专利名称：用于治疗疾病的b亚组腺病毒载体的制作方法
技术领域：
本文描述的发明涉及使用人类B亚组腺病毒治疗疾病的领域。
背景技术：
条件复制型病毒代表了一种新型的、有前途的抗癌剂。已开发出人5型腺病毒(Ad5)衍生物，它们选择性的在癌症细胞中复制并将其杀死。这种病毒的原型，ONYX-015，一种C亚组腺病毒，已在I期和II期临床试验中被证实对复发性头颈癌患者和肝转移性疾病患者具有令人鼓舞的效果。
为了使腺病毒在细胞内有效复制，腺病毒的E1b基因产物p55与宿主细胞p53蛋白形成复合物，从而隔离和/或灭活p53并产生p53功能缺陷的细胞。这样的p53功能缺陷的细胞可支持腺病毒的复制。以此方式，野生型腺病毒能在含p53的细胞内复制，因为腺病毒p55蛋白灭活和/或隔离了宿主细胞p53蛋白。Onyx-015是含有编码突变p55蛋白的E1b位点的重组腺病毒，当将它被施用于含有能被该重组腺病毒感染的肿瘤细胞的个体或细胞群时，所述的突变p55蛋白基本上不能与感染细胞内的p53蛋白形成功能性复合物。在被感染的非肿瘤细胞中重组腺病毒基本上不能有效地隔离p53蛋白导致所引入的重组腺病毒多核苷酸在非肿瘤细胞中不能表达复制表型。相反，缺乏功能性p53蛋白的肿瘤细胞可支持所引入的重组腺病毒的复制表型表达，所述的重组腺病毒通过腺病毒细胞病变效应和/或与复制表型相关的负选择基因的表达导致肿瘤细胞的消除。
从正在进行的Onyx-015临床试验中得到的一个经验是，似乎效力比毒性更局限了它的治疗效益。迄今为止，未观察到剂量限制性的毒性。增强肿瘤消解性病毒临床效力的一个策略是将它们与其它疗法相结合，例如标准的化疗，或者使它们具有抗癌基因，诸如抗血管形成因子、细胞毒性剂、前药转换酶或细胞因子等。可与化疗和抗癌基因相结合的另一种方法是从遗传学上改造病毒使其更有效，即复制更快，产生更多的病毒后代，以及增强组织和/或细胞类型特异性等。此处的目的是产生更迅速、更有选择性杀死癌症细胞、并最终根除癌症的治疗用病毒。
所述治疗策略的关键点取决于腺病毒进入靶细胞的能力。此过程包括多个步骤，现认为是从所述病毒通过腺病毒纤维丝-结节蛋白与其细胞受体CAR结合而附着于细胞上开始的(Bergelson et al.(1997)Science 2751320-1323)。在第二步中，通过αvβ3和αvβ5整合素与腺病毒五邻体基底的RGD-结构域相互作用介导病毒的内化(Wickham et al.(1993)Cell 73309-319；Mathiaset al.(1994)J.Virol.686811-6814)。内化后，病毒颗粒向核膜转移。在此过程中，衣壳被去除且病毒DNA最后释放入病毒DNA起始复制的核中。细胞上CAR的存在看来是腺病毒感染效力的主要决定因素。相反，与包括avβ3和avβ5整合素在内的二级腺病毒受体的表达无关(Hemmi等(1998)Hum Gene Ther.92363-2373)。
利用C亚组腺病毒治疗癌症的可能缺点有两个。
首先，最近的实验工作已显示，在患有某些形式癌症的患者中，与体外和体内的正常细胞相比，肿瘤细胞中的CAR表达都有所减少。RT-PCR和Western印迹分析发现，CAR表达水平和腺病毒转染效力之间有良好的相关性。(Jee YS，Lee SG，Lee JC，Kim MJ，Lee JJ，KimDY，Park SW，Sung MW，Heo DS.Anticancer Res 2002 Sep-Oct；22(5)2629-34)。此外，将CAR转染入无内源性CAR表达的人膀胱癌细胞使这些细胞的感染能力显著提高(Li et al.(1999)Cancer Res.59325-330)。
与利用C亚组腺病毒进行癌症治疗相关的第二个缺点是在肝细胞中存在CAR，它具有促进病毒在肝脏中积聚的不良副作用。属于B体系和最佳串联纤维体系的B亚组病毒显示出肝转导较Ad5纤维载体低两个数量级以上(Schoggins JW，Gall JG，Falck-PedersenE.JVirol 2003 Jan；77(2)1039-48)。
如上所述，肿瘤消解性腺病毒原型是Onyx 015，它是C亚组病毒。由于上述原因，从C亚组病毒构建得到的腺病毒载体具有某些限制其肿瘤消解潜能的特性。为了给医师提供另一种肿瘤消解病毒，生产具有Onyx 015特性和B亚组腺病毒特性的腺病毒将会是有益的。
科学和专利文献方面均有报道描述了B亚组腺病毒的遗传特性，包括这些病毒某些区域的核苷酸序列。
WO0240693A1显示了腺病毒复制子，包含具有来自Ad5的DNA和B亚组腺病毒DNA之间的融合体的重组腺病毒。
WO0240665显示了能够与基于来自B亚组、优选腺病毒第35型的血清型的重组腺病毒互补的包装细胞系。
WO0227006显示了用对骨骼肌细胞具有向性的衍生自腺病毒的基因投递载体转导所述细胞的手段和方法。该基因投递载体至少包含B亚组腺病毒纤维蛋白的向性决定部分。
WO0052186描述了对成纤维细胞样或巨噬细胞样细胞具有组织向性的腺病毒B亚组核酸投递载体。
WO0031285提供了对平滑肌细胞和/或内皮细胞具有组织向性的核酸投递载体。在一个方面，核酸投递载体是B亚组腺病毒的病毒衣壳。
WO8906282描述了具有经修饰的自抑制功能结构域的人类腺病毒B1亚组功能突变型E1A基因。
美国专利号6,492,169展现了与基于来自B亚组、优选腺病毒第35型的血清型的重组腺病毒互补的包装细胞系。
