专利名称：选择性产生雄性或雌性不育植物的方法
作物中的杂种优势可具有显著的提高产量的效应。通常，与非杂交品种相比，杂种表现出增加的产量。杂种通常给生长因素例如水和肥料以更高的回报单位。杂种通常提供更优的逆境耐受性、在产量和成熟上的一致性，并且也提供简单的将以其它方法可能难以组合的特征或性状组合起来的育种机会。植物中的杂种优势通常大到足以保证商业利用。商用杂种被广泛地应用于许多作物中，包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和油菜(canola)。然而，主要由于缺乏经济的杂交种子生产方法，小麦、大麦和水稻仍然主要以近亲交配繁育。
常规上，杂交种子的生产包括分区种植雌性和雄性亲本系并且只能从雌性亲本收获种子。为确保该种子是杂种，必需通过使雌性系产生雄性不育从而将雌性亲本的自体受粉减少到最小。用于使雌性亲本系雄性不育的方法包括机械的、化学的和遗传的方法。在雌雄异体的植物例如玉米中，可很容易地通过除去雄性花序机械地获得雄性不育。然而绝大部分作物是雌雄同株并且在同一朵花中具有雄性和雌性器官，这使得这种物理去雄不具实用性。因此有时使用遗传方法。
发生的遗传雄性不育性状通常是由核基因控制的，其中相对于对应的与能育性相关的等位基因，与雄性不育表型相关的等位基因通常是隐性表达的。在遗传雄性不育发生时其通常与单个隐性基因相关，所述稳性基因必需是纯合的这样雄性不育才得以表达。为了在实践中应用这种遗传雄性不育性状，育种家通常培育表型一致的雌性系，所述雌性系分离成雄性不育和雄性可育植物。需要除去雄性可育植物(一旦鉴定)，这是项费力的工作。因为雄性可育植物对保持群体是必需的，所以不能从群体中将其清除，从而使得保持亲本系一直成问题。除了依赖天然存在的雄性不育等位基因外，也可能使用分子生物学方法。可通过基因工程改造植物，使其表达例如反义或核酶基因，所述基因可降低或消除可育花粉形成所必需的关键基因的表达。这种转基因植物系是雄性不育的并且通过与来自雄性可育植物的花粉杂交可用来生产杂交种子。这些系的主要问题是通过与等基因可育系杂交，其只能在后代中以杂合状态保持。当产量非常重要时，这在杂交种子生产中可能是个问题。尽管例如通常将除草剂抗性与雄性不育联系起来，就可能选择性地除去雄性可育植物，但这要确保所述植物一开始要以相当高的密度种植。
使用用于商业杂种生产的细胞质雄性不育要求有稳定的雄性不育细胞质和花粉来源。雄性不育细胞质遗传系统要求用于杂种生产的三种类型的系存在，A系(细胞质雄性不育系)、B系(雄性可育保持系)和R系(具有恢复基因的雄性可育系)。用该系统产生的三系杂交涉及4系的保持和生产，近亲交配的A和B系和另外两系的雄性可育近亲交配。对单一雄性不育细胞质来源的依赖性可使育种的灵活性降到最低并且导致后代大规模地对特定疾病的易感性。
也可通过使用抑制有活力的花粉形成的化学物质生产杂交种子。这些化学物质(称为杀配子剂)用于提供瞬时雄性不育。但是杀配子剂的费用、注册和可靠性已限制其使用。
常规的杂种种子生产系统的缺点是需要分行或分区种植雄性和雌性亲本系。在释放少量不能随风传播较远的花粉的作物例如小麦中，低效率的授粉是尤其迫切的问题。在这些作物中多达三分之二的杂种生产田地需要供给雄性花粉供体植物，从而使得杂交种子生产变得很不经济。
为了在小麦或其它作物中获得更经济的杂交种子生产，需要将雄性和雌性植物移得更近以更有效地传授花粉；最有效地是在同一行中将雄性和雌性在数厘米内间作。在这种系统中只收获来自(雄性不育)雌性亲本的种子是不现实的。通过在种植混合物中使用尽可能低的这种雄性亲本植株和/或通过使用雌性不育的雄性植株可最大限度地减少来自雄性亲本的非杂交种子的污染。用于构建显性雌性不育系的方法已在(EP412，006A1(1990)；Goldman等人，(1994)EMBO.J.，13，2976-2984)中描述，但对于雄性不育系，其必须以杂合子保持。
因此，存在着对用于生产杂交种子的简单经济的方法的需要。特别是为了有效地生产杂交种子，存在着对提供雄性不育雌性亲本系和雌性不育雄性亲本系的需要，它们可容易地以纯的纯合系保持和用于有效地生产杂交种子。在本领域中描述的用于实现该目的的方法包括从雄性和雌性亲本系生产杂交种子的方法，在所述雄性和雌性亲本系中至少有一个包含优选地在花组织中表达的异源嵌合基因，所述嵌合基因使得所述株系条件性地不育，所述不育依赖于外源非毒害植物的物质的施用，所述非毒害植物的物质可通过由所述异源嵌合基因编码和优先地在雄性或雌性生殖结构中表达的酶特异性和局部地转化成毒植物素。所述非毒害植物的物质可以是前除草剂(pro-herbicide)。具有这种条件性不育亲本系的有利方面是允许其以不育性状的纯合体保持。能育性只是在施用外源非植物毒性物质时被破坏。在一个这样的条件性雄性不育系统的例子中，编码脱乙酰基酶的基因(见例如US6555733)优先地在雄花组织的绒毡层细胞中表达，在所述细胞中其将外源施用的前除草剂N-乙酰L膦丝菌素转化成毒植物素L膦丝菌素，从而阻止了有活力的花粉形成。或者该酶表达于柱头细胞中，前除草剂N-乙酰基L膦丝菌素的施用阻止了有活力的种子的形成。在进一步类似的例子子中(i)绒毡层优先地表达的细菌细胞色素P450催化前除草剂R7402转化成阻止有活力的花粉形成的磺脲毒植物素；和(ii)绒毡层优先地表达的膦酸单酯水解酶催化甘油草甘膦前除草剂转化成阻止有活力的花粉形成的毒植物素草甘膦。WO 98/03838描述了条件性雌性不育系统的例子，其中能够将所述前除草剂转化成植物毒素的酶优先地在雌性生殖结构中表达。
尽管存在这些用于生产条件性不育的雄性和雌性亲本系的方法，杂交种子的生产在作物例如小麦中仍然远不是常规的技术。本发明特别涉及到在本领域内提高条件性雄性不育的雌性亲本系和条件性雌性不育的雄性亲本系的生产。
化学杂交剂和前除草剂很昂贵，因为其不能大规模生产。使用相对便宜的已经注册的物质例作为商业可购得的除草剂作为化学杂交剂是想要的。这也会达到更好的效果，因为可在单一的喷施应用中将杂草控制与化学杂交相结合。
本发明提供了产生雄性或雌性不育植物的方法(包括提供灭活除草剂的手段)和用于再激活如此灭活的除草剂的手段，其中在营养组织中提供灭活除草剂的手段而在植物的雄性或雌性生殖结构中提供再激活手段，这样当对植物施用除草剂时就能使营养结构而非生殖结构免受除草剂的毒害植物活性。所述手段可以是任何，其中手段是酶。本发明方法的优选的实施方案包含用多核苷酸转化植物材料和再生所得的转化材料成植物的步骤，所述多核苷酸编码能够N-乙酰化L-膦丝菌素的第一酶和能够水解N-乙酰L-膦丝菌素或从N-乙酰L-膦丝菌素除去乙酰基团从而产生L-膦丝菌素的第二酶，其中所述第一酶只在植物的绿色组织中表达，其中对植物叶片施用L-膦丝菌素直到雄性或雌性配子形成和/或成熟时，这样所述植物基本上不受到除草剂施用的损害，其中所述第二酶优先地在雄性或雌性生殖结构中表达，这样在这些组织中选择性局部产生L-膦丝菌素阻止了所述配子体的形成或使其无功能。
如上面所指出的，在优选的方法中，所述除草剂是L膦丝菌素，所述非毒害植物的物质是N-乙酰L膦丝菌素，所述灭活性酶是膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)，所述激活性酶是任何能够水解N-乙酰L膦丝菌素的酰胺酶(例如argE基因产物，US6555733等)。在其它优选的实施方案中，PAT酶在质体蓝素启动子区域的有效控制之下表达。因此，本发明提供了使用相对便宜的商业可购得的除草剂作为杂交剂和同时提供在杂交种子生产田中控制杂草从而提高杂交作物的有效性和产量的方法。
即使在上面提供本发明的方法，仍有其它关于使用所述除草剂作为在F1代植物中控制杂草的方法的问题需要解决，所述F1代植物产生于由前面方法提供的杂交种子。该代作物至少包含两个编码使除草剂失活和能够提供对除草剂抗性的基因(各来自各亲本)。所述除草剂也可用于在F1代作物中选择性控制杂草，这也是想要的。然而，由于两个编码激活性酶的在叶片表达的基因的存在，在对所述作物施用所述除草剂后，所述F1代作物表现出对所述除草剂的营养耐受性但具有极少或减少的谷物产量。
因此，本发明提供了其它方法，其中所述失活性酶另外地在花启动子控制下表达，这样其基本上只在绿色组织和在生殖组织中表达，所述生殖组织不是使其配子失去功能的生殖组织。在杂交作物中，这种失活性酶在花组织中的共表达抵消了激活性酶的效应，从而防止了因施用除草剂而造成的产量损失。因此本发明提供了克服使廉价商业除草剂膦丝菌素能够用于杂草控制和在例如杂交谷物生产中用作杂交试剂的问题的方法，此外，所述方法提供了所得的F1代杂交谷物或水稻，在所述作物中可安全地将膦丝菌素(或L膦丝菌素)用于杂草控制而基本上没有产量损失。作为进一步的利益，更加容易管理产自F1代自交种子(可在随后的作物中产生自生植物(volunteer))的F2代植物，因为如果喷施控制量的膦丝菌素其自身通常是不育的(或具有显著降低的生育力)。对于F1代植物与野草(例如红米)或其它谷类作物的花粉异型杂交的后代也是如此。
在一个实施方案中，本发明提供了方法，其中以合适的比例在田间将雌性和雄性亲本系一起间作并以合适的0.05至10kg/ha的比例和在合适的时期喷施膦丝菌素以最优化杂交种子的产量。任选地，如此产生的杂交种子产生在营养和生殖上基本上都对除草剂膦丝菌素的施用具有耐受性的F1后代，从而所述除草剂可用于杂草控制。这种杂交种子也具有有利方面其表达的除草剂耐受性性状只能部分地传递给将来的自交后代或异型杂交入相关的杂草中。
