸序列间的百分同一性可用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))算法确定，该算法已结合到GCG软件包中GAP程序(在http//www.gcg.com上提供)确定，该软件包使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位加权以及1、2、3、4、5或6的长度加权。
例如，本发明核酸序列和蛋白质序列还可用作“查询序列”搜索公共数据库，以鉴定相关序列。这类搜索可用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序，分值＝100、字长＝12进行，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用XBLAST程序，分值＝50、字长＝3进行，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得以比较为目的的空位比对，可如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述利用Gapped BALST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序的缺省参数(例如XBLAST和NBLAST)。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
所述核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物或部分纯化的或基本纯的形式中。当用标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域众所周知的方法，从其它细胞组分或其它污染物如其它细胞核酸或蛋白中纯化出核酸，所述核酸为“分离的”或“提炼的基本纯的”。参见F.Ausubel等编辑Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。
当将核酸置于与另一核酸序列功能性关系中时，核酸为“有效连接”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则它有效连接于编码序列。就转录调节序列而言，有效连接是指被连接的DNA序列为相邻的，并当有必要连接两个蛋白编码区时为阅读框内相邻。就开关序列而言，有效连接是指所述序列能够有效开关重组本文所用术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其为环状双链DNA环，其中可接入额外DNA区段。另一类型载体为病毒载体，其中额外DNA区段可接入病毒基因组中。某些载体能够在其被导入的宿主细胞中自我复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后，可整合到宿主细胞基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。不仅如此，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。这类载体本文称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括这类其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其发挥等价功能。
本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)，是指重组表达载体已经引入其中的细胞。应当理解，这类术语不仅指具体研究的细胞，也指这类细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而发生于后代中，实际上，这类子代可能与亲代细胞不同，但仍包括与本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如CHO细胞和淋巴细胞。
本文所用的术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本发明的各个方面在以下小节作更详细的描述。
I.抗原例如，用于本发明的合适抗原包括保护性或治疗性免疫应答所必需的感染性疾病抗原和肿瘤抗原，例如肿瘤细胞或病原生物体表达的抗原或感染性疾病抗原。例如，合适的抗原包括用于预防或治疗癌的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、酪氨酸酶、端粒酶、MUC-1抗原和生殖细胞来源的肿瘤抗原。肿瘤相关抗原也包括血型抗原例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，不止一种抗原可包括在本发明抗原-抗体构建体中。例如，MAGE抗原可与其它抗原(例如黑色素A、酪氨酸酶和gp100)以及缀合物(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或IL-12)组合，并连接到抗APC抗体上。
其它合适的抗原包括用于预防或治疗病毒疾病的病毒抗原。病毒抗原的实例包括但不限于HIV-1 gag、HIV-1 env、HIV-1 nef、HBVcore、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。细菌抗原的实例包括但不限于鼠弓形体(Toxoplasma gondii)或苍白密螺旋体(Treponema pallidum)。本发明抗体-细菌抗原缀合物可用于治疗或预防各种细菌疾病，例如炭疽、肉毒中毒、破伤风、衣原体病、霍乱、白喉、莱姆病、梅毒和结核。
在一个本文示例性的具体实施方案中，本发明使用包含βhCG的抗原。该抗原包括完整βhCG序列(SEQ ID NO20)或该序列的任何免疫原性(例如含T细胞表位)部分。如下所述，这类免疫原性部分可用本领域已知T细胞表位作图技术鉴定，包括算法和已知T细胞表位作图技术。来自βhCG的免疫原性肽的具体实例包括包含SEQ IDNO21、22、23、24、25、26、27或28的肽，及其保守修饰(conservativemodifications)。来自βhCG的另外的免疫原性肽，以及这类肽的鉴定方法描述于美国专利号US 6,096,318和6,146,633中，其内容通过引用结合到本文中。
蛋白的抗原肽(即含有T细胞表位的肽)可以各种本领域众所周知的方式鉴定。例如，可用基于网络的预测算法(BIMAS &SYFPEITHI)，通过分析所述蛋白质序列，预测T细胞表位，来产生潜在MHC I类和II类结合肽，该肽与10000个此前由CTL定义的完全鉴定的MHC结合肽的内部数据库匹配。高打分肽可根据与给出的MHC分子的高亲和性进行排列并选择为“有意义”。如图10所示，并用βhCG缀合物的序列(SEQ ID NO10)，所有算法用于鉴定来自βhCG部分(芥子)的抗原肽，合成型可由其形成，并可检测它们体外引发T细胞应答的能力。因此，寻找潜在结合到HLA-A2、HLA-B7和HLA-DR分子上的T细胞表位。一些表位也由βhCG-B11缀合物的抗体(B11)片段预测(结果未显示)。此外，在长37个氨基酸的C端肽(CTP)中没有鉴定出T细胞。
鉴定含有T细胞表位抗原肽的另一种方法为将蛋白分成所需长度的非重叠肽，或者所需长度的重叠肽，其可通过重组、合成或在某些限制性位点用化学裂解蛋白并测试免疫原性质(例如引发T应答，即增殖或淋巴因子分泌)产生。