美国专利号5,770,442显示了包含B亚组腺病毒嵌合纤维蛋白的重组腺病毒。
美国专利号4,920,211显示了具有经修饰的自抑制功能结构域的人类腺病毒B1亚组的功能突变型E1A基因，它对表达可刺激而不净抑制控制E1A突变基因的启动子的E1A产物是有效的。
附图简述
图1显示了人类B亚组腺病毒第3型的完整核苷酸序列以及编码E1B 55K蛋白质的区域。
图2显示了人类B亚组腺病毒第34型的完整核苷酸序列以及编码E1B 55K蛋白质的区域。
图3显示了人类B亚组腺病毒第3型的E1A区的cDNA核苷酸序列。
图4显示了人类B亚组腺病毒第3型的cDNA编码的E1A区的氨基酸序列。
图5显示了人类B亚组腺病毒第34型E1A区的cDNA核苷酸序列。
图6显示了人类B亚组腺病毒第34型的cDNA所编码的的E1A区的氨基酸序列。
图7显示了人类B亚组腺病毒第3型的开放读码框6的DNA序列。
发明概述本发明的一项特色是对重组溶瘤人类B亚组腺病毒的描述。
本发明还展现了人类B亚组腺病毒第3型和第34型的全长基因组序列。
在另一个方面，本发明包括重组人类B亚组腺病毒以及由它衍生的重组病毒载体用于表达异源DNA序列的用途。
本发明的另一个实施方案涉及基于B亚组第3型和第34型的人类腺病毒表达载体系统，其中E1和E3基因区之一或二者的部分或全部被缺失。
本发明的一项特色是对重组溶瘤人类B亚组腺病毒的描述，所述腺病毒缺乏能够结合功能性肿瘤抑制基因产物的病毒癌蛋白的表达，而且主要通过不依赖CAR的机制感染细胞。
本发明的另一项特色是对溶瘤人类B亚组腺病毒的描述，所述腺病毒缺乏能够结合功能性肿瘤抑制基因产物的病毒癌蛋白的表达。
本发明的另一个方面涉及人类B亚组腺病毒，所述腺病毒缺乏编码功能性E1A或E1B 55K病毒癌蛋白的能力。
本发明的还有一个方面是对使用重组人类B亚组腺病毒治疗疾病的描述。
在充分考虑下文后，本发明的这些和其它方面对于本领域熟练从业人员而言将是显而易见的。
发明详述收录本专利全文引用的所有出版物和专利申请书作为参考，其程度与专门和个别地指示完整收录每一出版物或专利/专利申请书相同。
除非另有说明，本发明的实践将采用常规微生物学、免疫学、病毒学、分子生物学、和重组DNA技术，它们属于本领域的技术范围之内。这些技术在文献中有充分说明。参阅，例如，Maniatis等，《分子克隆实验室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(1982年)；《DNA克隆实用方法》(DNA CloningA PracticalApproach)，第1卷和第2卷(D.Glover编)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait编(1984年))；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.Hames和S.Higgins编(1985年))；《转录和翻译》(Transcription and Translation)(B.Hames和S.Higgins编(1984))；《动物细胞培养》(AnimalCell Culture)(R.Freshney编(1986年))；Perbal，《分子克隆实用指导》(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984年)；Sambrook等，《分子克隆实验室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第2版)；第1卷、第2卷、和第3卷。还可参阅Hermiston T.等，《分子医学方法腺病毒方法和方案》(Methodsin Molecular MedicineAdenovirus Methods and Protocols)，W.S.M.Wold编，Humana出版社，1999年。
A.定义除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述相似或相当的任何方法和材料都可用于本发明的实践或测试，然而本文描述的方法和材料是优选的。
美国专利号5,677,178和5,801,029中列出的定义可用于本文，而且包括下列术语。
“复制缺陷型病毒”指优先抑制支持病毒复制表型表达的预定细胞群(例如本质上缺乏p53和/或RB功能的细胞)中的细胞增殖且在包含非复制性未转化细胞特征性的正常p53或RB水平的细胞中本质上不能抑制细胞增殖、诱导凋亡、或表达复制表型的病毒。通常，复制缺陷型病毒在包含正常p53或RB功能的细胞中展示噬斑形成效率实质性降低。
在用于本文时，术语“p53功能”指具有基本正常水平的p53基因所编码多肽的特性(即，相对于同一组织类型的非肿瘤细胞而言)，其中p53多肽能够结合C亚组野生型腺病毒第34型的E1b p55蛋白质。例如，p53功能可通过生成无活性(即突变体)形式的p53或者通过p53多肽表达的大量降低或完全失去而丧失。此外，在含编码野生型p53蛋白质的p53等位基因的肿瘤细胞中，p53功能也可能基本上缺失，例如，在p53位点之外的遗传变异，诸如导致p53异常亚细胞加工或定位的突变(例如，导致p53定位主要在细胞质而非细胞核中的突变)，或者p53作用分子的丧失或失活，可导致p53功能的丧失。也就是说，p53作用的生化途径可能有所变化，也会引起p53功能的丧失。