本发明涉及改进用于作物杂交种子生产的方法。特别是本发明涉及从雄性和雌性亲本系生产杂交种子的方法，所述亲本系是依赖于外源施用除草剂的条件性雌性或雄性不育，其中两个系都基本上对所述除草剂具有营养上的耐受性，其中在以使自体受精降到最低或受到阻止的时间和以足够的量施用所述除草剂。本发明也涉及产生条件性雄性或雌性不育植物的方法，通过i)用一个或多个嵌合基因转化植物材料，所述嵌合基因编码能够将除草剂转化成非毒害植物的物质的失活性酶和能够将所述非毒害植物的物质转化成除草剂的激活性酶。所述激活性酶在一个或多个启动子的有效控制之下表达，在条件性雄性不育植物的情况下，所述启动子导致所述酶基本上只在雄性生殖结构中表达，或在条件性雌性不育植物的情况下所述启动子使所述酶基本上只在雌性生殖结构中表达。所述失活性酶在启动子区域的有效控制之下表达，所述启动子区域导致基本上只在绿色组织中表达，或任选地在两个或更多个启动子区域有效控制之下表达，从而所述失活性酶另外地在花启动子控制之下表达，这样其基本上只在绿色组织和在除了使其配子在其中失去功能的生殖组织以外的生殖组织中表达。将所述植物材料再生成形态学正常的能育植物，所述植物是条件性雄性或雌性不育植物。本发明也包括使用条件性雄性不育植物和条件性雌性不育植物生产更有效的杂交种子，使用膦丝菌素作为杂交剂、使用某些嵌合基因和使用这些嵌合基因产生杂交种子。本发明也提供了条件性雄性不育、条件性雌性不育植物，这些植物的种子和由所述方法产生的杂交种子。在本发明的优选的实施方案中，用于生产杂交种子的方法的作物是玉米、水稻、高梁、小麦粟、燕麦、油菜和大麦。
术语表定义此处所用的‘脱乙酰酶’或‘酰胺酶’是指任何能够水解N-乙酰L膦丝菌素的酶。
此处所用的‘基因’是指任何包含几个有效地连接的DNA片段例如启动子和5’调节区域、编码序列以及包含聚腺苷酸化位点的非翻译3’区域的DNA序列。
当涉及基因或DNA序列时，‘嵌合的’用于表示在自然界中，所述编码序列与启动子或与基因中的至少一个其它DNA调节区域不相关的事实。
如此处所用的，‘嵌合基因’是指一种基因，其中在自然界中基因的编码序列与启动子或与所述基因中的至少一个其它DNA调节区域不相关。
此处所用的‘表达盒’是指包含嵌合基因的可翻译的DNA区域，所述嵌合基因的侧翼连接着一个或多个限制性或其它位点，所述位点有利于从一个DNA座位的精确切割和插入另一个座位。
‘非毒害植物的物质’在本发明中是指对用于本发明方法的植物、任何特定的作物的细胞或组织相对无植物毒害的物质。非毒害植物的物质不必在所有植物的所有组织中是非毒害植物的。
‘雌性生殖结构’是指雌性配子和专门负责雌性配子产生、成熟和生存力的植物部分。通常其包含植物的这些部分，所述部分包括心皮或雌蕊(“花柱”)。植物的心皮包括但不限于柱头、花柱、子房和由柱头、花柱和子房包含的细胞或组织。
‘雄性生殖结构’是指雄性配子和专门负责雄性配子产生、成熟和生存力的植物部分。其包括植物的这些部分，所述部分包括例如小孢子、雄蕊、绒毡层、花药和花粉。
此处所用的‘雌性不育植物’是在用有功能或有活力的花粉授粉后不能支持有活力的种子形成的植物。这种雌性不育可以是育种选择或转基因存在造成的。‘条件性雌性不育植物’是指在正常生长条件下是雌性可育的而在特定的条件下可变成雌性不育的植物。在本发明中这种‘雌性不育植物’或‘条件性雌性不育植物’保持雄性可育并能产生有活力的花粉。
此处所用的‘雄性不育植物’是不能支持有活力的花粉形成的植物。这种雄性不育可能是育种选择或转基因的存在造成的。‘条件性雄性不育植物’是指在正常条件下是雄性可育的而在特定条件下可变成雄性不育的植物。例如，所述条件可以包括物理去雄或施用特定的化学杀配子剂。在本发明中这种‘雄性不育植物’或‘条件性雄性不育植物’保持雌性可育并能在用有功能或有活力的花粉授粉后产生有活力的种子。
此处所用的‘启动子区域’是DNA区域，所述DNA区域至少包含功能性启动子和任选地一些或所有与其相关的上游调节序列(包括增强子序列)和/或相关的下游序列(包括一些或所有相对于启动子为内源的基因的5’非翻译区域)。
此处所用的‘间作’是指在田间种植种子或植物的方法，所述方法确保由雄性可育植物充分地给雄性不育或条件性雄性不育植物异花传粉。通过在种植植物之前以不同的混合比例(80/20；90/10；等)随机地混合雌性和雄性亲本种子或通过以不同种子交替播种的特定的田间模式种植来实现该方法。当要求从不同植物中分开收获时，以交替的区或行种植植物是优选的。在本发明的方法中，所述除草剂可以和至少一种其它的物质混合使用，所述其它物质可选自氨基酸、安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导剂、细胞色素P450诱导剂、肥料、除草剂、杀线虫剂、增效剂、杀虫剂、杀真菌剂、激素、植物生长调节剂和细胞色素P450抑制剂。
任选地可进一步突变和选择编码用于本发明的酶的DNA序列以产生进一步有用的具有提高的效力的酶。于是许多酶的特性得到了提高，所述特性包括对想要的底物的催化活性(kcat/Km)、温度稳定性和pH的最适合值。用于产生、筛选和选择这些改进了的变体的方法是熟知的。例如，通过诱变(例如通过将DNA通过DNA复制易于出错的细菌或醇母株系例如大肠杆菌XL1 red进行传递、通过UV、化学或靶向的寡核苷酸PCR诱变)的方法产生合适的变体DNA序列。特别地通过许多可选择的DNA重排或‘有性PCR’方法(如，WO 00/61740中从28至41页中所概述的，此处引用作为参考)中的任一种产生这类基因。许多方法适合用于筛选这些改进了的基因。在合适的宿主细胞例如大肠杆菌或酵母中可合适地表达基因并且可通过使用合适的测定法例如此处所描述的测定法选择改进了的基因。
编码用于本发明的失活性酶的嵌合基因可各自包含编码一个有效地连接5’启动子区域的所述酶，所述失活性酶能够将除草剂转化为非毒害植物的物质，所述启动子区域优选地指导基因基本上只在植物的绿色组织中表达。这种表达的特异性确保除草剂失活基本上只在绿色组织中发生，从而想要消除的除草剂组织杀伤效力没有受到损害，通过激活性酶在形成配子的局部组织内选择性表达从非毒害植物的物质局部地重新产生所述除草剂的组织杀伤效力。除了启动子区域外，本发明的嵌合基因也包含3’转录终止子序列。其负责转录的终止和正确的mRNA聚腺苷酰化。许多这样的3’转录终止子序列在本领域是已知的并且适合用于本发明的嵌合基因。在特定的实施方案中所述3’转录终止子序列选自CMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶(nos)终止子和豌豆rbcS E0终止子。在特定的实施方案中，所述除草剂是L-膦丝菌素而所述失活性酶是PAT，其是本领域熟知的能够催化L膦丝菌素N-乙酰化的酶。例如合适的PAT酶和编码其的序列描述于EP257542(Streptomyces viridichromogenes PAT酶)、EP617121、EP297618、EP290986(产碱菌属PAT酶)、EP275957(最优化的链霉菌基因)。在其它特定的实施方案中，所述5’启动子区域是或来源于质体蓝素基因的启动子区域并且可以例如来源于大麦质体蓝素基因(EMBLZ28347)5′的大约1kb启动子区域，所述5’启动子区域优选地指导基因基本上只在植物的绿色组织中表达。
编码用于本发明的激活性酶的嵌合基因可各自包含编码一个有效地连接5’启动子区域的所述酶，所述激活性酶能够将由于失活性酶对除草剂的活性作用造成的非毒害植物的物质转化成除草剂，所述5′启动子区域优选地指导基因在雄性或雌性生殖结构中表达。这种表达的特异性确保所表达的酶的效应只在形成有活力的种子或有活力的花粉所必需的局部组织和细胞内产生作用，并且除了其在非毒害植物的物质存在的情况下对能育性的影响外对所述植物没有毒害。除了启动子区域外，本发明的嵌合基因也包含3’转录终止子序列。其负责转录的终止和正确的mRNA聚腺苷酰化。许多这样的3’转录终止子序列在本领域是已知的并且适合用于本发明的嵌合基因。在特定的实施方案中所述3’转录终止子序列选自CMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶(nos)终止子和豌豆rbcS E0终止子。在特定的实施方案中，所述激活性酶是能水解N-乙酰-L-膦丝菌素的酰胺酶。例如所述酶是描述于美国6,555,733的N-乙酰谷氨酸脱乙酰酶(deac 1)(任选地进一步突变和选择以提高有关N-乙酰膦丝菌素的底物特异性)。可选择地所述脱乙酰酶基因可以是任何一个许多描述于文献和例如描述于EP 942965和EP 531716B1中的基因。