例如，为用精细作图技术精确确定所述蛋白的T细胞表位，具有T细胞刺激活性并因此包含至少一个T细胞表位的肽(如T细胞生物学技术所确定)，可通过在所述肽的氨基或羧基端添加或缺失氨基酸残基而修饰，并测试以确定相对于所修饰的肽的T细胞中的变化。如果发现在天然蛋白质序列中重叠区共享的两种或更多种肽具有人T细胞刺激活性(如T细胞生物学技术所确定)，可以产生包含全部或部分这类肽的额外肽，并且可以通过类似的方法对这些额外多肽进行测试。根据这一技术，对肽进行选择并用重组或合成方法来生产。根据包括对所述肽的T细胞应答强度(例如刺激指数)在内的多种因素对肽进行选择。随后对这些所选肽的理化性质(例如溶解性、稳定性)进行检测以确定该肽是否适合用于治疗性组合物中，或者是否需要进行修饰。
II.抗体疫苗缀合物本发明提供各种治疗性疫苗缀合物，其中包括抗原如肿瘤抗原或病毒抗原，所述抗原经甘露糖受体(MR)连接在与APC结合的抗体上。这使得抗原被靶向到APC(例如树突细胞)，以增强加工、呈递并最终增强针对所述抗原的免疫应答，例如CTL应答。
本发明抗体-抗原疫苗缀合物可通过基因方法或化学方法制备。在这两种情况下，缀合物的抗体部分都可由全抗体或部分抗体，例如Fab片段或单链Fv组成。此外，不止一种抗原可加入到单链抗体构建体中。
遗传构建的抗树突抗体-抗原缀合物(例如作为单一重组融合蛋白表达的缀合物)可通过将所选的抗原结合到抗体的不同位置上而制备。具体的基因方法产生的本发明缀合物(融合构建体)包括例如βhCG-B11构建体，如图2所示。βhCG-B11构建体包含人抗树突细胞抗体B11，其与肿瘤相关抗原βhCG融合。编码该构建体的核苷酸序列示于SEQ ID NO9。
例如，如βhCG-B11遗传融合构建体所示，βhCG-B11抗原可融合到人抗体重链CH3区的末端。所述抗原也可融合在Fab-融合构建体中抗体重链铰链区，或者在单链融合构建体(ScFv构建体)中带有可变轻链和重链(VH和VL)的序列。或者，所述抗原可融合到抗体轻链而不是抗体重链上。可以使用抗原和抗体间其它融合点，只要基因融合构建体可引发CTL应答。完整βhCG-B11构建体和单链B11构建体(pB11sfv-βhCG)的详细图谱分别示于表1和表2。
表1βhCG-B11特征图谱编码序列(共3个)BUsfr-bHCG开始921结束2153neo开始3375结束4169新霉素抗性基因Amp开始5671结束6531(互补)氨苄青霉素抗性基因其他特征(共5个)启动子开始863结束882启动子信号序列开始921结束977 B11 VL开始978结束1296 B11 VH
开始1344 结束1691βHCG开始1712 结束2164聚腺苷酸化信号(共2个)聚腺苷酸开始2267结束2491聚腺苷酸聚腺苷酸开始4343结束4473SV40聚腺苷酸化信号真核启动子(共1个)启动子开始232结束819真核启动子原核启动子(共1个)启动子开始6566结束6572(互补)启动子复制起点(共3个)SV40启动子和起点开始1结束1复制起点F1起点开始2537结束2965复制起点pUC起点开始4856结束5526(互补)起点表2pB11sfv-βhCG特征图谱编码序列(共4个)轻链开始735结束1433 B11轻链Cκ开始1113结束1433AMP开始7810结束8670(互补)amp
起始位点说明互补的1..6871)DHFR开始8921结束9484dhfr起始位点说明7122-7685其他特征(共9个)B11VL开始792结束1112SV40启动子/Ori开始2298结束2622SV40启动子和复制起点Neo开始2658结束3452新霉素抗性基因βHCG开始4015结束4467(互补)bHCGCHS开始4470结束4790(互补)重链恒定区3CH2开始4791结束5120(互补)重链恒定区2CH1开始5166结束5459(互补)重链恒定区1B11VH开始5460结束5807(互补)启动子开始5905结束6559(互补)聚腺苷酸化信号(共3个)聚腺苷酸开始1526结束1757聚腺苷酸开始3744结束3975(互补)聚腺苷酸化信号2开始10282结束10411SV40聚腺苷酸起始位点说明8483..8612真核启动子(共1个)
启动子开始9结束655化学构建的抗体-抗原缀合物可用各种熟知和易于获得的交联试剂制备。这些交联试剂可为同官能化合物或杂官能化合物，例如SPDP、SATA、SMCC、DTNB，该化合物与抗树突抗体和所选抗原上不同反应性氨基酸或糖侧链形成共价键。
任何可被克隆和表达或纯化的抗原可选择用于本发明。获得这类抗原的技术是本领域众所周知的。例如，肿瘤相关抗原可从癌细胞直接纯化，并由理化技术例如串联质谱鉴定。或者，可用肿瘤特异性T细胞克隆测试抗原阴性细胞，该细胞已经通过用质粒DNA克隆转染获得抗原，来分离表达所述抗原的克隆。然后可构建合成肽以精确鉴定抗原位点或表位。
在一个具体实施方案中，疫苗构建体的部分抗体序列可用于表达完整抗体。包括在本发明疫苗缀合物中的抗体如抗APC抗体(如B11)，主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基，与靶抗原(例如C型凝集素受体，例如MR)相互作用。为此，CDR中的氨基酸序列在个体抗原间比CDR外的序列更为多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体而表达模拟特异性天然存在抗体性质的重组抗体，所述表达载体包括从不同性质的不同抗体上移植到构架序列上的来自特异性天然存在抗体的CDR序列(参见例如Riechmann，L.等(1998)Nature 332323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321522-525；和Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033)。这类构架序列可由包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列会不同于成熟抗体基因序列，因为它们将不包括完整装配的可变基因，该基因在B细胞成熟期间由V(D)J连接形成。种系基因序列在也将不同于个体中高亲和性第二抗体所有组成成分的序列，该序列均匀分布于可变区。例如，体细胞突变在构架区氨基端部分相对少见。例如，体细胞突变在构架区1氨基端部分和构架区4羧基端部分相对少见。此外，许多体细胞突变不显著改变抗体的结合性质。为此，没有必要获得具体抗体的完整DNA序列，以重建具有与原始抗体结合性质类似的完整重组抗体(参见WO 99/45962，其通过引用结合到本文中，用于所有的目的)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列一般足以满足此目的。所述部分重链和轻链序列用于确定哪个种系可变和J基因区段有助于重组抗体可变基因。然后，种系序列用来填补可变区的缺少部分。重链和轻链前导序列在蛋白成熟期间被切割，并且无助于最终抗体的性质。为此，有必要使用相应的表达构建体的种系前导序列。为了添加缺少序列，克隆cDNA序列可与合成寡核苷酸通过连接或PCR扩增结合。或者，完整可变区可合成为一套短的、重叠寡核苷酸，并由PCR扩增结合以创建完整合成可变区克隆。这一过程具有某些优点如消除或包含或具体限制位点，或者优化具体密码子。
杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列用来设计一套重叠合成寡核苷酸，以创建合成带有氨基酸编码能力与天然序列相同的V序列。所述合成的重链和κ链序列可在三方面与天然序列不同间插成串重复核苷酸碱基以促进关核苷酸合成和PCR扩增；最优翻译起始位点根据Kozak规则(Kozak(1991)J.Biol.Chem.26619867-19870)加入；并且HindIII位点装在翻译起始位点的上游。
就重链可变区和轻链可变区两者而言，优化的编码链和相应的非编码链序列被断裂成相应的30-50个核苷酸左右的中位非编码寡核苷酸。因此，对于每个侧链来说，所述寡核苷酸可装配成跨距为150-400核苷酸的重叠双链组。然后，所述库用作模板来产生150-400核苷酸区段的PCR扩增产物。典型地，将一组可变区寡核苷酸组分成两个库，该库独立地扩增以产生两个重叠PCR产物。这些重叠产物接着通过PCR扩增结合形成完全可变区。也可期望在PCR扩增中包括重链可变区或轻链可变区重叠片段(包括κ轻链的BbsI位点，或者γ重链的AgeI位点)，以产生可容易地克隆到表达载体构建体中的片段。