在用于本文时，术语“复制表型”指受到病毒(诸如复制缺陷型腺病毒)感染的细胞的下列表型特征中的一项或多项(1)实质性表达由病毒晚期基因启动子启动的晚期基因产物，诸如衣壳蛋白(例如腺病毒五邻体基底多肽)或RNA转录本；(2)病毒基因组的复制或复制中间物的形成；(3)病毒衣壳的装配或包装好的病毒粒子；(4)受感染细胞中细胞病理效应(CPE)的出现；(5)病毒裂解周期的完成；和(6)在受到编码功能性癌蛋白的野生型可复制DNA病毒感染的非肿瘤细胞中消除p53功能后常常偶发的其它表型变化。复制表型包括至少一种所列表型特征，优选超过一种上述表型特征。
术语“抗肿瘤复制缺陷型病毒”在用于本文时指具有在人体中通过相对于受感染的相同组织学细胞类型的非复制、非肿瘤细胞而言优先杀死受感染的肿瘤细胞来抑制肿瘤发展或进展的功能特性的重组病毒。
在用于本文时，“癌”或“肿瘤”指展示相对自主生长、因而展示异常生长表型(其特征是显著丧失对细胞增殖的控制)的细胞。
在用于本文时，术语“可操作连接”指处于功能关联的多核苷酸的连接。在将核酸置于另一种核酸序列的功能关联中时，它与后者是“可操作连接的”。例如，若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与编码序列是可操作连接的。可操作连接意味着相连的DNA序列通常是毗邻的，而且，对于连接两个蛋白质编码区时应该是毗邻且处于同一读码框。然而，由于增强子通常在与启动子相隔数千碱基时仍发挥功能，而且内含子序列的长度可变，因此有些多核苷酸元件可以是可操作相连的、但并不毗邻。
在用于本文时，“生理学条件”指具有与完整哺乳动物细胞或者存活哺乳动物的组织间隙或器官中的条件基本相似的离子强度、pH、和温度的水性环境。通常，生理学条件包括含有大约150mM NaCl(或可选地KCl)、pH 6.5-8.1、且温度大约20-45℃的水性溶液。通常，生理学条件是适合于生物学大分子的分子间结合的结合条件。例如，150mM NaCl、pH 7.4、37℃的生理学条件通常是合适的。
DNA“编码序列”指处于合适调控序列的控制下时在体内转录并翻译成多肽的DNA序列。编码序列的边界是由位于5′(氨基)末端的起始密码子和位于3′(羧基)末端的翻译终止密码子决定的。编码序列可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核生物(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、病毒DNA、甚至合成的DNA序列。多聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′端。
“转录启动子序列”指能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动下游(3′方向)编码序列转录的DNA调控区。为了定义本发明，启动子序列在3′端连接编码序列的翻译起始密码子(ATG)，并且向上游(5′方向)延伸至包括启动高于背景的可检测水平转录所必需的最小数目碱基或元件。
DNA“控制序列”是启动子序列、核糖体结合位点、剪接信号、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、增强子、翻译终止序列等的总称，它们在宿主细胞中共同提供编码序列的转录和翻译。
当细胞中RNA聚合酶将结合启动子序列并将编码序列转录成mRNA、后者继而翻译成由编码序列编码的多肽时，则编码序列“可操作连接”控制序列或受其控制。
“宿主细胞”指已经过外源DNA序列的转化或者能够转化的细胞。
当两种多肽序列在确定的长度中至少大约80％(优选至少大约90％，且最优选至少大约95％)的氨基酸相匹配时，则两种多肽序列是“本质上同源的”。
若两种DNA序列是相同的或不超过40％的核苷酸、优选不超过大约30％的核苷酸(即至少大约70％同源)、更优选大约20％的核苷酸、且最优选大约10％的核苷酸是不同的，则它们是“本质上同源的”。
可以在例如针对特定系统定义的严谨条件下在Southern杂交实验中鉴定本质上同源的DNA序列。高度严谨条件将包括在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃与结合在滤膜上的DNA杂交，并在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃清洗(Ausubel，F.M.等编，1989年，分子生物学通用方案Current Protocols inMolecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates公司，和John Wiley & Sons公司，纽约，第2.10.3页)。确定合适的杂交条件属于本领域技术范围之内。参阅，例如，Maniatis等，见上文；DNA Cloning，第1卷和第2卷，见上文；核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)，见上文。
DNA构建体的“异源”区指位于另一种DNA分子内或附着于另一种DNA分子上且在自然界中没有发现与该另一种分子相关联的可识别DNA区段。