此外，任选地，编码用于本发明的失活性酶的嵌合基因可各自包含编码其中一个所述酶的DNA序列，所述DNA序列有效地连接优选地指导其在雄性或雌性生殖结构中表达的5’启动子区域，所述失活性酶能够将除草剂转化成非毒害植物的物质。选择这种表达的特异性以确保所表达的酶的效应只在形成有活力的种子或有活力的花粉所必需的组织和细胞(除了想要通过所述激活性酶的局部表达以消除其的组织和细胞外)位点内发挥作用。换句话说，如果所述激活性酶在形成雄配子的组织中表达以产生条件性雄性不育植物，那么除了在绿色组织中外，只在形成雌配子的组织中表达所述失活性酶。选择失活性酶优选地在花中表达的局部组织位点和时间以使其不损害所述激活性酶在用于杂交的条件性雄性不育亲本系中使配子不育的效应，但抵消任何在F1杂交后代中激活性酶表达的潜在不育效应。理想地，将用于影响激活性酶在雌性亲本系的雄花组织中表达的相同5’启动子区域用于驱动失活性酶在雌性亲本系中表达。类似地，将用于影响激活性酶在雄性亲本系的雌花组织中表达的相同5’启动子区域用于影响失活性酶在雄性亲本系中表达。除了启动子区域外，本发明的嵌合基因也包含3’转录终止子序列。其负责转录的终止和正确的mRNA聚腺苷酰化。许多这样的3’转录终止子序列在本领域是已知的并且适合用于本发明的嵌合基因。在特定的实施方案中所述3’转录终止子序列选自CMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶(nos)终止子和豌豆rbcS E0终止子。
适合用于所述嵌合基因的某些实施方案的5’启动子区域包含优选地在雌花组织中表达的基因的5’区域。在某些实施方案中5’启动子区域选自烟草的stig 1启动子(Goldman等人，(1994)EMBO J.，13，2976-2984)、经修饰的S13启动子(Dzelkalns等人(1993)PlantCell，5，8555)、AGL5启动子(Savidge等人(1995)Plant Cell，7，721-733)和玉米心皮特异性ZAG2基因的5’启动子区域(Thiessen等人(1995)Gene，156，155-166)。任选地，从基因组DNA的编码序列的上游区域获得进一步合适的启动子区域，所述基因组DNA的编码序列对应于本领域已知的优选地在雌性生殖结构中表达的cDNA序列。在某些实施方案中这类探针cDNAs选自拟南芥Fbp7和Fbp11基因(Angenent等人，(1995)Plant Cell，7，1569-1582)和兰花特异性cDNAs O40、O108、O39、O126和O141(Nadeau等人，(1996)PlantCell，8，213-239)。在特定的实施方案中包含与雌性生殖结构中优先表达相关的基因组DNA的5’启动子区域选自基因组DNA克隆pSH64(具有保藏号NRRL B-21920)、与cDNA P26-A4(具有保藏号NRRL B-21655)杂交的pCIB10302基因组克隆和与cDNA克隆P19-QA(具有保藏号NRRLB-21919)杂交的基因组DNA克隆X2-1。在特定的实施方案中，这些启动子区域包含WO 98/39462中的SEQ ID No.11的核苷酸1至1390、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的核苷酸1至1093。在其它实施方案中，通过本领域技术人员熟悉的方法分离和克隆适合用于本发明的嵌合基因的5’启动子区域。例如，通过从组织例如玉米穗丝或小麦雌蕊中分离RNA，接着使用技术例如差示显示、PCR选择性cDNA扣除和扣除cDNA文库构建进行差示筛选来鉴定在雌性生殖结构中表达的新转录物。cDNA克隆优选地在雌性组织而不在其它植物部分例如叶、根和穗中表达。任选地通过Northern印迹杂交进一步确定表达的组织特异性。将所述cDNA克隆用作基因组文库筛选的探针。从基因组DNA克隆中获得与组织特异性表达相关的5’启动子区域和任选地3’非翻译DNA区域，并用于构建用于优选地在雌性生殖结构中表达的嵌合基因。
适合用于所述嵌合基因的某些实施方案的5’启动子区域包括优选地在雄花组织中表达的基因的5’区域。这些包括在花粉、绒毡层或花药中的其它结构中表达的启动子区域。在某些实施方案中，这些5’启动子区域选自LAT52启动子(Twell等人，(1989)Dev.，109，705-713)、番茄A127启动子(Dotson等人，(1996)Plant J.，10，383-392)、玉米Zmg启动子(Hamilton等人，(1989)Sex.PlantReprod.2，208-212)、玉米CDPK启动子(Guerro等人，(1990)Mol.Gen.Genet.，224，161-168)和USP 5477002中公开的花药特异性ant32和ant43D启动子，此处引用其全文作为参考。在某些实施方案中，所述5’启动子区域选自来自玉米的绒毡层特异性启动子CA55(WO92/13956中描述的“Pca55”)、来自水稻的绒毡层特异性启动子E1(USP5639948中所描述的)、来自水稻的绒毡层特异性启动子T72(USP5639948中所描述的)、来自水稻的RA8花药特异性启动子(EMBL/Genbank检索号AF042275；Jean Js等人，(1999)PMB，39，35-44)、花药特异性Tapl启动子(Spena等人(1992)Theor ApplGenet 84，520-527)和来自玉米的ZmC5-花粉特异性启动子(EMBL/Genbank检索号Y13285；Wakeley等人，(1998)PMB，37，187-192)。任选地，从基因组DNA的编码序列的上游区域获得合适的启动子区域，所述基因组DNA的编码序列对应于本领域已知的优选地在雄性生殖结构中表达的cDNA。在某些实施方案中这种探针cDNAs选自兰花花粉管特异性细胞色素P450基因(Nadeau等人，(1996)PlantCell，8，213-239)、拟南芥Bcpl基因(Xu等人(1995)P.N.A.S.，92，2106-2110)和玉米的雄花特异性MFS14基因(Wright SY等人，(1993)Plant J，3，41-49)。在其它的实施方案中，通过本领域技术人员熟知的方法分离和克隆适合用于本发明的嵌合基因的其它5’启动子区域。例如，通过从组织例如穗、花粉管、花药或绒毡层中分离RNA，接着通过使用技术例如差示显示、PCR选择性cDNA扣除和扣除cDNA文库构建进行差示筛选来鉴定在雄性生殖结构中表达的新转录物。分离优选地在雄性组织但不在其它植物部分例如叶、根和柱头表达的cDNA克隆。任选地通过Northern印迹杂交进一步确定表达的组织特异性。将所述cDNA克隆用作基因组文库筛选的探针。从基因组DNA克隆中获得与组织优先表达相关的5’启动子区域和3’非翻译DNA区域，并将其用于构建用于优选地在雄性生殖结构中表达的嵌合基因。
其它用于本发明的嵌合基因的启动子区域包括水稻的Osmads 13基因、水稻花药的OSG基因和水稻的YY2基因的上游区域。通常，在雄性或雌性生殖结构中产生高水平的、早期的、持续的和优先的表达的启动子区域被选作最合适的启动子。启动子区域也可进一步包含相互之间组合和与增强子区域一起的嵌合组合。
嵌合基因可任选地包含区域，所述区域紧接在编码激活性或失活性酶的DNA序列前面，所述区域编码能够将所述酶靶向亚细胞器例如叶绿体、过氧化物酶体或线粒体的肽序列，并且所述靶向蛋白可以具有(i)叶绿体转运肽或(ii)叶绿体蛋白-叶绿体转运肽的叶绿体转运肽-N端部分的序列。在某些实施方案中，转运肽序列可选自Nicotinia plumbaginifolia线粒体ATP合酶的β亚基、线粒体特异性NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶、呼吸链复合物I的NADPH结合亚基和酵母线粒体色氨酰-tRNA-合成酶的内源转运肽序列(WO 6121513)。
用于本发明方法的多核苷酸可包含一个或多个编码激活性和失活性酶的嵌合基因。任选地这些多核苷酸还包含其它基因和嵌合基因，例如嵌合标记基因。此处使用的嵌合标记基因包含在植物细胞中具有活性的启动子控制之下表达的标记DNA。所述标记DNA编码RNA、蛋白质或多肽，当所述物质在植物、植物组织或植物细胞中表达时，可使这种植物材料与不表达所述标记DNA的植物材料区分开来。标记基因的例子有为细胞提供特异性颜色的基因例如A1基因(Meyer等人(1987)Nature 330，667)或使植物细胞抵抗使用抗生素(例如，编码对艮他霉素抗性的aac(6’)基因，WO 94/01560或提供对潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因)或除草剂(除了用于在杂交种子生产中影响条件性雄性和/或雌性不育的除草剂外)例如草甘膦(例如USP 5510471和WO 00/66748中的EPSPS基因)、甜菜宁(例如USP5347047；USP5543306中的pmph基因)、膦丝菌素(PAT)、溴苯腈(例如USP 4810648中描述的基因)、磺酰脲(例如EP 0360750中描述的基因)、茅草枯(WO99/48023中描述的基因)、氨腈(WO98/48023；WO 98/56238中描述的基因)进行致死选择的基因。在本发明的多核苷酸(包含作为标记基因的附加除草剂抗性基因)的优选的实施方案中，所述除草剂是用于作物中控制杂草的除草剂，此外，充分表达除草剂抗性基因以提供对田间比率的所述除草剂以充足的耐受性。在其它优选的实施方案中，所述附加的除草剂是草甘膦并且所述除草剂抗性基因是EPSP合酶。然而所述标记基因可以是提供正选择的基因，其中所述标记基因编码在特定的介质中给转化的植物细胞提供正代射作用有利方面的酶。USP5767378描述了许多合适的正选择系统和基因。