然后，重建的重链可变区和轻链可变区与克隆的启动子、翻译起点、恒定区、3’非翻译聚腺苷酸化和转录终止序列结合，形成表达载体构建体。所述重链和轻链表达载体构建体可结合到单一载体中，共同转染、依次转染或独立转染到宿主细胞中，然后融合产生表达两条链的宿主细胞。
用于构建人IgGκ的表达载体的质粒描述如下。构建所述质粒以使得PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可用来重建完全重链和轻链小基因。这些质粒可用来表达完全人或嵌合IgG1κ和IgG4κ抗体。类似的质粒可构建来表达其它重链同种型，或者表达包含λ轻链的抗体。
因此，在本发明另一方面，本文所述疫苗缀合物抗体部分的结构特征如B11，用来创建保留至少一种本发明B11抗体功能性质(例如结合APC)的结构相关抗体。更具体地说，B11的一个或多个CDR区可与已知构架区和CDR重组结合，来创建用于本发明疫苗缀合物的额外、重组工程的、抗APC抗体。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供制备包含抗DC抗体的疫苗缀合物的方法，所述方法包括制备包含以下的抗体(1)人重链构架区和人重链CDR，其中至少一种人重链CDR包含选自图8中所示CDR氨基酸序列(SEQ ID NO13、14或15)的氨基酸序列；和(2)人轻链构架区和人轻链CDR，其中至少一种人轻链CDR包含选自图9中所示CDR氨基酸序列(SEQ ID NO16、17或18)的氨基酸序列；其中所述抗体保留结合到APC上的能力。
抗体结合到APC上的能力可用标准结合试验如实施例中所述(如ELILSA)试验测定。因为，本领域众所周知，抗体重链和轻链CDR3区在抗体特异性/亲和力结合抗原上起特别重要的作用，本发明如上述制备的重组抗体优选包含B11的重链和轻链CDR3。所述抗体还包含B11的CDR2。所述抗体还可包含B11的CDR1。因此，本发明还提供包含以下的抗APC抗体(1)人重链构架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区、人重链CDR3区，其中人重链CDR3区为图8中所示的B11的CDR3(SEQ ID NO15)；和(2)人轻链构架区、人轻链CDR1区，人轻链CDR2区，人轻链CDR3区，其中人轻链CDR3区为图9中所示的B11的CDR3(SEQ ID NO18)，其中所述抗体结合DC。所述抗体还包含B11的重链CDR2和/或轻链CDR2。所述抗体还可包含B11的重链CDR1和/或轻链CDR1。
优选地，上述基因工程抗体的CDR1、CDR2和/或CDR3包含本文公开的B11的恰切氨基酸序列。然而，普通技术人员将会认识到，在仍保留抗体有效结合DC的能力的同时，B11的恰切CDR序列的改变是可行的(例如保守取代)。因此，在另一个实施方案中，所述基因工程抗体可由一种或多种CDR组成，该CDR例如至少90％、95％、98％或99.5％等同于B11的一种或多种CDR。
除了或撇开简单结合APC外，基因工程抗体如上述抗体可以根据其保留本发明抗体的其它功能性质进行选择，例如(1)结合APC上的高亲和性；(2)结合到APC上的独特表位上(当用于结合时，来消除由补体活性的单克隆抗体会竞争结合同一抗原表位的可能性)；(3)诱导针对所述抗原而产生的T细胞介导的免疫应答；和/或(4)诱导包含CD4+和CD8+T细胞介导应答的T细胞应答。
在另一个实施方案中，转化表达目标抗原如βhCG的全细胞，来表达抗APC抗体如抗MR抗体，致使抗原和抗体由细胞共表达。例如，通过用编码含有跨膜域和抗APC抗体的融合蛋白的核酸转染靶细胞的方式，可以做到这一点。表达疫苗缀合物的细胞可接着用于靶向APC如DC，以诱导CTL应答。
产生这类核酸、融合蛋白和表达这类融合蛋白的细胞的方法描述于美国专利申请第09/203,958号，该文献通过引用整体结合到本文中。
或者，所述抗体可通过使用化学接头、脂质标签或其它相关方法连接到细胞或病原体上(deKruif，J.等(2000)Nat.Med.6223-227；Nizard，P.等(1998)FEBS Lett.43383-88)。表达目标抗原和表面锚定抗体的细胞可用于诱导特异性免疫应答如CTL应答，以对抗细胞如肿瘤细胞或微生物病原体。
III.药物组合物另一方面，本发明提供治疗性组合物如药物组合物，其含有一种或组合的与药物可接受载体一起配制的本发明疫苗缀合物。为递入受试者血流与受试者T细胞相互作用，而给予本发明疫苗缀合物。这类T细胞的靶向可在体内或活体外直接用所述缀合物或用已经事先用疫苗缀合物靶向的细胞来完成。
本发明组合物可额外包括其它治疗试剂如其它抗体、细胞毒素或药物(例如免疫抑制剂)，并可单独给予或与其它疗法如放疗联合给予。例如，由APC快速内化的疫苗缀合物可与增强树突细胞抗原呈递细胞活性(例如释放免疫刺激性细胞因子)的单克隆抗体结合。
本文所用的“药物可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等生理相容物质。优选的载体适用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮给予(例如注射或输注)。根据给药途径，所述疫苗缀合物可包在材料中以保护所述化合物免受酸和其它可使所述化合物失活的自然条件的作用。
“药物可接受的盐”是指保留母体化合物所需生物活性并且不产生任何不良毒性效应的盐(参见例如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。这类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括得自无毒无机酸的盐，例如盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、亚磷酸盐等，以及得自无毒有机酸的盐，例如脂肪族一和二羧酸盐、苯基取代的烷酸盐、羟基烷酸盐、芳族酸盐、脂族和芳族磺酸盐等。碱加成盐包括得自碱土金属的盐，例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等，以及得自无毒有机胺的盐，例如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
本发明组合物可通过本领域已知的各种方法给予。本领域技术人员将会认识到，给药途径和/或模式将取决于所需结果。活性化合物可与防止所述化合物快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递药系统。可使用生物可降解的、生物相容性多聚物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的许多制备方法申请了专利或为本领域技术人员公知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为通过某些给药途径给予本发明疫苗缀合物，可能有必要用材料包住化合物或与将化合物与材料一起给予以防止其失活。例如，所述化合物可在合适的载体中给予受试者，例如脂质体或稀释剂。药物可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂，以及常规脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.727)。