“融合蛋白”常常定义为包含编码前导序列或稳定多肽的第一区域和编码异源蛋白质的第二区域的基因的表达产物。它包括包含抗原性蛋白片段或全长腺病毒蛋白序列以及异源序列的多肽，所述异源序列通常是前导序列，其功能是实现胞内表达多肽在重组宿主中的分泌。抗原性蛋白片段的长度常常是大约5-7个氨基酸。
“重组”多肽指通过重组DNA技术生成的多肽。
“本质上纯的”蛋白质将不含其它蛋白质，优选至少10％均一，更优选60％均一，且最优选95％均一。
“传染性”指具有将腺病毒基因组投递到细胞中的能力。
“CAR”指感染和进入宿主细胞的过程中C亚组腺病毒相结合的细胞上的受体。它是Coksakie腺病毒受体的首字母缩略词。
“溶瘤”指本发明人类B亚组腺病毒以相对于正常细胞的实质选择性杀死肿瘤细胞、即同时基本上不伤害正常细胞的能力。
B.通用方法B亚组腺病毒基因组/编码区人B亚组腺病毒基因组可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。病毒，优选来自B亚组第3和34型的病毒，可用本领域众所周知的材料和方法增殖，包括A549细胞和标准的感染和培养技术。Hermiston，T.等，分子医学方法腺病毒方法及流程(Methods in Molecular MedicineAdenovirus Methods andProtocols)，W.S.M.Wold编辑，Humana Press，1999。病毒可用一种或多种技术进行纯化，包括氯化铯梯度条带离心。例如可参阅美国专利5,837,520和美国专利6,008,036。
通过在裂解溶液中裂解病毒颗粒可以制备供测序的病毒DNA，该裂解溶液优选包括10mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，0.6％SDS和1.5mg/ml链霉蛋白酶(Sigma Corporation)。该溶液优选是37℃。
用酚/氯仿提取裂解的病毒颗粒，并用乙醇沉淀病毒DNA。将纯化的病毒DNA溶于重蒸水中并用于DNA测序。
然后，用适当的限制性酶对来自B亚组腺病毒第3或34型的病毒DNA进行限制性酶切，优选用Sau 3AI，随后用1％的琼脂糖凝胶分离酶切后的DNA。用商品化的DNA凝胶提取试剂盒(Qiagen Corporation)纯化大小在0.8kb和1.2kb之间的片段，并随后克隆入预先用相匹配的限制性酶消化的适当载体中。如实施例中所进一步描述的，可用BamHI消化载体pGem-7zf(+)(Promega Corporation)。
接着，用自动测序仪CEQ20000XL(Beckman)和标准的T7和SP6测序引物对数百个单独克隆进行测序。用SeqMan软件(DNAStar Inc.)建立毗连序列群(contigs)。基于已建立的序列，合成寡核苷酸并可进行引物步行法直至所有的毗连序列群都连接起来。如下所述，至少进行两次独立的测序以覆盖大部分区域。
本发明公布了人B亚组第3和34型的完整核苷酸基因组序列。分别参阅图1和图2。
此外，还显示了这些病毒的某些区域的核苷酸序列，包括E1A(图3和5分别对应于第3和34型)以及E1A区域的氨基酸序列(图4和6分别对应于第3和34型)。对于腺病毒第3和34型而言，也对编码55K蛋白的E1B区的核苷酸编码序列以及它们的氨基酸序列分别如图1和图2所示。
除了人B亚组腺病毒第3和34型的基因组序列之外，也对这些病毒的多个区域进行测序并确定了氨基酸序列。如图3。
重组子在某一实施方案中，本发明确定并提供了一种缺失人B亚组腺病毒部分或全部核苷酸序列(包括E1区域，尤其是E1B区域和/或E3区域)的方式。如果需要，可插入编码外源基因或其片段的异源或同源核苷酸序列以产生人腺病毒重组体。所谓“缺失部分核苷酸序列”是指利用常规的遗传工程技术缺失E1和/或E3区域部分的核苷酸序列。
利用本领域公认的技术完成插入，包括但不局限于，限制性酶切、核酸酶消化、连接、激酶和磷酸酶处理、DNA聚合酶处理、逆转录酶处理和化学寡核苷酸合成。将目的外源核酸序列克隆入质粒载体，从而使外源序列两侧连接与其待定向插入的腺病毒基因组区域基本上同源的序列。然后将这些构建体引入被目的B亚组病毒共感染的宿主细胞中。在感染期间，这些构建体和腺病毒基因组之间将发生同源重组，从而产生重组腺病毒载体。如果插入发生在腺病毒基因组的必需区，则重组腺病毒载体将在补充由于该插入而丧失的病毒功能的辅助细胞系中增殖。
优选的腺病毒缺失是编码癌蛋白55K的E1B区域全部或部分被去除的缺失。此缺失导致产生复制缺陷的B亚组腺病毒。类似的，通过在E1B区进行选择突变，有可能产生复制缺陷的B亚组腺病毒。参阅美国专利6,080,578。所述的复制缺陷型B亚组腺病毒对于缺乏p53功能的肿瘤细胞而言将具有肿瘤消退的作用，且主要通过非CAR机制感染肿瘤细胞。因为CAR高水平的存在于肝细胞中且在肿瘤细胞中常常有所减少，因此与例如C亚组腺病毒相比较而言，B亚组复制缺陷型腺病毒将具有增强的全身活性，不易被肝所摄取。因此，当与C亚组腺病毒相比较时，它将同时呈现出较高水平的肿瘤消退活性。
在本发明的备选实施方案中，可以构建这样的重组B亚组腺病毒，其中包含在编码E1a癌蛋白的E1a位点中的缺失或突变，这会造成E1a蛋白质基本上不能与被感染细胞中的RB蛋白形成复合物。参阅，例如，美国专利5,801,029。