当本发明的多核苷酸包含附加的除草剂抗性基因时，对以充分密度间作的作物植株外源地施用所述除草剂以消除来源于非转基因的自体受精亲本植株的非杂交种子的产生。在优选的实施方案中所述附加的除草剂是草甘膦或其农学上有用的盐，而所述除草剂抗性标记基因选自WO 00/66748中描述的草苷膦抗性提供基因。
当标记基因存在时，也提供了用于除去所述标记基因的手段。例如在决定组合性状时，这是想要的。包含标记基因的多核苷酸可任选地包含特异性重组酶的特异性识别位点，所述位点位于所述标记基因侧翼并允许所述序列被“剔除”。将携带这种经侧翼连接的标记基因的植物与携带编码相应的特异性重组酶的基因的植物杂交导致所述标记从其中被特异性切除的后代植物。合适的这类位点特异性同源重组系统的例子是flp/frt系统(Lyznik等人，(1996)，Nucleic AcidsRes.24，3784-3789)和Cre/Lox系统(Bayley，C.C.等人，(1992)PMB，18，353-361)。
用于本发明方法的多核苷酸可任选地包含一个或多个位于编码蛋白的序列的5’非翻译区域内的翻译增强子。本领域技术人员知道这类合适的翻译增强子，例如来源于TMV的Omega和Omega引物序列以及来自烟草蚀纹病毒的翻译增强子，和知道如何可将这些翻译增强子导入所述多核苷酸以提供想要的增加的蛋白表达结果。其它例子包括来源于玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒(Gallie等人，(1987)Nucl.Acids Res.，15，8693-8711；Skuzeski等人，(1990)PMB.，15，65-79)的翻译增强子。为进一步最优化来自嵌合基因和嵌合标记基因的蛋白的表达，所述多核苷酸也可进一步包含元件例如增强子、支架附着区域(SARS或MARS)和内含子。已显示当基因的5’非翻译区域包含各种内含子序列和任选地当各种内含子序列用于本发明的嵌合基因中时，各种内含子例如玉米adh1内含子1增强表达。
根据本发明已转化的表现想要的雄性/雌性不育特征的植物也可用多核苷酸转化，所述多核苷酸酸包含编码能够为包含其的植物材料提供至少一种下列农艺学性状的区域，所述性状是对昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、逆境、dessication和除草剂的抗性。
除草剂抗性提供基因可以例如选自编码下列蛋白的序列草甘膦氧化酶(GOX)、EPSP合酶、羟苯基丙酮酸二氧化酶(HPPD)、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、细胞色素P450、乙酰CoA羧化酶(ACCase)、乙酰乳酸合酶(ALS)、原卟啉原氧化酶(PPO)、二氢蝶酸合酶、多胺转运蛋白、过氧化物岐化酶(SOD)、溴苯腈腈水解酶，八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、获自真氧产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)的tfdA基因产物和已知的所述蛋白的诱变或其它修饰产生的变体。仔细地考虑用于影响条件性不育的除草剂的性质以及激活性和失活性酶的性质后，本领域技术人员认识到需要选择这些基因和驱动其表达的启动子。在所述多核苷酸提供多种除草剂抗性的情况下，这些除草剂可选自二硝基苯胺除草剂，三唑并嘧啶、尿嘧啶、苯基脲、三酮、异噁唑、N-乙酰苯胺、噁二唑、triazinone、N-磺酰苯胺、酰胺、N-酰苯胺、isoxaflutole、flurochloridone、哒草伏和三唑啉酮(triazolinone)类型除草剂，并且萌后(post-emergence)除草剂选自草甘膦和其盐、草铵膦、磺草灵、灭草松、双丙氨膦、除草定、稀禾定或其它的环己二酮、麦草畏、蔓草磷、胺草唑、苯氧基丙酸、喹禾灵或其它芳氧基苯氧基丙酸、毒莠定、fluormetron、butafenacil、莠去津或其它三嗪、嗪草酮、氯嘧黄隆、绿黄隆、flumetsulam、halosulfuron、sulfometron、灭草喹、咪草烟、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、氟磺胺草醚、乙羧氟草醚、KIH9201、ET751、carfentrazone、mesotrione、sulcotrione、百草枯、敌草快、溴苯腈和噁唑禾草灵。
在所述多核苷酸包含编码杀虫剂蛋白的序列的情况下，这些蛋白可选自来源于Bt的晶体毒素(包括分泌的Bt毒素例如称作“VIP”的毒素)、蛋白酶抑制剂、凝集素和Xenhorabdus/光状杆菌属毒素。提供真菌抗性的基因可选自编码已知的AFPs、防卫素、壳多糖酶、葡聚糖酶和Avr-Cf9的基因。特别优选的杀昆虫蛋白是cryIAc、cryIAb、cry3A、Vip1A、Vip1B、Vip3A、Vip3B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和雪花莲凝集素。在所述多核苷酸包含提供细菌抗性的基因的情况下，这些基因可选自编码杀菌肽和techyplesin和其类似物的基因。病毒抗性提供基因可选自编码病毒衣壳蛋白、运动蛋白、病毒复制酶的基因和反义以及核酶序列，已知所述核酶序列提供针对病毒的抗性；而提供逆境、盐和干旱抗性的基因可选自编码谷胱甘肽S转移酶和过氧化物酶的基因、构成已知的CBF1调节序列的序列和已知的提供海藻糖积累的基因。
可“修饰”用于本发明的多核苷酸以增强其包含的蛋白编码序列的表达，例如可除去mRNA不稳定性基序和/或偶然的拼接区或可使用作物优选的密码子以使所得的经修饰的多核苷酸在植物中表达产生基本相似的蛋白，所述蛋白具有与生物体中未经修饰的多核苷酸的蛋白编码区域表达所获得的蛋白基本相似的活性/功能，在所述生物体中这些未经修饰的多核苷酸区域是内源多核苷酸。经修饰的多核苷酸和内源地包含于所述植物中并编码基本相同蛋白的多核苷酸之间的同一性程度可以防止经修饰的和内源序列之间的共抑制。在这种情况下，序列之间的同一性程度应当优选地低于大约70％。此外可以修饰翻译起始位点周围的序列以使其是“Kozack优选的”。其代表的意义对本领域技术人员来说是熟知的。
本发明进一步包括形态学正常的条件性能育的完整植物，所述完整植物由使用本发明的核酸转化的材料再生的植物杂交而产生，所述核酸从而提供这种性状。本发明也包括所得植物的后代、其种子和部分。
本发明的植物可选自田间作物、水果和蔬菜例如油菜、向日葵、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、高梁、mangel worzels、蕃茄、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、瓜、马铃薯、胡萝卜、莴苣、卷心菜、洋葱、大豆属物种、甘蔗、豌豆、field beans、白杨、葡萄、柑橘、紫花苜蓿、黑麦、燕麦、草皮和草料草、亚麻和油料种子油菜、和产生坚果的植物(只要其没有在前面被特别地提到)、其后代、种子和部分。
特别优选的这类植物包括小麦、大麦、燕麦、水稻、玉米、粟和高梁。
本发明此外还提供了产生杂交小麦种子的优选的方法，其包括步骤(i)用一个或多个多核苷酸或载体转化植物材料，所述多核苷酸或载体包含基本上只在绿色组织中表达的使除草剂失活的基因和提供依赖于外源施用所述除草剂的条件性雄性不育的基因；(ii)选择如此转化的材料；和(iii)将如此选择的材料再生成形态学正常的条件性雄性不育的完整植物。
(iv)培育纯合的条件性雄性不育雌性亲本系(v)用一个或多个多核苷酸或载体转化植物材料，所述多核苷酸或载体包含基本上只在绿色组织中表达的使除草剂失活的基因和提供依赖于外源施用与(i)中相同的除草剂的条件性雌性不育的基因；(vi)选择如此转化的植物；和(vii)将如此选择的材料再生成形态学正常的条件性雌性不育的完整植物(viii)培育纯合的条件性雌性不育雄性亲本系(ix)以确保有效授粉的比例间作所述条件性不育的雄性和雌性亲本系(x)以使自体受精减少到最少的剂量和发育阶段对所述间作的亲本系施用所述除草剂(xi)从间作亲本植物中收获杂交小麦种子。
本发明也提供了上述方法的变体，其中通过任何方法使雄性亲本雌性不育，通过任何方法使雌性亲本雄性不育，雄性和雌性亲本系是依赖于施用不同除草剂(两种除草剂都施用)的条件性不育，并且所述作物不是小麦。
本发明也包括包含用于检测蛋白或编码其的DNA序列的手段的诊断试剂盒，所述蛋白或DNA存在于根据本发明方法产生的植物中，因此适合用于鉴定包含其的组织或样品。通过本领域技术人员已知的PCR扩增可检测所述DNA序列，所述PCR扩增基于引物，所述引物是可容易地从本申请公开或提到的编码酶的序列推导的引物。所述酶自身可通过例如使用针对其的已产生的抗体进行检测，所述抗体用于诊断性区分所述酶包含的抗原性区域。
关于植物材料的转化，本领域技术人员意识到尽管靶材料的类型(例如，胚发生细胞悬浮培养物或去分化未成熟胚)和转化的特定方法(例如，使用农杆菌或微粒轰击)在下列的实施例中被明确描述，但本发明并不限于这些特定的实施方案并且这些靶材料和方法可交换使用。此外，整个本发明说明书中所用的术语“植物细胞”是指分离的细胞，包括悬浮培养物，和以完整或部分完整的组织存在的细胞，所述组织是例如胚、小盾片、小孢子、来源于小孢子的胚或来自植物器官的体细胞。类似地，尽管特定的实施例限定于玉米和小麦，本发明同样应用于广泛的可使用合适的植物细胞转化方法进行转化的农作物中。