药物可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时配制成无菌注射液或分散液的无菌粉末。这类介质和药物活性物质的用途是本领域已知的。除任何与所述活性化合物不相容的常规介质或药物的情况外，考虑了其在本发明药物组合物中的用途。补充活性化合物也可加入到所述组合物中。
治疗性组合物一般必须无菌并在生产和储存条件下稳定。所述组合物可制备成溶液剂、微乳剂、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可为含有例如水、醇、多元醇(例如乙二醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物的溶剂或分散介质。可保持合适的流动性，例如，通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂等。在许多情况下，会在组合物中优选包括等渗剂，例如糖、糖醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。注射组合物的延长吸收可通过在组合物包括延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶引起。
无菌注射液可通过将活性化合物以所需量加入到上述带有一种或组合成分的合适溶剂中制备，如果需要，再进行无菌微滤。一般而言，分散体通过将活性化合物加入到无菌溶媒中制备，该无菌溶媒含有基本分散介质和来自上述所需其它成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冻干(冷冻干燥)，可得到活性成分的粉末外加任何来自其此前无菌过滤溶液的额外所需成分。
调整剂量方案以提供最优所需反应(例如治疗反应)。例如，可给予一次大剂量，可在某时间段内给予几个分剂量或根据治疗情况的急迫性的指示按比例减少或增加剂量。尤其有利地是，为了简便给药和同一剂量，以剂量单位形式配制胃肠外组合物。本文所用剂量单位形式是指适于用作要治疗受试者单一剂量的物理分离单位；每个单位含有经计算与所需药用载体一起产生所需疗效的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格按照和直接根据(a)所述活性化合物的独特的特征和要达到的具体疗效，和(b)配制这类治疗个体中敏感性活性化合物的本领域固有的限制。
药物可接受的抗氧化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
就治疗性组合物而言，本发明制剂包括适用于口服和/或胃肠外给药的制剂。所述制剂可以适当的单位剂型存在，并可由药学领域任何已知方法制备。可与载体物质混合以产生单一剂型的活性成分的量，会根据要治疗受试者和具体的给药模式而变动。可与载体物质混合以产生单一剂型的活性成分的量，一般会是产生疗效的组合物的量。一般而言，在百分之百外，此量的范围为约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％。
本文所用的短语“胃肠外给药”和“胃肠外给予”是指不是肠道和局部给药的给药模式，通常通过注射，包括并不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内的注射和输注。
可用于本发明药物组合物中的合适的水和非水载体包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。可通过例如使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体情况下保持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂保持适当的流动性。
这些组合物也可含有辅料例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌程序，见上，以及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等确保防止微生物的存在。将等渗剂，例如糖、氯化钠等包括进组合物中也是可取的。此外，注射用药物形式吸收的延长，可通过包括延长吸收剂如单硬脂酸铝和明胶产生。
当本发明化合物作为药物给予人和动物时，可单独给予或作为含有例如与药物可接受载体混合的0.01-99.5％(更优选0.1-90％)的活性成分的药物组合物给予。
不管所选的给药途径，通过本领域技术人员已知的常规方法，将可在合适的水合形式中使用的本发明化合物，和/或本发明药物组合物，配制成药物可接受的剂型。
本发明药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变动，以获得适量的针对具体患者的有效取得所需治疗反应的活性成分、组合物和给药模式，而不引起患者毒性。所选的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括本发明所用具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所用具体化合物的排泄率、疗程、与所述具体组合物联用的其它药物、组合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和先前就医史和医疗领域熟知的类似因素。
具有本领域普通技能的执业医师或兽医可轻易的确定有效量的所需药物组合物并开出处方。例如，执业医师或兽医可以低于所需量的用于所述药物组合物中的本发明化合物开始，以取得所需疗效并逐渐增加剂量直到取得所需效果。一般而言，合适的本发明组合物的日剂量会是有效产生疗效的所述化合物的最低剂量。这类有效剂量通常会取决于上述因素。优选给药途径为静脉内、肌内、腹膜内或皮下，优选在靶部位附近给药。如果需要，治疗组合物的有效日剂量可在全天的适当的时间间隔内以独立给药的2、3、4、5、6或更多分剂量给予，任选以单位剂型给予。虽然由可能单独给予本发明化合物，但优选以药物制剂(组合物)给予所述化合物。
治疗组合物可以用本领域已知医疗装置给予。例如，在一个优选实施方案中，本发明治疗组合物可用无针皮下注射装置给予，例如公布于美国专利第5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556号的装置。用于本发明的众所周知的植入物和模块的实例包括美国专利第4,487,603号，该专利公开以可控速率分配药物的可植入微量输液泵；美国专利第4,486,194号，该专利公开通过皮肤给药的治疗装置；美国专利第4,447,233号，该专利公开以精确输注速率递药的医用输液泵；美国专利第4,447,224号，该专利公开连续递药用流速可变可移植输液装置；美国专利第4,439,196号，该专利公开具有多室隔间的渗透递药系统；和美国专利第4,475,196号，该专利公开渗透递药系统。这些专利通过引用结合到本文中。许多其它这类植入物、递药系统和模块是本领域技术人员已知的。
所述组合物必须是无菌的，流动性要满足组合物用注射器递送的要求。除了水以外，所述载体可为等渗缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可通过例如使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体情况下保持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂保持适当的流动性。在许多情况下，在所述组合物中优选包括等渗剂如糖、糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇和氯化钠。可通过在所述组合物中包括延迟吸收剂如单硬脂酸铝和明胶等产生注射用组合物的长时间吸收。
当所述活性化合物如上所述得到适当保护时，所述化合物可与例如惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起口服给予。