此类型重组B亚组病毒的优势在于它基本上不能有效隔离被感染的非肿瘤细胞中的RB蛋白，这导致所引入的重组腺病毒不能在非肿瘤细胞中表达复制表型。相反，缺乏功能性RB蛋白质的肿瘤细胞则通过引入的重组腺病毒而支持复制表型的表达，从而通过腺病毒的致细胞病变效应导致肿瘤细胞的消融。
在这些实施方案的优选变化方案中，重组B亚组腺病毒包含编码突变E1a蛋白的E1a位点，此突变的E1a蛋白缺乏能结合pRB(和/或300kD多肽和/或107kD多肽)的结构域，但包含能反式激活腺病毒早期基因的功能性E1a结构域。有关这些实施方案的其它变化形式包括重组腺病毒包含基本上不能表达可结合并灭活pRB的蛋白质的非功能性E1a位点。
在另一实施方案中，本发明提供了高效构建、分离和增殖E3缺陷型重组B亚组腺病毒(有或无异源序列插入)的组合物和方法。这包括在适当的细胞系中分离重组病毒，表达腺病毒E1功能或相应的细胞系，以及在适当的宿主细胞中通过同源重组构建重组基因组、将由此获得的重组基因组转染入适当的细胞系中以及从被转染的细胞中分离重组病毒的方法，参阅，例如，美国专利6,492,169。
在本发明的某一实施方案中，重组腺病毒B亚组表达盒可通过用一种或多种适当的限制性酶切割野生型基因组产生病毒限制性片段而获得，所述的病毒限制性片段分别包括，例如E1，优选编码结合pRB的癌蛋白的E1A、或者编码结合p53的55K蛋白的E1B，或者E3区序列。病毒限制性酶切片段可插入诸如质粒等克隆载体中，然后可将至少一种异源序列(可以编码或不编码外源蛋白质)插入携带或未携带可操作性连接的真核转录调控序列的选定病毒区中。使重组表达盒与B亚组腺病毒基因组接触，并通过在适当的宿主细胞中进行同源重组或其它常规遗传工程方法获得预期的重组体。
适当的宿主细胞包括会支持B亚组腺病毒基因组和含病毒序列的质粒之间、或者各自包含病毒序列的两个或多个质粒之间进行重组的任何细胞。重组可在诸如大肠杆菌等原核细胞中进行，而为了产生病毒颗粒而进行的含病毒基因组的质粒转染则在真核细胞中完成，优选哺乳动物细胞，更优选293细胞及它们的同等物。细菌细胞培养物的生长以及真核细胞和哺乳动物细胞系的培养和维持方法是本领域技术人员众所周知的。
可将一种或多种异源序列插入腺病毒B亚组基因组的一个或多个区域以产生重组病毒载体，这只受病毒基因组插入容量以及重组病毒载体表达所插入的异源序列的能力所限制。以此方式可产生融合蛋白质。通常，腺病毒基因组可接受大约为5％基因组长度的插入片段而仍能被包装入病毒颗粒中。通过缺失非必需区和/或缺失其功能可由辅助细胞系提供的必需区，可增加插入的容量。
在本发明的某一实施方案中，通过构建质粒完成插入，该质粒中含有插入片段预期插入的B亚组腺病毒基因组区域。然后将所述质粒用在质粒的病毒部分具有识别序列的限制性酶消化，并将异源序列在该限制性酶消化位点插入。将含有携带已插入异源序列之病毒基因组部分的质粒与腺病毒基因组或含腺病毒基因组的线性化质粒一起共转化入细菌细胞(诸如，大肠杆菌)中，其中的腺病毒基因组可以是全长的基因组或者可以含有一个或多个缺失。质粒之间的同源重组产生了含有已插入的异源序列的重组腺病毒基因组。
为了提供异源序列插入的位点或者为了获得在不同位点进行插入的额外能力，可通过本领域技术人员众所周知的方法完成腺病毒B亚组序列的缺失。例如，为了将序列克隆入质粒中，可用一种或多种限制性酶(在病毒插入片段中具有至少一个识别序列)消化并随后连接，在某些情况下这会导致限制酶识别位点之间序列的缺失。
或者，在病毒插入片段内单一限制酶识别位点处的消化，随后用核酸外切酶处理后再连接，会导致邻近限制位点的病毒序列被缺失。如上所述构建的包含具有一个或多个缺失的一个或多个腺病毒基因组部分的质粒可与腺病毒B亚组基因组(全长或缺失型)或含有全长或部分缺失型病毒基因组的质粒一起共转染入细菌细胞中，通过同源重组产生含有在一个或多个特异位点具有缺失的病毒基因组的质粒。然后，通过用含有重组病毒基因组的质粒转染哺乳动物细胞，可以获得包含缺失的B亚组病毒。
在本发明的某一实施方案中，插入位点可邻近腺病毒启动子或在其下游(在转录意义上)。本领域技术人员可很容易的从此处所提供的B亚组腺病毒核苷酸序列中确定启动子的位置和用作插入位点的限制性酶识别序列。或者，可利用各种体外技术在特殊位点插入限制酶识别序列或者在不含限制酶识别序列的位点处插入异源序列。所述方法包括，但不局限于，用于插入一个或多个限制酶识别序列的寡核苷酸介导的异源双链核酸分子形成(参阅，例如，Zoller等(1982)Nucleic Acids Res.106487-6500；Brennan等(1990)Roux′s Arch.Dev.Biol.19989-96；和Kunkel等(1987)Meth.Enzymology 154367-382)以及用于插入较长序列的PCR-介导的方法。参阅，例如Zheng等，(1994)Virus Research 31163-186。
如果异源序列另外包含在真核细胞中有活性的转录调控序列，也可能获得插入在并非腺病毒B亚组启动子下游的位点处的异源序列的表达。
本发明还提供了可用于调控异源基因表达的腺病毒B亚组调控序列。调控序列可以是，例如，转录调控序列、启动子、增强子、上游调控结构域、剪接信号、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、翻译调控序列、核糖体结合位点和翻译终止序列。
在另一实施方案中，本发明鉴定并提供了B亚组腺病毒基因组(和其片段)的其它区域，其适于插入编码外源基因或其片段的异源或同源核苷酸序列，以产生病毒重组体。在另一实施方案中，B亚组腺病毒基因组克隆可作为质粒增殖，并且可从含质粒的细胞中收获传染性病毒。