通过下列非限定性实施例和序列可更明确定地理解本发明。
SEQ ID#1引物5′-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3′SEQ ID#2引物5′-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3′根据已建立好的方法进行一般的分子生物学方法。对于绝大部分下列实施例，各包含本发明的多个范例。此处所用术语‘基因的启动子区域’表示DNA序列，所述DNA序列包含启动子、所述启动子的上游序列和任选地也包含全部或部分编码mRNA 5’非翻译前导区域的DNA序列。
实施例1.依赖于外源施用膦丝菌素的条件性雌性不育的烟草植物编码能够水解N-乙酰L-膦丝菌素的酶的DNA序列在文献中是熟知的，其来源于例如Streptomyces viridichromogenes(N-乙酰-L-phosphinothricylalanylalanine脱乙酰酶)、大肠杆菌(argE，N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶)，寡养单胞菌属和食酸丛毛单胞菌(Comamonasacidovorans)和文献中熟知的其密码子经最优化的版本(例如EP531716、EP942965和US6555733)。任选地也通过标准的突变和选择方法(例如使用涂板复制测定法监控表现N-乙酰膦丝菌素对细菌生长的增加的生长抑制作用或使用膦丝菌素产物的氨基基团的体外比色检测)或通过应用相似的选择进行基因改组方法进一步提高这些脱乙酰酶DNA编码序列的N-乙酰L-膦丝菌素脱乙酰酶活性的特异性。例如通过合成(所述方法使其更容易控制限制性内切酶位点存在的位置和建立有助于克隆的侧翼连接位点)获得DNA脱乙酰酶编码序列。设计侧翼PCR引物和合成的DNA序列以提供有用的单一限制性位点以便进行克隆。优选地和在当脱乙酰酶编码序列不含有易混的内部位点的情况下，将Ncol或Ndel置于5’末端以促进符合读码框的融合体的克隆，所述融合体是与ORF的5’加入序列的融合体。任选地，将限制性位点置于ATG翻译起始位点间插序列的上游以符合植物翻译一致序列(例如根据Kozack)。
‘ΔS13启动子’是用于在雌花部分获得优选表达的启动子区域。其包含与CMV 35S核心启动子(Dzelkalns等人(1993)Plant Cell，5，833-863)-46至+8融合的SLG13启动子区域的-339至-79区域。将该S13启动子区域克隆入bluescript sk中，然后将所述质粒进一步进行限制性酶切割，并用包含nos3’转录终止子区域和一个或其它的编码脱乙酰酶的序列的限制性片段进行连接，从而在bluescript sk质粒中产生‘ΔS13-脱乙酰酶-Nos终止子’表达盒。然后将其合适地以例如EcoR1片段限制性切出并原样将其连接入载体例如pBIN19(Bevan(1984)Nucleic Acids Res.)或pCIB200或pCIB2001(WO98/39462)的合适位点上以用于使用农杆菌的转化。如WO 98/39462中所描述的，pCIB200包含下列单一的多接头限制性位点EcoR1、Sstl、Kpnl，BglII、Xbal和SalI。PCIB2001在多接头中包含插入物，所述插入物加入其它单一限制性位点，包括MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。PCIB200和pCIB2001也提供了用于在卡那霉素上筛选植物和细菌的选择标记基因、左和右T-DNA边界、来源于RK2的在大肠杆菌和其它宿主细胞之间转移的trfA功能以及来自RK2的oriT和oriV。可选择地使用了包含来自具有广泛宿主范围的质粒pRK252(Rothstein等人(1987)Gene53，153-161)的序列的二元载体pCIB10或使用了一个其衍生物例如pCIB715，所述衍生物包含卡那霉素抗性基因和潮霉素磷酸转移酶基因(Gritz等人(1983)Gene25，179-188)。
可选择地使用了大约1.6kb的Stig1启动子区域(来源于EMBL检索号X77823)。例如用编码脱乙酰酶的DNA序列取代Goldman等人(1994)在EMBO J.13，2976-2984中描述的stig1-GUS构建体中的GUS基因编码区，将所得的stig1-D氨基酸氧化酶表达构建体在邻近合适的标记基因的3’终止子序列的上游位点和在T-DNA的边界序列之间克隆入合适的载体例如pCIB200中。
编码来自Streptomyces viridichromogenes、产碱菌属的PAT基因的DNA序列和其密码子经最优化的版本在文献中是熟知的(EP257542(Streptomyces viridichromogenes PAT酶)、EP617121、EP297618、EP290986(产碱菌属PAT酶)、EP275957(最优化的链霉菌基因))。适合用于烟草的PAT基因是例如描述于检索号A02774的基因。这些DNA编码序列可以通过例如合成(所述方法使其更容易控制限制性内切酶位点存在的位置和建立有助于克隆的侧翼连接位点)获得。设计侧翼PCR引物和合成的DNA序列以放置有用的单一限制性位点以便进行克隆。优选地和在PAT编码序列不含有易混的内部位点的情况下，将Ncol或Ndel置于5’末端以促进符合读码框的融合体的克隆，所述融合体是与ORF的5’加入序列的融合体。任选地，将限制性位点置于ATG翻译起始位点间插序列的上游以符合植物翻译一致序列(例如根据Kozak)。
在进一步特定实施例中，根据
图1构建二元载体内的T-DNA插入物。将包含编码脱乙酰酶的DNA序列和编码L-膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)的DNA序列(A02774)的构建体克隆在二元载体的T-DNA的LB/npt II基因和RB之间的位点上，所述编码脱乙酰酶的DNA序列在stig1启动子区域的有效控制之下，所述编码L-膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)的DNA序列在碗豆质体蓝素启动子区域的有效控制之下。简而言之，将脱乙酰酶编码序列在Stig1启动子之后和在nos终止子区域(包含于EMBLATU237588)之前以例如NcoI/PstI片段克隆入质粒pFse4-Stiglnos(描述于WO 9942598)中。通过PCR从豌豆基因组DNA中获得豌豆质体蓝素启动子区域(来源于EMBL检索号X16082)并将其克隆在PAT基因/nos终止子之前。将所得的PC-PAT-nos盒以例如Not I片段克隆在Stig1-seactylase-nos之后，并且将这整个两基因构建体以例如FseI片段转移至二元载体(pVB6，Bin19衍生物)中。
在其它的方法变体中，克隆脱乙酰酶基因，使其5’端正好位于编码叶绿体转运肽的区域的下游，从而编码叶绿体转运肽/脱乙酰酶融合蛋白。所述叶绿体转运肽编码序列来源于编码EPSP合酶小亚基(Klee，等人1987 Mol.Gen.Genet.，210，437)的拟南芥基因。任选地对其进行修饰以在CTP加工位点包含Sph1位点从而在该位点用Cys-Met取代Glu-Lys(WO 92/044490的图9中的SEQ)。相应地，可在脱乙酰酶编码序列的N末端通过基因工程引入SPh1位点(将紧随甲硫氨酸后的氨基酸转化成亮氨酸)。可选择地，所述转运肽编码序列来源于编码EPSP合酶(WO 92044490中的图11)的Petunia基因。可选择地叶绿体基因编码序列是大量可能序列中的任何一个，所述可能序列包括来源于编码Rubisco小亚基的基因和包括所谓的‘最优化的’嵌合转运肽序列(FR2673643)。在所有情况下，不依赖于亚克隆，可简单地通过合成获得整个想要的编码叶绿体转运肽/脱乙酰酶多肽的DNA序列。将该序列克隆入合适的载体内的stig1启动子区域下游和终止子(例如nos)序列的上游位点(例如在Goldman等人(1994)在EMBOJ.，13，2976-2984中描述的包含stig 1→GUS构建体的载体中取代GUS编码序列)。然后将整个基因表达构建体(也包括在质体蓝素启动子区域有效的表达控制之下的PAT基因序列)克隆入PVB6载体的T-DNA的右和左边界之间的合适位点上。