IV.本发明的用途和方法本发明疫苗缀合物可用于治疗和/或预防(例如免疫针对)各种疾病和病症。
主要的疾病适应症之一为癌。这包括但不限于结肠癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、肥大细胞瘤、乳腺癌、白血病或类风湿成纤维细胞瘤。另一主要的疾病适应症为感染性疾病，包括但不限于HIV、肝炎(例如甲型、乙型、丙型)、流行性感冒、疱疹、贾第虫病、疟疾、利什曼原虫病、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)病、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)病。另一种主要的疾病适应症为自身免疫病。
在一个具体的实施方案中，所述疫苗缀合物用于治疗或预防由βhCG或表达βhCG的细胞介导的疾病和病症，其为半胱氨酸环生长因子超家族的成员。有证据表明，βhCG作为生长因子、血管生成和/或转移促进因子，或者作为免疫功能抑制剂在癌的建立或发展中起作用(73)。因此，本发明可用于治疗癌和其它涉及血管生成的疾病的发展。本发明也可通过抑制βhCG或表达βhCG的细胞在妊娠中的作用而用于预防或终止意外妊娠。
就治疗用途而言，可以将本发明的疫苗缀合物直接给予受试者(即体内)。或者，可以将所述缀合物间接给予受试者，即首先通过使所述缀合物与APC例如树突细胞接触(例如通过培养或孵育)，然后将所述细胞给予受试者(即体外)。所述缀合物的接触与递送到APC，致使它们被在给药前由APC加工并呈递，亦称抗原或细胞“负载”。将抗原加载到APC的技术是本领域众所周知的，并且包括例如Gunzer和Grabbe，Crit Rev Immunol 21(1-3)133-45(2001)和Steinman，ExpHematol 24(8)859-62(1996)。
在所有情况下，所述疫苗缀合物都以有效量给予以发挥其所需要的疗效。术语“有效量”是指必需或足以实现所需生物效应的量。例如，有效量可为消除肿瘤、癌或细菌、病毒或真菌感染的必需量。任何具体应用的有效量可根据待治疗疾病或病症、待给予的具体缀合物、受试者体型或疾病或病症的严重程度等各种因素而变化。本领域普通技术人员无需进行过多的实验，凭经验就可确定具体多特异性分子的有效量。
所述疫苗缀合物的优选给药途径包括例如注射(例如皮下、静脉内、胃肠外、腹膜内、鞘内)。所述注射可为快速浓注或连续输注。其它给药途径包括口服给药。
本发明疫苗缀合物也可与辅料和其它治疗剂例如免疫刺激剂共同给予。所述缀合物通常单独配制在药物可接受的载体中，或者与这类药物混合配制。这类载体的实例包括溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、乳剂等。药物活性物质的这类介质的用途是本领域众所周知的。任何其它适合与所述分子联用的常规载体在本发明范围之内。
与所述疫苗缀合物共同给予的合适的治疗剂包括其它抗体、细胞毒素和/或药物。在一个实施方案中，所述治疗剂为已知帮助或诱导免疫应答的抗溶细胞性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)抗体。在另一个实施方案中，所述治疗剂为化疗药。所述疫苗缀合物也可与放疗一同给予。
通过以下实施例进一步描述本发明，以下实施例不得解释为对本发明的进一步限制。本申请全篇中所引用的所有数字和所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容，全都通过引用结合到本文中。
实施例方法与材料从全血或leukopak产生DC通过将肝素化全血或带有Ficoll-Paque的单采血液成分制剂进行密度梯度离心，获得人外周血单核细胞(PBMC)。然后，通过粘附塑料培养皿或淘析分离单核细胞，并通过向培养基中添加细胞因子(10ng/ml GM-CSF和2ng/ml IL-4)使其分化成未成熟DC。在第5天和第7天之间收获DC，用流式细胞仪进行分析。以这种方式制备的DC为CD14-、HLA-DR+、CD11c+甘露糖受体+和高水平表达的MHC I类和II类、CD80和CD86。
肿瘤抗原βhCG的选择βhCG是人绒毛膜促性腺激素(成功建立妊娠所必需的激素)的亚单位。此糖蛋白亚单位具有若干特点使其成为癌免疫治疗中值得关注的抗原(有关综述参见Triozzi P.L.和StevensV.(1999)Oncology Reports 67-17)。首先，除妊娠外，此抗原的表达主要限于生殖细胞肿瘤，以及大量腺癌(表3)。其次，hCG为半胱氨酸环生长因子超家族的成员，并可作为生长因子、血管生成和/或转移促进剂，或者作为免疫功能抑制剂在癌的建立或发展中起作用。因此，限制功能性hCG表达的免疫疗法可提供额外的治疗益处。
表3通过免疫组织化学对βhCG呈阳性的肿瘤百分率(Triozzi P.L.和Stevens V.(1999))
增殖试验在96孔平底微量板中，效应T细胞(5×104)与有或没有荷载抗原(MDX-1307或其它)的自身DC(5×103)共同培养，终体积为0.2ml。所述混合物于37℃共同培养。第4天，培养物用3H-胸苷(1μCi/孔)进行脉冲，18小时后，直接在滤器(Millipore)上收获细胞。滤器用水洗涤三次，然后用乙醇洗涤一次，并在通风橱中干燥5-10分钟。随后将闪烁液(Packard，20μl/孔)加入到滤器中。在Wallacβ计数器上通过计数来确定滤器结合的放射性。结果表示为用抗原刺激的对未用抗原或用对照抗原刺激的CTL的刺激指数(S.I.)值(cpm)。就MHC阻断分析而言，标记的靶与HLA-特异性mAb一起在室温下预孵育30分钟，W6/32用于阻断所有I类，L243用于阻断所有II类HLA分子(20μg/ml)。通过离心除去未结合的mAb。
流式细胞术通过在GM-CSF和IL-4中培养5天，由单核细胞制备人DC。将DC与10μg/ml的βhCG抗原/抗MR抗体疫苗缀合物或同种型对照一起在冰上孵育。疫苗缀合物直接用FITC-标记或用FITC-标记的抗βhCG第二单克隆抗体进行检测。用LSR流式细胞仪测定结合荧光的细胞。
细胞毒性试验靶细胞(3×106)、对照和荷载抗原(βhCG-B11)用RPMI培养基洗涤两次，将沉淀重悬于200μl培养基中并用100μCi51Na2CrO4于37℃标记60分钟。标记的靶用RPMI培养基洗涤三次，将沉淀重悬浮以使细胞浓度为3×104细胞/ml。抗原特异性CTL在96孔V-形底板中滴定，以得出100∶1(效应T细胞，E靶，T)直到12.5∶1或更低的比值。加入恒定数目的标记靶(100μl/孔或3,000靶细胞/孔)，将板以低速(180xg)离心并于37℃孵育。4小时后，收获100-120μl上清液，用γ-计数器(Wallac Instruments，Perkin-Elmer)测定释放的放射性。CTL活性用以下方程计算并表示为％特异性裂解(杀伤) 其中实验性释放(cpm)，是指含有CTL(E)和靶(T)的孔中的放射性(释放的铬)；自发释放(cpm)，是指在0.1ml培养基中只有靶(即没有添加CTL)的孔中的放射性；而最大释放，是指在0.1ml去污剂溶液(Igepal CA 630；syn.NP-40；RPMI培养基中的5％溶液)中有靶的孔中的放射性。在孔-控制的实验条件下，自发释放值应为最大释放的10％或以下。就MHC阻断分析而言，将标记的靶与HLA-特异性mAb一起在室温下预孵育30分钟，W6/32用于阻断所有I类，L243用于阻断所有II类HLA分子(20μg/ml)。通过离心除去未结合的mAb，将mAb-包被的靶加到CTL上。用同种型匹配的mAb作为对照。
还有另一种方法来检查细胞介导的免疫应答，该方法对抗原-驱动的T细胞的增殖能力进行研究。当事先暴露的抗原存在于MHC II类和程度较低的I类分子时，抗原敏化的T细胞往往优先增殖。因此，分裂细胞摄取放射性示踪剂的计数提供了刺激的度量。