腺病毒核酸的存在可用本领域技术人员已知的技术检测，包括但不局限于，杂交试验、聚合酶链式反应以及其它类型的扩增反应。类似的，蛋白质检测的方法也是本领域技术人员众所周知的，包括但不局限于，各种类型的免疫检测法、ELISA、Western印迹、酶促检测法、免疫组化等。各种外源基因或核苷酸序列或编码序列(原核和真核的)可依照本发明插入腺病毒核苷酸序列中，例如DNA。
异源核苷酸序列可由一种或多种目的基因组成，优选有治疗效用的基因。在本发明的上下文中，目的基因可编码诸如干扰素和白介素等细胞因子；淋巴因子；负选择剂(例如，胸苷激酶)；诸如被致病生物体(病毒、细菌或寄生虫)所识别的受体等膜受体，优选被HIV病毒(人免疫缺陷病毒)识别的受体；或编码生长因子的基因。此名单并非限制性的，其它目的基因也可用于本发明的上下文中。
目的基因可以是基因组形式、互补DNA(cDNA)形式或混合形式(微型基因，其中至少一个内含子被缺失)。它可编码成熟的蛋白质、成熟蛋白质的前体、特别是意图被分泌并因此含有信号肽的前体、由多种来源的序列相融合所产生的嵌合蛋白质或者展示改良或修饰的生物学特性的天然蛋白质突变体。所述的突变体可通过天然蛋白质编码基因中一个或多个核苷酸的缺失、取代和/或添加，或者诸如转座或倒置等天然蛋白质编码序列中任何其它类型的变化来获得。
可将目的基因置于适于其在宿主细胞中表达的元件(DNA调控序列)控制下。合适的DNA调控序列被认为是指将基因转录成RNA(反义RNA或mRNA)以及mRNA翻译成蛋白质所需的一套元件。在转录所需的元件中，启动子被认为特别重要。它可以是组成型启动子或调控型启动子，且可分离自真核、原核或病毒来源及甚至腺病毒来源的任何基因。或者，它可以是目的基因的天然启动子。通常，可对用于本发明的启动子进行修饰以便包含调控序列。可以使用例如允许在大量细胞类型中表达的各种启动子，包括HSV-1TK(1型疱疹病毒胸苷激酶)基因启动子、腺病毒MLP(主要的晚期启动子)、尤其是人2型腺病毒的启动子、RSV(劳氏肉瘤病毒)LTR(长末端重复片段)、CMV(巨细胞病毒)早期启动子和PGK(磷酸甘油酸激酶)基因启动子。
可有效用于调控B亚组腺病毒重组体复制或其基因表达的启动子是E2F启动子，如美国专利09/714,409或EPA 1230378中所述。
通过构建重组六邻体和/或纤维基因可将重组B亚组腺病毒载体定向于特定的细胞类型。这些基因的蛋白质产物涉及宿主细胞的识别；因此，可将所述基因修饰成含有允许病毒识别备选宿主细胞的肽序列。
也可能只可使用基因核苷酸序列的片段(其中这些片段足以产生保护性免疫反应或特异的生物学效应)而非在野生型生物体中所发现的完整序列。
如果有可能，可以使用合成的基因或其片段。无论如何，本发明可利用广泛类型的基因、片段等，而并不局限于上文所提出的那些基因。
在某些情况下，特定抗原的基因可包含大量的内含子，或者可来自RNA病毒，在这些情况下可使用互补DNA拷贝(cDNA)。
为了使基因能成功的表达，可将其与合适启动子(包括增强子元件和多聚腺苷酸化序列)一起插入表达载体中。使得外源基因得以在哺乳动物细胞中成功表达的许多真核启动子和聚腺苷酸化序列以及如何构建表达盒的方法都是本领域所已知的，例如在美国专利5,151,267中有所描述，其内容在此收编作为参考。依照已知的标准选择启动子，以使免疫原性蛋白质得到最佳表达，并随之成功的产生体液型、细胞介导型和粘膜型免疫反应。
本发明还包括药物组合物，其中含有治疗有效量的重组人腺病毒B亚组病毒或依照本发明方法制备的来源于它的载体，并且与药用可接受载体和/或佐剂相联合。可依照本领域众所周知的技术制备所述的药物组合物并确定剂量。本发明的药物组合物可通过任何已知的施用途径施用，包括但不局限于，全身性的(例如，静脉内、气管内、血管内、肺内、腹膜内、鼻内、肠胃外的、经肠道、肌肉内、皮下、肿瘤内或颅内)施用或气雾化施用或肺内灌输。可单剂量施用或在某些时间间隔后一次或多次重复施药。适当的施用途径和剂量将随条件而变化(例如，被处理的个体、待治疗的病症或者目的基因或多肽)，但可由本领域技术人员决定。
在本发明的另一实施方案中，通过用表达所述载体所缺乏的功能的病毒共感染细胞，可补充(提供互补细胞系)E1功能(或在任一具体病毒载体中可能突变或缺失的其它病毒区域的功能)。
本发明还包括含有B亚组腺病毒表达载体的表达体系，其中例如DNA等异源核苷酸序列取代了部分或全部E3区、部分或全部E1或E1B区、部分或全部E2区、部分或全部E4区、E4和基因组右末端之间的部分或全部区域、部分或全部晚期区域(L1-L7)以及/或者部分或全部被五邻体基因所占据的区域。其中DNA等外源核苷酸序列受到或未受到任何其它异源启动子调控的表达体系都可使用。
本发明在人类基因治疗方面的实施旨在预防或治疗包括癌症、心血管疾病等病患，但不局限于这些疾病。当应用于治疗癌症时，腺病毒载体可与化学疗法联合使用。就本发明的目的而言，用本发明方法制备的载体、细胞和病毒颗粒可离体引入受试者中(即，在取自患者的一个或多个细胞中)，或者直接引入待治疗的个体体内。优选地，宿主细胞是人细胞，更优选是肺细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞或淋巴细胞或者造血系统细胞。