使用类似于Horsch等人(1985)Science，227，1229-1231中描述的方法用重组二元载体转化烟草叶片。可使用许多方法的变体。例如，使用冷冻解冻的转化方法可将二元载体转化入例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中。按照Draper等人(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci.Pub.1989)描述的实验方法使用Nicotiara tabacum var.Samsun进行烟草转化和完整的植物再生。在含有卡那霉素或其它合适的抗生素的MS培养基上选择转化事件。可选择地在在膦丝菌素上进行选择。通过PCR确定整合的转基因的存在。再生植物并使其长到成熟并自交产生种子。使用Northern和/或Western分析来确定脱乙酰酶的组织特异性表达。所选植物是自花能稔的但具有条件性雌性不育的条件。将T1代的种子播种到地里。当植物长到足够大时通过PCR就转基因的存在对其进行检测。将PCR阳性植物转移至温室中。在没有外源施用膦丝菌素的情况下这些植物是完全能育的。以各种量和在各生长阶段用DL-膦丝菌素或L膦丝菌素处理这些(假定的)条件性不育植物亚组。对脱乙酰酶基因被确定为PCR阳性的T1植物进行这些处理，或等同地，直接对T0代(无性繁殖所述植物以使可留出各事件的未处理克隆用于种子生产)植物进行这些处理。然后以观察到的能育性和营养耐受性作为选择合适的表现最明显的条件性不育表型的植物系的基础。例如，可在花形成的早期阶段之前或期间以通常0.25和20kg/ha的比例通过叶片喷雾的方式施用膦丝菌素。选择未显示受伤害的植物和收集来自经处理的植物的花粉并检验生存力。获取在以高达5kg/ha的膦丝菌素处理比例下显示相对未受损害的植物，其在用膦丝菌素处理后产生相对少的种子或无种子但在相同的处理条件下却产生接近正常水平的有活力的花粉。对照植物是转基因和非转基因植物并且生长在同一条件下和同一的物理处理方案(除了处理溶液是水或formulant)下。其它的对照植物是用构建体转化的转基因植物，所述构建体类似于上面所描述的构建体并且包含在质体蓝素启动子区域的有效控制之下的PAT基因但不包含脱乙酰酶基因。质体蓝素启动子区域提供了在植物绿色组织中的优选表达。意外地发现，与例如35S启动子区域不同，该启动子基本上只在植物的某些组织中表达并且最显著地在绿色组织中表达，当与PAT基因一起使用时提供了对除草剂DL PPT(即使在超过2kg/ha的比例时)的基本上完全的生殖耐受性。此外，当缺少在花组织中共表达的任何适合的脱乙酰酶的情况下，尽管PAT表达(当在该启动子区域的控制之下表达时)水平在许多至关重要的花组织中非常低或不存在，但质体蓝素/PAT基因组合提供了基本完全的生殖耐受性而无显著的产量损失。
实施例2.依赖于外源施用膦丝菌素的条件性雄性不育的烟草植物获得的脱乙酰酶和PAT编码序列与前面实施例1中的一样。
通过使用引物进行PCR从烟草基因组DNA中克隆TA29启动子区域(Kriete等人(1996)Plant J.，9，808-818)，所述引物是5′-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3′(SEQ ID #1)和5′-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3′(SEQ ID #2)。通过一系列的限制性酶切割和亚克隆步骤，将所获得的PCR片段置于脱乙酰酶编码序列的上游并将nos转录终止子加入到所述编码区域的3’。然后以合适的限制性片段克隆、获得所得的TA29-脱乙酰酶-nos终止子表达盒并将其克隆入实施例1中的二元载体中。
可选择地，以合适的限制性片段(例如BamH1，Bgl/II，其中设计合成的编码序列的变体以除去内部的限制性位点)克隆脱乙酰酶编码序列区域并通过以有义构型插入(例如)二元载体pROK1(Baulcombe等人(1986)Nature，321，446-449)的BamH1位点将其与CaMV 35S启动子和胭脂碱合酶终止子区域融合。然后切割携带35S启动子的EcoR1-BamH1片段并用来自携带TA29s启动子区域片段(-810至+54)的pAP30(Kriete等人(1996)The Plant Journal 9，809-818)的EcoR1-BamH1片段取代。根据编码的蛋白质序列，所得载体可称为pGKTA29_argE_deac、pGKTA29_Streptomyces_deac等。
如在实施例1中，用于转化的DNA构建体除了包含编码脱乙酰酶的DNA序列(所述序列在组织特异性雄花启动子区域例如‘TA29’的有效的表达控制之下)外，也包含编码膦丝菌素N-乙酰转移酶基因例如‘PAT’基因的DNA序列，所述序列在启动子区域例如来自质体蓝素基因的启动子区域(在该情况下所述区域来自Pisumsatiyum质体蓝素基因)有效控制之下。
通过农杆菌用载体转化烟草植物材料并以前面实施例中描述的类似方式再生转基因植物。所产生的植物是自花能稔的但也是条件性雄性不育的。将T1代的种子播种在土壤中。当幼苗长到充分大时通过PCR就转基因的存在对其进行检测。将PCR阳性的植物移入温室。这些植物在没有外源施用除草剂的情况下是完全能育的。以不同的量和在不同的生长阶段用膦丝菌素处理这些假定的条件性不育T1植物亚组或可选择地处理T0‘事件’的幼苗(直接从转化体中再生的)。在处理T0植物时对其进行无性繁殖以留出所述事件的未处理娣妹成员用于种子生产。然后以观察到的对除草剂的营养耐受性和观察到的雄性能育性作为选择合适的、表现最显著的条件性不育表型的植物系的基础。例如，可在花形成的早期阶段之前或期间以通常0.25和20kg/ha之间的比例通过叶片喷雾的方式施用膦丝菌素。
在另一可选择的实施方案中，所使用的花启动子区域是来自金鱼草的tap1基因(Spena等人(1992)，Theor.Appl.Genet.，84，520-527)上游的2.2kb区域(EMBO号X57295)。
收集来自经处理的植物的花粉并检验其存活力。获取不散发花粉或散发相对很少花粉和/或无存活力的花粉的植物。对从一些经处理的植物中收集的花粉进行检验并发现其是畸形和无存活力的。然而，这种雄性不育植物保持雌性能育，并且当用收集自其它未处理的非转基因或条件性雌性不育烟草植物的花粉授粉时产生(杂交)种子。对照植物包括转基因和非转基因植物并且生长在同一条件下和同一物理处理方案(除了处理溶液是水或formulant)下。
实施例3.能够优选地在谷物的雄性生殖结构中表达并编码能够水解N-乙酰L膦丝菌素的脱乙酰酶的嵌合基因。
如实施例1中所描述的获取编码脱乙酰酶基因的DNA序列，任选地，其被密码子最优化以用于在谷物中表达。
在一个特定的实施例中，使用了USP 5470359中的花药特异性SGB6启动子区域SEQ ID NO1。将含有从pSGB6g1(USP 5470359)亚克隆的3kb基因组EcoR1-Nhe1片段的pSGBNE1进一步亚克隆以将1558bp的ApaII/XbaI平端片段在SmaI位点克隆入bluescript ks。通过进一步的限制性酶切割和克隆步骤将该片段以符合读码框的方式融合到所述脱乙酰酶DNA编码序列的上游。在所述编码序列的3’加上nos终止子以建立可选择的包含可选择的SGB6-脱乙酰酶-nos表达盒的Bluescript sk质粒，pBLB6_argE_deac、pBLB6_Streptomyces_deac。
在类似的实施例组中，类似地也将来自水稻的RA8花药特异性启动子区域(EMBL/genbank检索号AF042275；Jean Js等人(1999)PMB，39，35-44)以符合读码框的融合方式融合到一个或其它编码脱乙酰酶的DNA序列的上游并在编码序列的3’加上nos终止子，从而产生一系列包含可选择的RA8-脱乙酰酶-nos表达盒的bluescript sk载体。
任选地，如在实施例1和2中的一样，在转化入谷物之前，将本实施例的嵌合基因整合到单个载体中，所述载体也包含在质体蓝素(或类似地，主要在绿色组织中指导表达的启动子区域)有效的表达控制之下的嵌合PAT基因。
可选择地，用分开的载体转化所述谷物组织，一个包含质体蓝素/PAT基因嵌合基因，另一个包含花启动子/脱乙酰酶嵌合基因，再生和选择植物。
实施例4.优选地在谷物的雌性生殖结构中表达并编码能够水解N-乙酰L膦丝菌素的嵌合基因。
如实施例1中所描述的，获取编码脱乙酰酶基因的DNA序列，任选地，对其进行密码子最优化以用于在谷物中表达。
按照Budapest协议的条款在1998年2月27日在NRRL以保藏号NRRL B-21920保藏基因组克隆pSH64。经检测其为与穗丝特异性cDNA克隆B200i4-2(WO98/39462)杂交的基因组克隆。如下构建优选地在雌性生殖结构中表达的嵌合基因。如WO 98/39462所描述的，构建类似于具有‘空’表达盒的pSH70的bluescript ks来源的质粒，所述质粒从5’至3’包含由WO98/39462的SEQ ID No 11的核苷酸1-3790构成的B200i 5′启动子区域、BamH1位点和包含WO 98/39462中的SEQ ID No 11的核苷酸4427-6397的B200i 3′非翻译终止区域。使用部分BamH1降解，或可选择地通过进一步亚克隆，PCR和连接步骤，将可选择的脱乙酰酶编码序列连接入BamH1位点或其附近的位点以使其正好在B200i启动子的3’和B200i终止子区域的5’。由此，建立编码可选择的B200i-D-氨基酸氧化酶-B200i表达盒的bluescript载体pBLB200_argE_脱乙酰酶等。