实施例1βhCG-B11的产生疫苗缀合物的设计通过将βhCG抗原与B11即结合树突细胞上的人巨噬细胞甘露糖受体上的完全人抗体连接，产生该构建体。通过基因融合方法，使所述抗原与所述抗体的重链通过共价结合完成键合，如图3所示。
βhCG-B11疫苗缀合物的重组表达如图2所示，产生含有新霉素基因和二氢叶酸还原酶基因的质粒，其含有与抗体B11在重链CH3区融合的βhCG编码序列(SEQ ID NO9和10)。采用标准化方案(QiagenInc，Valencia，CA)，将所得质粒构建体转染到CHO细胞中。将转染细胞在含有抗生素G418的培养基中进行选择。让细胞在浓度逐渐增高的氨甲蝶呤中生长来进一步扩增表达。扩增后，通过有限稀释克隆细胞，稳定的克隆系用来产生细胞库供进一步研究用。为确证βhCG-B11构建体的表达，在还原性条件下，通过SDS-PAGE对蛋白质进行蛋白质印迹分析。观察到该融合蛋白具有预期分子量并适当装配(即既含有重链融合物又含有轻链)。准确地说，所述疫苗缀合物和所述抗体单独通过SDS-PAGE用变性条件进行分析，用蛋白质印迹分析进行检测。然后所述印迹分别用山羊抗人IgG重链和轻链和βhCG C端肽特异性的mAb(Sigma)进行探测。结果证明，转化的CHO细胞特异性表达B11-βhCG疫苗缀合物，证据为融合产物的合适的大小和组成。
实施例2B11scfv-βhCG的产生疫苗缀合物的设计通过使βhCG抗原与B11单链融合体(ScFv)连接产生第二构建体，B11单链融合体(ScFv)为结合树突细胞上的人巨噬细胞甘露糖受体并且含有完全人B11抗体VL和VH片段的单链抗体。通过基因融合方法，使所述抗原与B11ScFv的羧基端通过共价结合完成键合，如图1所示(称为B11sfv-βhCG构建体)。
B11sfv-βhCG疫苗缀合物的重组表达如图1所示，产生含有B11sfv-βhCG构建体(SEQ ID NO11和12)的质粒。采用标准化方案(Qiagen Inc，Valencia，CA)，将所得质粒构建体转染到哺乳动物细胞中。将转染细胞在含有抗生素G418的培养基中进行选择。进行ELISA以证实B11sfv-βhCG构建体的表达。
实施例3疫苗缀合物的功能特征抗体-靶向疫苗对其在APC表面的关联受体的识别是此递药平台的第一步。用流式血细胞计数研究来证实βhCG-B11和B11sfv-βhCG构建体与表达MR的培养的人DC特异性结合(图4)。
用抗MR抗体作为探针，检查人皮肤DC和各种人体组织切片中巨噬细胞上MR的原位染色。人体组织冷冻切片用抗MR人抗体B11染色。存在于皮肤表皮层的DC用B11抗体清楚地标记(数据未显示)。注意到在皮肤表皮层有与DC的结合。而且，用所有组织中的抗MR B11 HuMAb染色的树突细胞进行的免疫组织化学实验，检验并显示没有意外的交叉反应性(结果未显示)。这些研究已经用βhCG-B11重复进行，得到相同的结果。
实施例4将βhCG抗原/抗MR抗体疫苗缀合物交叉呈递给T细胞评价了βhCG-B11构建体被DC加工以将βhCG抗原经由DC上的MHC I类和II类分子呈递给T细胞(交叉呈递)的能力。具体地说，通过将正常T细胞库与暴露于所述疫苗的DC一起培养，用βhCG-B11构建体引发抗原特异性T细胞(应答)。然后，分析所得“敏化”T细胞的活性(增殖和杀伤)和特异性。通过将具有βhCG抗原的靶细胞产生的T细胞活性与抗原阴性对照进行比较，可以证明T细胞的特异性。细胞毒性T细胞(CTL)，如果存在，应当只杀伤呈递βhCG相关抗原的那些靶，而放过缺乏所述抗原或呈递无关抗原的对照靶。因为CTL介导的抗原识别总是发生在带有所述肽的给定MHC分子的情况下，阻断MHC肽-CTL与MHC特异性mAb的相互作用，从而证实I类或II类呈递。
抗原特异性效应T细胞的诱导通过将贴壁单核细胞与25ng/ml重组人GM-CSF(R&D systems，MN)和100ng/ml重组人IL-4一起培养5天，由正常供体外周血单核细胞(PBMC)产生树突细胞。第5天，收获DC(未成熟)并将其重悬于AIM-V(无血清)培养基中。将βhCG-B11免疫缀合物(20μg/ml)加入到1.2×106DC中并于37℃孵育45分钟。使荷载抗原的DC在CD40L(Peprotech，NJ；20ng/ml)存在下成熟至少24小时。洗涤成熟的DC(1×106)一次，并以1×106细胞/ml(DC∶T细胞比值，20)加入到预先接种到24孔板的T细胞(2×107；总量)中。使用下述培养条件首先在第0天，加入10ng/ml IL-7，其次在第1天，加入10ng/ml IL-10(在24小时)，最后在第2天，加入20U/mlIL-2(在48小时)。在第7、14和21天如上所述重新刺激，只是βhCG-B11的浓度减半(分别为10μg/ml、5μg/ml和2.5μg/ml)。检验T细胞(以大量或用纯化T细胞亚群)对51Cr标记的DC、荷载βhCG-B11、B11sfv-βhCG或B11的51Cr标记的DC的反应性。在HLA-特异性mAb存在下确定MHC-特异性。
如图5所示，βhCG-B11构建体诱导βhCG-特异性细胞毒性T细胞。如果T细胞用不呈递βhCG的靶培养，则不能保证杀伤。用在这些实验中的靶细靶为用βhCG-B11构建体或对照抗原处理的HLA-匹配的DC。只用抗MR抗体(B11)处理的靶细胞对细胞毒活性不敏感，证实只有所述疫苗的抗原部分能够引起CTL活性。这些结果表明βhCG-B11构建体诱导有效的CTL活性，准确地说，CTL活性针对βhCG抗原而不是靶向抗体(B11)。
而且，呈递βhCG抗原的靶的有效杀伤用纯化的CD8+T细胞再现，在抗MHC I类抗体存在下，该杀伤被阻断(图6)。具体地说，βhCG-B11构建体用来由两个供体的外周血单核细胞产生βhCG-特异性T细胞。用免疫磁珠从大量培养物中纯化CD8+和CD4+T细胞。细胞毒性试验如上所述进行，效应物∶靶比值设在40∶1。靶细胞(未成熟DC)未处理(对照)或负载βhCG-B11构建体。为证明MHC I类特异性，通过用HLA特异性抗体预孵育阻断靶细胞杀伤(W6/32)。
总起来说，这些数据(图6和图7)证实βhCG-B11构建体诱导有效的βhCG-特异性CTL的能力，也证实CTL活性由CD8+T细胞以HLA-依赖性方式介导。用纯化的CD4+T细胞没有观察到杀伤活性。
如图7所示，βhCG-B11构建体引起的T细胞在响应靶向DC的βhCG-B11构建体时增殖。具体地说，用βhCG-B11构建体处理DC，由外周血单核细胞产生βhCG-特异性T细胞。检测来自大量培养物T细胞(CD4+和CD8T细胞)在响应抗原刺激时的增殖。T细胞与未处理DC(对照)或荷载βhCG-B11构建体的DC在有或没有HLA阻断抗体存在下共同培养。为测量增殖，培养5天后，用3H-胸苷分析DNA合成。数据表示为相对于对照的增殖的倍数增长(刺激指数)。就CTL活性来看，当T细胞由DC单独刺激(即无抗原)，没有发现合适的应答。只用未缀合的抗体(抗MR B11 mAb)靶向的DC不能诱导由βhCG-B11构建体引起的T细胞的增殖。T细胞的增殖能力在抗MHCI类以及II类-特异性mAb存在下被有效阻断，证明CD4+和CD8+T细胞是感应的。这些数据显示由DC对βhCG-B11构建体的摄取使得疫苗可以进入MHC I类和II类的加工途径，该途径与带有MHC区室的MR的共区域化一致。