本发明的腺病毒可配制成针对患者进行治疗和诊断性应用。就治疗或预防应用而言，可将含药理学有效量的腺病毒的无菌组合物施用于待治疗的人类患者或非人类患病牲畜，例如患癌症的人类患者或牲畜。通常，组合物在水性悬浮液中将包含大约103-1015个或更多的腺病毒颗粒。药用可接受载体或赋形剂常常在这种无菌组合物中应用。可以使用各种水性溶液，例如，水、缓冲水溶液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等等。这些溶液是无菌的，并且通常除了所需的腺病毒载体之外不含其它微粒物质。组合物中可包含达到生理学条件所需的药用可接受辅助物质，诸如pH调节和缓冲试剂、毒性调节试剂等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。可包括增强腺病毒的细胞感染能力的赋形剂。
本发明的B亚组腺病毒或其中所含的DNA也可通过脂质体或免疫脂质体投递方法投递至肿瘤细胞中；所述的投递可基于肿瘤细胞群中存在的细胞表面特性(例如，存在与免疫脂质体中的免疫球蛋白可结合的细胞表面蛋白质)选择性的靶向肿瘤细胞。通常，含病毒粒子的水性悬浮液被封装于脂质体或免疫脂质体中。
例如，腺病毒病毒粒子悬浮液可用常规方法包裹在微团中以形成免疫脂质体(美国专利5,043,164、美国专利4,957,735、美国专利4,925,661；Connor和Huang(1985)J.Cell Biol.101582；LasicDD(1992)Nature 355279；新的药物传送方法(Novel DrugDelivery)(Prescott LF和Nimmo WS编Wiley，New York，1989)；Reddy等(1992)J.Immunol.148第1585页)。
可利用含有能与个体的癌细胞上所存在的癌细胞抗原(例如CALLA、CEA)特异结合的抗体的免疫脂质体来将病毒粒子或病毒粒子DNA靶向于那些细胞。
可施用含本发明腺病毒的组合物或它们的混合物来治疗肿瘤性疾病。在治疗性应用中，将组合物施用于受某具体肿瘤疾病影响的患者，施用剂量足以治愈或至少部分缓解病情及其并发症。足以达到此目的的剂量被定义为“治疗有效剂量”或“有效剂量”。就此应用而言的有效量取决于疾病的严重程度、患者的总体状况以及施用途径。
下文所述的是本发明的实施例。这些实施例只供说明，而不希望以任何方式局限本发明的范围。根据本发明的内容，在本发明权利要求范围内的许多实施方案对于本领域技术人员而言是明白清楚的。说明书中所引用的参考文献的内容在此收编作为参考。
实施例实施例1腺病毒第3型和第34型的基因组序列人类B亚组腺病毒第3型和第34型(下文也分别称为Ad3或Ad34)由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得。使用标准的感染和培养技术，在同样可由ATCC获得的A549细胞中繁殖病毒。通过氯化铯梯度条带离心纯化这两种病毒。
由氯化铯梯度成带病毒颗粒通过在含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA、0.6％SDS、和1.5mg/ml链霉蛋白酶(Sigma公司)的溶液中裂解病毒颗粒获得病毒DNA。溶液处于37℃。将裂解后的颗粒用酚/氯仿抽提两次，并用乙醇沉淀病毒DNA。将纯化后的病毒DNA溶于蒸馏水并用于DNA测序。
接着，将病毒DNA用Sau3A I进行有限消化，随后在1％琼脂糖凝胶中拆分消化后的DNA。使用商品化DNA凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)纯化大小在0.8kb和1.2kb之间的片段，随后克隆到经过BamH I消化的载体pGem-7zf(+)(Promega公司)中。
使用自动化测序仪CEQ20000XL(Beckman)，用T7和SP6测序引物，对200个单克隆测序。使用SeqMan软件(DNAStar公司)构建毗连序列群。根据构建的序列，合成寡核苷酸并进行引物行走，直至将所有毗连序列群连接起来。大多数区域被至少2次独立测序所覆盖。
实施例2Ad34主链上E1B 55K缺失病毒的构建质粒构建对基于pGEM(Promega公司)的载体进行修饰，并用于克隆、亚克隆相关核苷酸序列。质粒构建基于以下事实Ad34基因组中距左末端6.5kb处存在唯一的Nhe I限制位点。质粒构建由用HindIII消化Ad34基因组(15ug)开始。在1％琼脂糖凝胶上分离大小为2.2kb和3.4kb的两个片段，并使用Bio101基因清洁试剂盒纯化。将该2.2kb片段连接到事先用HindIII消化过的pGEM-7Z(Promega)中。通过限制性作图对构建体评估正确片段和定向。将此构建体称为2.2/pGEM-7Z。接着，通过用Nhe I和Cla I消化除去2.2/pGEM7Z构建体中Nhe I位点附近的HindIII位点，然后用Klenow补平，并重连。使用PCR引物P04 Fwd(5′CATGAGCTCGCGGCCGCCATCATCAATAATATACCTTATAGA-3′)和Ad34-1370B(5′GGCTTAAGCTTCACAGGAA-3′)、lng基因组模板DNA、和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)通过PCR(美国专利号4,683,202)生成Ad34基因组的前1.4kb。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，用Sac I和Hind III进行消化，在1％琼脂糖凝胶上进行分离，并用Bio101基因清洁试剂盒进行纯化。将纯化后的1.4kb片段连接到用Sac I和Hind III消化过的2.2/pGEM-7Z中，生成1.4/2.2/pGEM-7Z构建体。将3.4kb片段连接到事先用Hind III消化过的pGEM-9Z(Promega)中。通过限制性作图对构建体评估正确片段和定向。