可选择地，如WO 98/39462中所描述的，将P19基因5’启动子区域的Pst I/Nco I片段从基因组克隆X2-1中切割出来，所述基因组克隆X2-1是按照Budapest协议的条款在1998年2月27日在NRRL以保藏号B-21919保藏的克隆。WO 98/39462中的SEQ ID No 14的核苷酸的1088位Nco I对应于P19基因的ATG翻译起始位点。通过使用合适的亚克隆、限制性酶切割、连接和PCR步骤将该片段连接以和一个或其它编码脱乙酰酶的DNA序列形成符合读码框的融合体，并在所述编码序列的3’加上nos终止子序列。由此，建立了编码可选择的P19-脱乙酰酶-nos表达盒的一系列bluescript载体。可选择地，使用相似的标准方法，获得具有取代P19启动子区域的P26基因的5’启动子区域(包含一些或所有WO 98/39462中的SEQ ID No 2的核苷酸1-3987)的类似质粒。如WO 98/39462中所描述的，亚克隆基因组P26-A4克隆即pCIB10302，所述克隆根据Budapest协议的条款在1997年1月21日在the Agricultural Research Service patentculture collection(NRRL)以保藏号NRRL B-21655保藏。由此，建立了编码可选择的P19-脱乙酰酶-nos表达盒的一系列bluescript载体pBLP26_Streptomycs_deac等。
实施例5.用于提供(a)雌性近亲交配亲本系和(b)互补雄性近亲交配亲本系的方法的成对互补构建体，所述雌性近亲交配亲本系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雄性不育，所述互补雄性近亲交配亲本系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雌性不育。
适合提供雌性近亲交配亲本谷物或水稻植物系的第一DNA构建体包含三个基因A)、B)和C)，所述雌性近亲交配亲本谷物或水稻植物系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雄性不育。A)由编码能够N-乙酰化L-膦丝菌素的PAT酶的DNA序列和合适的终止子区域例如来自nos或35S基因的终止子区域构成，所述编码PAT酶的DNA序列在来自大麦质体蓝素基因(EMBLZ28347)的大约1kb启动子区域有效控制之下，B)由编码类似于第一但此时在组织特异性雌花启动子区域(例如P19或P26)有效控制之下的PAT编码序列和合适的终止子构成，C)由在实施例1中描述的合适的脱乙酰酶编码序列和合适的终止子区域构成`，所述脱乙酰酶编码序列在组织特异性雄花启动子区域(例如SGB6或RA8)有效控制之下。使用本领域标准的方法和前面实施例提供的信息装配该构建体。
适合提供雄性近亲交配亲本谷物或水稻植物系的第二DNA构建体包含3个基因A)、D)和F)，所述雄性近亲交配亲本谷物或水稻植物系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雌性不育。A)由编码能够N-乙酰化L-膦丝菌素的PAT酶的DNA序列和合适的终止子区域例如来自nos或35S基因的终止子区域构成，所述编码PAT酶的DNA序列在来自大麦质体蓝素基因的启动子区域有效控制之下，D)由与所述第一DNA序列相似的PAT序列和合适的终止子构成，但此时所述PAT序列在与第一构建体中用于驱动脱乙酰酶表达的相同的组织特异性雄花启动子区域(例如SGB6或RA8)有效控制之下，F)由实施例1中所描述的合适的脱乙酰酶编码序列和合适的终止子区域构成，所述脱乙酰酶编码序列在与第一构建体中用于驱动PAT表达的相同的组织特异性雌花启动子区域(例如P19或P26)的有效控制之下。使用本领域标准的方法和前面实施例提供的信息装配该构建体。
本实施例的成对DNA构建体包括例如下列元件构建体1A＝大麦质体蓝素启动子区域→PAT编码序列，Nos终止子；B＝P26启动子区域→PAT编码序列，35S终止子；C＝RA8启动子区域→脱乙酰酶编码序列，Nos终止子；构建体2A＝大麦质体蓝素启动子区域→PAT编码序列，Nos终止子；D＝RA8启动子区域→PAT编码序列，35S终止子；E＝P26启动子区域→脱乙酰酶编码序列，Nos终止子实施例6.用于小麦转化的多核苷酸载体前面的实施例描述了通常被克隆入bluescript sk的表达盒的各种嵌合基因构建体。任选地大量制备这些载体以用于直接的DNA转化，所述载体与共轰击的选择标记物例如WO 98/39462中所描述的pSOG35(DHFR/氨甲蝶呤)或pUbi-Hyg(潮霉素磷酸转移酶/潮霉素)一起用于直接的DNA转化。优选地，在大量制备后，使用合适的限制性酶线性化所述载体以除去bluescript的氨苄青霉素抗性基因。
任选地，除了使用共轰击外，通过标准方法进一步对所述bluescript载体进行遗传工程改造以使其进一步包含植物选择性标记基因例如卡那霉素抗性、潮霉素抗性、氨甲蝶呤抗性或草甘膦抗性基因，并进行直接使用。在一些上述的实施例中，将PAT基因整合入设计的载体中并且在这些情况下，任选地在转化后的一些阶段可用DL膦丝菌素进行选择。
可选择地，在合适的限制性片段内切割表达盒并将其克隆入pIGPD9来源的载体(描述于WO 00/66748的图12)中。使用这种载体进行转化避免了将抗生素标记基因转移到植物中，因为其在细菌中的保持依赖于营养缺陷型his B大肠杆菌突变体的互补作用。所述载体包含表达IGPD(hisB产物)的基因并经进一步的基因工程改造以包含植物选择性标记物，例如克隆入例如WO00/66748的pZEN16i和pZEN18i的Xma I位点的EPSPS基因。可选择地使用了在甘露糖或木糖上提供阳性选择的标记基因(USP 5767378)。
通过使用厂商提供的实验方案使用Maxi-prep procedure(Qiagen)获得用于植物转化的大规模DNA制剂。
实施例7.用多核苷酸转化/再生小麦，所述多核苷酸包含提供组织特异性表达的PAT和N-乙酰L-膦丝菌素脱乙酰酶的嵌合基因在一个实施例中，将基因型UC703的未成熟胚(长度为0.75-1.0mm)涂布在含有3mg/l 2，4-D和3％蔗糖的MS培养基上。大约4小时后，将胚涂布在含有15％麦芽糖、3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培养基上，所述培养基由用滤纸支持的含有相同组分的琼脂板覆盖。在轰击前使胚进行质壁分离2-3小时。
使用标准方法将如前面的实施例中所描述的方法制备的DNA沉淀在微米尺寸的金微粒上。使用DuPont Biolistics氦气设备用1100psi的爆破压轰击4个靶板(每个靶板含16个胚)二次。在载体台和靶之间放置80目的阻挡屏并对板进行轰击。轰击后，在将载有胚的板放置到含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培养基的板上之前，将靶在25℃下于暗处放置24小时。再经过48小时后，将单个胚从板上取出并直接放在相同成分的新鲜培养基上。当以氨甲蝶呤为选择剂时，在基因递送大约6周后，将所述组织放置在含有3mg/l 2，4-D、3％蔗糖和0.2mg/l氨甲蝶呤的MS培养基上进行3周。然后将组织置于包含MS培养基的再生培养基中，所述MS培养基含有1mg/l玉米素核苷和1mg/l氨甲蝶呤。2周后，将再生小苗放入灭菌容器中，该容器装有含有2％蔗糖、1mg/l萘乙酸和4mg/l氨甲蝶呤的半强度MS培养基。根据其它选择试剂的使用，采用类似方法。
在特定的实施例变体中，包含优选地在雄性生殖结构中表达的嵌合基因的载体与可选择的选择性标记基因一起用于共轰击。因此，例如，制备质粒DNA并将其与pUbiHyg(编码在玉米聚泛素启动子有效控制之下的潮霉素磷酸转移酶的质粒)一起包被在金微粒上，所述质粒包含嵌合基因，其中脱乙酰酶在RA8启动子区域的有效控制下表达。在这种情况下，除了在轰击后再生培养基含有在2和20mg/l之间不断增加的潮霉素浓度外，如上所述进行转化和再生。
在其它的实施例中，用表达草甘膦抗性EPSP合酶的质粒转化小麦并使用草甘膦进行选择，如WO00/66748的实施例15中所描述的进行再生。
从来源于转化体的植物的叶组织中提取DNA，并进行PCR以检验PAT基因、任选地任何另外的选择标记基因和编码脱乙酰酶的基因的存在。繁殖PCR阳性植物。在开花期间，收集雌蕊和花药并制备RNA。通过Northern分析确定DNA表达。此外，使用pET载体在大肠杆菌中表达脱乙酰酶基因并部分纯化。从SDS凝胶上切下所表达的蛋白的蛋白带并用于产生多克隆抗体。通过Western分析将这些抗体用于检测在花组织和其它组织中的表达。
实施例8.有效地产生杂交谷类作物的方法，其中DL膦丝菌素用于杂草控制和同时用作化学杂交剂，其中由如此产生的杂交种子的F1代杂交植物在营养和生殖上基本上都对DL膦丝菌素的施用具有耐受性。