实施例5DC对抗MR抗体B11的内化较之于DC对甘露糖基化抗原的内化(对网格蛋白介导的内化的抑制)未成熟DC可通过胞饮或受体介导的胞吞机制吸收可溶性抗原(55)。抗原内化机制决定其细胞内命运并可影响对它的免疫应答的质量(54，55，56)。通过MR的内化被描述为快速、网格蛋白介导的内化事件(57，58)。MR本身在其胞质尾区内具有两个推定的网络蛋白靶向序列，甘露糖基化金颗粒的内化已经被EM定位到披网格蛋白小窝(58，59)。网格蛋白依赖型内吞可通过短暂高渗休克或K+排除特异性中断(61)。为了确定甘露糖基化抗原或B11结合到甘露糖受体上是否经披网格蛋白小窝内化，在B11mAb或甘露糖基化BSA存在下，将未成熟DC在含有或不含400nM蔗糖的AIM5培养基中在冰上培养30分钟。细胞随后加热到37℃并使其内化20分钟。洗涤并固定后，细胞用共焦显微镜法进行分析(数据未显示)。当B11结合到MR时，其摄取被高渗休克抑制，表明其内化机制是通过披网格蛋白小窝。甘露糖基化BSA的摄取相反，不被高渗休克抑制，表明其内化机制不依赖于披网格蛋白小窝的形成。甚至在比B11浓度高20倍的情况下，甘露糖基化BSA FITC的表面染色相对较弱。其后的研究揭示出内化的甘露糖基化BSA FITC与非特异性、液相示踪剂共定位，其中作为含有内化B11的小囊泡排除非特异性示踪剂(数据未显示)。与B11-FITC相反，甘露糖基化的BSA-FITC和液相示踪剂的摄取，通过用PI3K抑制剂渥曼青霉素预处理，而大半被阻(数据未显示)。这些结果表明绝大多数甘露糖基化BSA，通过未成熟树突细胞经非特异性大胞饮机制吸收，提示对甘露糖基化抗原的免疫应答质量可能与特异性靶向MR的抗原相差甚远。
实施例6B11sfv-βhCG与DC的结合将单核细胞驱动的DC暴露于PBS-BSA缓冲液中的B11sfv-βhCG或βhCG-B11中，于37℃持续45分钟，并在CD40L存在下，使其成熟过夜。收获的DC随后洗涤并先后用小鼠抗βhCG、山羊抗hu IgG(Fc)-PE缀合物染色。染色的细胞在流式细胞仪(BD-LSR)上进行分析。每个样品大约收集10,000个事例。背景自动荧光和同种型匹配的抗体染色用作对照。根据平均荧光强度(MFI)(数据未显示)，B11sfv-βhCG的与表达于DC上的MR的结合类似于βhCG-B11的。
实施例7对βhCG-B11构建体有特异性的CTL识别由DC呈递的抗原(B11sfv-βhCG)的scFv形式针对抗DC-呈递的βhCG-B11产生的CTL，要测试其暴露于βhCG-B11和B11sfv-βhCG的自体DC靶，同时未处理DC或暴露于B11的DC用作对照。抗原暴露后，靶用51铬标记并在一个4小时的试验中与CTL混合，该试验测量上清液中放射性的释放。在该实验中，βhCG-B11-特异性T细胞识别呈递MHC I类分子上抗原的4个靶中的2个。当DC缺少抗原时，不发生靶的杀伤(图11)。因此，DC对βhCG-B 11的摄取导致βhCG-来源的T细胞表位被CTL识别。等同实施方案仅用常规实验，本领域技术人员就会认识或者能够确定本文所述发明的具体实施方案的许多等同实施方案。这些等同实施方案包括在所附权利要求书中。
文献引用本文引用的所有专利、待审批的专利申请和其它出版物，全都通过引用整体结合到本文中。
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Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro145 150 155 160Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly165 170 175Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr180 185 190Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His195 200 205Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val210 215 220Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230<210>7<211>321<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aggtggttag cctggtatca gcagaaacca 120gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcgg cctgcagcct 240gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa a 321<210>8<211>107<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>9<211>1842
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1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg<210>31<211>285<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>31gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctggagcct 240gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accct 285<210>32<211>95<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>32Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro85 90 9权利要求
1.一种包含单克隆抗体的分子缀合物，所述单克隆抗体结合在与β人绒毛膜促性腺激素(βhCG)连接的人抗原呈递细胞(APC)上。
2.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体结合到表达于人树突细胞上的C型凝集素上。
3.权利要求1或2的分子缀合物，其中所述抗体结合到人甘露糖受体上。
4.前述权利要求中任一项的分子缀合物，其中所述抗体选自人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
5.前述权利要求中任一项的分子缀合物，其中所述抗体选自全抗体、Fab片段和单链抗体。
6.权利要求1的分子缀合物，其中所述缀合物为重组融合蛋白。
7.前述权利要求中任一项的分子缀合物，其中所述抗体包含人重链可变区，包括构架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列；和人轻链可变区，包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，其中(a)所述人重链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO15，及其保守修饰；和(b)所述人轻链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO18，及其保守修饰。
8.权利要求6的分子缀合物，其中所述人重链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO14，及其保守修饰；所述人轻链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO17，及其保守修饰。
9.权利要求7或8的分子缀合物，其中所述人重链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO13，及其保守修饰；所述人轻链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO16，及其保守修饰。
10.权利要求1的分子缀合物，其中所述抗体包含(a)源自人重链可变区(VH)5-51种系序列即SEQ ID NO30的重链可变区；(b)源自人轻链可变区κ链(Vκ-L)15即SEQ ID NO32种系序列的轻链可变区。