化学杂交剂很昂贵并且不总是有效。使用相对便宜的物质例如商业除草剂作为化学杂交剂是想要的。这也会产生更好的效果，因为可将杂草控制与化学杂交相结合。然而为了实现这个建议有许多问题需要克服。首先，需要建立对所述的除草剂具有耐受性的雄性和雌性亲本系。此外，为了获得想要的响应除草剂施用的‘条件性’能育，需要以这样的方式对两个亲本系进行基因工程改造，所述方式使得对除草剂的耐受性不扩展到所有组织中，相反，而是以组织特异性的方式表达以使各个所要求的花组织保持选择性易感性。因此，在一个系(雌性亲本系)中，必须使植物的营养部分和雌性组织具有对除草剂施用的耐受性同时雄花组织的某些关键部分必须保持对除草剂施用的易感性，而在另一种系(雄性亲本系)中，相反地只需要雌配子形成组织的一些关键部分保持易感性。即使可以实现这个，仍有许多关于杂交种子和F1代的进一步问题需要克服。根据上述方案，假定该代作物必定包含至少两个能够提供针对除草剂的抗性的基因，那么也需要该相同的除草剂也可在F1代杂交作物中用作选择性杂草控制剂。然而，很难想象除草剂、组织特异性启动子区域和耐受基因的组合，所述耐受基因允许在F1代中以和在杂交种子生产过程中使用除草剂一样的方式使用相同的除草剂。很可能在对F1代施用除草剂后，杂交作物表现营养耐受性但却产生很少量或不产生谷粒。目前不存在这样的杂交作物生产系统。举个概念上的例子，例如草甘膦如何可以以杂交剂和F1代作物选择性除草剂结合使用可有助于弄清楚内在的困难。对于除草剂草甘膦，通常的抗性机制是表达EPSP合酶的抗性形式。鉴定允许R-EPSPS在所有组织中和在所有时间(除了在雄蕊或柱头发育的关键阶段外)充分表达的启动子区域或启动子区域组合是非常困难的。关于这个问题最直接的方式是使用反义或类似的方法，其中R-EPSPS基因的表达由组织非特异性/组成型启动子驱动，而在例如雄蕊中由于反义EPSPS基因(参见例如WO99/46396)的表达导致只有局部和短暂地抑制。然而，在这种情况下，在雄蕊(或柱头)中表达的抑制由显性基因驱动。很清楚，对于任何这样的机制，对F1代施用除草剂会导致由于存在于F1代杂交植物中的显性雄性和雌性条件性不育基因的相加效应造成的不育、无产量的作物。
本发明和前面实施例提供的构建体提供了克服使廉价商业除草剂DL膦丝菌素能够同时用于杂草控制和在杂交谷物生产中用作杂交试剂的问题的方法，此外，所述方法提供了所得的杂交谷物，在所述作物中可安全地将DL膦丝菌素(或L膦丝菌素)用于杂草控制而基本上没有产量损失。作为其它的有益方面，将更容易管理来自F1代的自交种子(以后可在随后的作物中产生自生植物)，因为如果喷施控制量的DL膦丝菌素通常可使其自身不育。对于F1代植物与野草(例如红米)或其它谷类作物的花粉异型杂交的后代也是如此。
在本实施例的生产杂交作物的方法中，PAT基因用于提供针对用作杂交剂的除草剂膦丝菌素的耐受性。当然，将L-膦丝菌素转化成N-乙酰L-膦丝菌素的PAT基因是已为熟知的并且其商业上用于在作物中提供针对DL膦丝菌素的耐受性。然而，存在许多与PAT基因表达相关的至关重要的特征，它们体现了本实施例方法的特征。
首先，PAT基因在质体蓝素启动子区域的有效控制之下表达从而使其基本上只在植物的绿色组织中表达。令人吃惊的是在实验中发现具有如此表达的PAT基因的小麦基本上在生殖上对以高达至少2kg/ha比例施用的DL膦丝菌素具有耐受性。因此，针对膦丝菌素的生殖耐受性不要求PAT抗性基因在其自身的配子形成组织中大量表达。因此，描述于前面实施例(所述实施例用于提供本实施例的植物)中的构建体的重要特征是PAT基因(所述基因提供抗性性状)在启动子区域的有效控制之下表达，所述启动子区域提供基本只在绿色组织中的表达。这样的有用的启动子区域的特征在于其应当以这样的方式表达PAT，所述方式使其充分保护所有非绿色花组织免受叶面施用的DL膦丝菌素的损害，同时在花组织自身中只提供最低水平的PAT表达，特别是在被靶向条件性不育的部分尤其低。PAT在大麦质体蓝素启动子区域的有效控制之下表达似乎符合这种状况，因为基本上所有喷施的经叶进入的L膦丝菌素在其被转运到发育中的花组织之前被截住并被转化成非毒害植物的N-乙酰-L膦丝菌素。因此，在本实施例的方法中，在亲本系中导致组织选择性不育效果的L膦丝菌素只是通过脱乙酰酶的作用从韧皮部流经的非毒害植物的N-乙酰L-膦丝菌素中短暂和局部地产生。
作为本实施例的方法(用于产生杂交作物的方法)特征的PAT表达的第二特征是条件性不育的雄性和雌性亲本系包含实施例5中描述的构建体1或2。通过将驱动PAT表达的花控制元件与在互补的成对构建体(实施例5)中驱动脱乙酰酶表达的元件进行精确配比，可以确保在F1杂种中，L-膦丝菌素在靶花组织中的瞬间爆发被相应的在相同时间内和相同局部组织中的PAT表达的暴发快速中和。因此，所述除草剂的施用不会在杂种中诱导显著的对雄性或雌性配子形成组织的不育性效应。然而，在以后的代中，杂种的对应于花的PAT和D氨基酸氧化酶将会分离，从而所得的植物再次成为依赖于控制量的DL膦丝菌素施用的雄性或雌性不育。
在本实施例的方法中，如前面的实施例所描述的将实施例5中所描述的构建体转化入小麦中或(使用标准的超二元载体方法转化入水稻中)并选择转化体植物和再生成幼苗。选择T0转化体事件(使用农民的无性繁殖技术以保持未处理的系)并且可选择地使用基本上如实施例1和2中所描述的方法选择适合用于培育雄性近亲交配亲本系或雌性近亲交配亲本系的事件，所述雄性近亲交配亲本系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雌性不育，所述雌性近亲交配亲本系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雄性不育。最好的系表现最好的除草剂耐受性，最少的产量损失，最明显的条件性不育表型等。选择可选择的雄性亲本和雌性亲本系并任选地与合适的优良系回交多代。全面表征基因插入物(所述插入物存在于这些最终选择的事件中)，如对条件性能育和除草剂抗性性状的遗传和所表达的基因产物的表征。
然后以合适的比例在田间将所选择的雌性和雄性亲本系一起间作并以合适的0.05至5kg/ha的比例喷施DL膦丝菌素直至开花早期(选择以最优化杂交种子的产量)。所产生的种子具有有利方面其可长出不仅受益于杂种优势而且对含有DL膦丝菌素的除草剂制剂具有耐受性的植物，从而可使用DL膦丝菌素在作物中选择性控制杂草。所述杂交种子也具有有利方面其表达的除草剂耐受性性状仅能部分地传递给之后的自交代或异型杂交入相关的杂草中。因此，例如，由本发明产生的杂交水稻可在使用DL膦丝菌丝作为杂草控制剂的情况下生长而无明显的产量损失。然而作为来自杂交水稻的花粉与红米雌性亲本的异型杂交后代的红米植物的后代，其在营养生长上对DL膦丝菌素的处理具有耐受力但却具有减少的自稔性(归因于花组织中脱乙酰酶的表达)，从而产生很少的谷粒。类似地，在喷施DL膦丝菌素后，从杂种作物中长出的的第二代自生水稻或小麦绝大部分不产生谷粒。
序列表<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5aactgcagct ttttggttag cgaatgc27<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6cagactagtt ttagctaatt tctttaagta aaaac 3权利要求
1.产生雄性或雌性不育植物的方法，其包括提供用于使除草剂失活的手段和用于再激活如此失活的除草剂的手段，其中在营养组织中提供所述使除草剂失活的手段而在植物的雄性或雌性生殖结构中提供所述再激活手段，这样当对植物施用除草剂时，保护了营养结构，但不是生殖结构，免受除草剂的毒害植物的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述手段是酶。
3.权利要求1或2的产生雄性或雌性不育植物的方法，其包括步骤用编码第一酶和第二酶的多核苷酸转化植物材料和将所转化的材料再生成植物，所述第一酶能够N-乙酰化L-膦丝菌素，第二酶能够水解N-乙酰L-膦丝菌素或从N-乙酰L-膦丝菌素除去乙酰基团以产生L-膦丝菌素，其中所述第一酶只在植物绿色组织中表达，其中对植物的叶施用L膦丝菌素除草剂直到雄或雌配子形成和/或成熟时期，这样所述植物基本上不受施用的除草剂损害，其中第二酶优选地在雄性或雌性生殖结构中表达，从而在这些组织中选择性地局部再生L-膦丝菌素，这阻止了所述配子的形成，或使其丧失功能。
4.前面权利要求的方法，其中所述第一酶是膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)而所述第二酶是酰胺酶或水解酶。
5.前面权利要求中任意一项的方法，其中L-膦丝菌素与D-膦丝菌素和/或至少一种选自下列的化合物一起混合施用安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导剂、细胞色素P450诱导剂或抑制剂、除草剂、肥料、杀线虫剂、增效剂、杀虫剂、杀真菌剂、激素和植物生长调节剂。
6.权利要求4或5中任一项的方法，其中所述PAT酶在质体蓝素启动子的表达控制之下。
7.权利要求4至6中任一项的方法，其中所述PAT酶另外地在雄性或雌性特异性花启动子的控制之下表达，从而使所述酶只存在于绿色组织和除了使配子在其中失去功能的生殖组织以外的生殖组织中。
全文摘要
产生雄性或雌性不育植物的方法，其包括提供用于使除草剂失活的手段和用于再激活如此失活的除草剂的手段，其中在营养组织中提供所述使除草剂失活的手段而在植物的雄性或雌性生殖结构中提供所述再激活性手段，这样当对植物施用除草剂时，保护营养结构，但不是生殖结构，免受除草剂的毒害植物的影响。
文档编号C12N15/82GK1823167SQ200480019859
公开日2006年8月23日 申请日期2004年6月9日 优先权日2003年7月10日
发明者T·R·豪克斯 申请人:辛根塔有限公司