11.前述权利要求中任一项的分子缀合物，其中所述抗体包含人重链可变区和人轻链可变区，所述可变区包含分别示于SEQ ID NO4和SEQ ID NO8的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO4或SEQ ID NO8同源性足够高的氨基酸序列，致使所述抗体保持结合到人树突细胞上的能力。
12.一种包含人抗体重链和人抗体轻链的分子缀合物，其中任一条或两条链连接在βhCG上。
13.权利要求12的分子缀合物，其中所述重链连接在βhCG上并且包含SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
14.权利要求12或13的分子缀合物，其中所述轻链包含SEQ IDNO6中所示的氨基酸序列。
15.一种包含单克隆抗体的分子缀合物，所述单克隆抗体结合在与β人绒毛膜促性腺激素(βhCG)连接的人抗原呈递细胞(APC)上，其中所述抗体包含(a)源自人VH5-51种系序列即SEQ ID NO30的重链可变区；和(b)源自人Vκ-L15即SEQ ID NO32种系序列的轻链可变区。
16.一种包含人单链抗体的分子缀合物，所述人单链抗体结合到与β人绒毛膜促性腺激素(βhCG)连接的人抗原呈递细胞(APC)上，其中所述缀合物包含SEQ ID NO12中所示的氨基酸序列。
17.前述权利要求中任一项的分子缀合物，所述缀合物由APC内化并加工，致使T细胞介导的免疫应答是针对所述抗原产生的。
18.权利要求17的分子缀合物，其中所述T细胞应答由细胞毒性T细胞介导。
19.权利要求17或18的分子缀合物，其中所述T细胞应答由CD4+和CD8+T细胞介导。
20.权利要求17-19中任一项的分子缀合物，其中所述T细胞应答经由主要组织相容性复合体(MHC)I类和MHC II类两种途径诱导。
21.一种组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项的分子缀合物和药物可接受的载体，并任选与佐剂联用。
22.一种诱导或增强抗βhCG的T细胞介导免疫应答的方法，所述方法包括使前述权利要求中任一项的分子缀合物与APC接触，致使所述抗原以诱导或增强针对所述抗原的T细胞介导应答的方式被加工并呈递给T细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述T细胞应答由CD4+和CD8+T细胞介导。
24.前述权利要求中任一项的方法，其中所述T细胞应答由细胞毒性T细胞和/或辅助T细胞介导。
25.前述权利要求中任一项的方法，其中所述T细胞应答经由MHC I类和MHC II类两种途径将所述抗原交叉呈递给T细胞而诱导。
26.前述权利要求中任一项的方法，其中所述βhCG抗原由肿瘤细胞表达。
27.权利要求26的方法，其中所述肿瘤细胞选自结肠、肺、胰腺、乳腺、卵巢和生殖细胞来源的肿瘤细胞。
28.前述权利要求中任一项的方法，其中所述分子缀合物与所述树突细胞在体内接触。
29.前述权利要求中任一项的方法，其中所述分子缀合物与所述树突细胞在活体外接触。
30.前述权利要求中任一项的方法，所述方法还包括使所述树突细胞与刺激树突细胞增殖的细胞因子、任选粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或FLT3-L接触。
31.前述权利要求中任一项的方法，所述方法还包括使所述树突细胞与免疫刺激剂、任选抗溶细胞性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)抗体接触。
32.一种免疫受试者的方法，所述方法包括给予前述权利要求中任一项的分子缀合物、任选联用的佐剂、刺激树突细胞增殖的细胞因子和/或免疫刺激剂。
33.一种诱导或增强针对抗原的细胞毒性T细胞应答的方法，所述方法包括形成抗原与结合到抗原呈递细胞(APC)上的单克隆抗体的缀合物；和使所述缀合物在体内或活体外与APC接触，致使所述抗原以诱导或增强针对所述抗原的细胞毒性T细胞应答的方式被内化、加工并呈递给T细胞。
34.权利要求33的方法，所述方法还诱导或增强针对所述抗原的辅助T细胞应答。
35.权利要求33或34的方法，其中所述T细胞应答由CD4+和CD8+T细胞介导。
36.权利要求33-35中任一项的方法，其中所述T细胞应答经由MHC I类和MHC II类两种途径诱导。
37.权利要求33-36中任一项的方法，其中所述抗体结合到表达于人树突细胞的C型凝集素上。
38.权利要求33-37中任一项的方法，其中所述抗体结合到所述人甘露糖受体上。
39.权利要求33-38中任一项的方法，其中所述抗体选自人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
40.权利要求33-39中任一项的方法，其中所述抗体选自全抗体、Fab片段和单链抗体。
41.权利要求33-40中任一项的方法，其中所述抗体包含人重链可变区，包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列；和人轻链可变区，包括FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，其中(a)所述人重链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO15，及其保守修饰；和(b)所述人轻链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO18，及其保守修饰。
42.权利要求41的方法，其中所述人重链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO14，及其保守修饰；所述人轻链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO17，及其保守修饰。
43.权利要求41或42的方法，其中所述人重链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO13，及其保守修饰；所述人轻链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO16，及其保守修饰。
44.权利要求41-43中任一项的方法，其中所述抗体包含人重链可变区和人轻链可变区，所述可变区包含分别示于SEQ ID NO4和SEQ ID NO8的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO4或SEQ ID NO8同源性足够高的氨基酸序列，致使所述抗体保持结合到树突细胞上的能力。
45.权利要求33-44中任一项的方法，其中所述抗原由肿瘤细胞或病原生物体表达。
46.权利要求33-45中任一项的方法，其中所述抗原选自βhCG、Gp100、前列腺相关抗原和Pmel-17。
47.权利要求33-46中任一项的方法，所述方法还包括使所述树突细胞与佐剂、刺激树突细胞增殖的细胞因子和/或免疫刺激剂接触。
48.权利要求33-47中任一项的方法，其中将所述缀合物体内给予受试者。
49.权利要求48的方法，其中所述受试者获得针对所述抗原的免疫力。
全文摘要
本发明提供了新型抗体疫苗缀合物以及用其诱导细胞毒性T细胞(CTL)应答的方法。在一个具体的实施方案中，该疫苗缀合物包括连接在抗甘露糖受体(MR)抗体上的人绒毛膜促性腺激素β亚单位(βhCG)抗原。
文档编号C12P21/08GK1767852SQ200480008178
公开日2006年5月3日 申请日期2004年1月30日 优先权日2003年1月31日
发明者T·克勒, M·恩德雷斯, L·何, V·拉马克里什纳 申请人:塞尔德克斯医疗公司