由于E1B19K和E1B55K基因存在交叠，通过在E1B55K起始位点的后面引入终止密码子并缺失E1B19K终点与剩余E1B55K基因之间的序列而实现了E1B55K基因的灭活。
缺失的区域以Pme I位点取代。E1B55K的诱变使用两步PCR过程对3.4/pGEM9Z构建体进行。来自第一步PCR的产物是使用PCR引物P02 fwd(5′-CCCTCCAGTGGAGGAGGCGGAGTAGGTTTAAACGGTGAGTATTGGGAAAACTTGGGGT-3′)、P03 Rev(5′-TAGCATAGGTCAGCGTTGAAGAAT-3′)、10ng 3.4/pGEM-9Z模板DNA、和Faststart DNA聚合酶(Roche)生成的。第二步PCR是使用PCR引物P01 fwd(5′-ATAAATGGATCCCGCAGACTCATTTTAGCAGGGGATACGTTTTGGATTTCG-3′)和来自第一个PCR反应的产物、10ng 3.4/pGEM9Z模板DNA、和Faststart DNA聚合酶(Roche)生成的。将PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化、用BsmB I和BamH I消化、在2％琼脂糖凝胶上分离、并用Bio101基因清洁试剂盒纯化。将纯化后的E1B55K缺失片段连接到事先用BsmB I和BamH I消化过的3.4/pGEM9Z中，生成3.4Δ55K/pGEM-9Z。为了装配1.4kb、2.2kb片段、和3.4Δ55K片段，用Hind III消化3.4Δ55K/pGEM-9Z构建体，在1％琼脂糖凝胶上分离3.4Δ55K片段，并用Bio101基因清洁试剂盒纯化。将纯化后的3.4Δ55K片段连接到用Hind III消化过并用CIP处理过的1.4/2.2/pGEM-7Z构建体中，生成穿梭载体SV13。
对穿梭载体SV13测序后，发现1.4kb片段中存在一个点突变，它是由PCR中的错误引起的。为了纠正这个错误，使用相同PCR条件但使用校正DNA聚合酶(购自Strategene)的Pfu生成新的1.4kb PCR产物。
将纯化后的1.4kb片段连接到用Not I和BmgB I消化过的SV13穿梭载体中，生成穿梭载体SV2-5。该构建体通过测序得到了证实。病毒构建和分离如S.Miyake等(PNAS 1996)所述制备B亚组腺病毒第34型(Ad34)(ATCC)TP DNA。为了构建Ad34ΔE1B55K病毒，用Not I和Nhe I消化SV2-5构建体(8.5ug)，在1％琼脂糖凝胶上分离，并用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)纯化。然后将5ug该片段于室温O/N连接到0.25ug已用Nhe I于37℃消化6小时的AD34-TP DNA中。使用哺乳动物转染试剂盒(Stratagene)，依照制造商的方案，将连接混合物转染到位于60mm培养皿、添加2％FBS的DMEM中的HEK293细胞中。将转染物于37℃/3％CO2O/N保温24小时。24小时后停止转染，即除去培养基，并换入添加了2％FBS、2％L-谷氨酰胺、1％PS的DMEM，然后于37℃/5％CO2保温24小时。用含有2％FBS、2％L-谷氨酰胺、1％NEAA、1％PS、和1.5％SeaPlaque琼脂糖的DMEM感染培养基覆盖细胞，并且每2-3天用新鲜的覆盖培养基供料。分离噬斑，在HEK293细胞中增殖，并使用QIAamp DNA血液试剂盒(QIAGEN)遵循制造商的建议分离病毒DNA。使用下列引物SV fwd05(5′-GGAAGACCTTAGAAAGACTAGGC-3′)和P03 Rev(5′-TAGCATAGGTCAGCGTTGAAGAAT-3′)，通过PCR对病毒筛选E1B55K缺失区。PCR是使用Faststart DNA聚合酶(Roche)在下列循环条件下进行的1个循环的94℃5分钟，25-30个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒-90秒，以及1个循环的72℃7分钟，最后4℃不限时。将阳性噬斑在293/E4细胞(MicrobixBiosystems公司)上纯化4轮。用引物3.4fwd03(5′-GGGATGAAGTTTCTGTATTGC-3′)和3.4rev12(5′-GTCACATCTACACACACCGG-3′)通过PCR对所有病毒分离物筛选EIB55K缺失和内部Ad34野生型E1B55K序列。
Ad34ΔE1B55K病毒、穿梭载体、SV2-5保藏于美国典型培养物保藏中心，编号分别是______和______。
虽然出于清楚理解的目的已经较为详细的描述了本发明作为例示，但是显然可以在权利要求的范围内进行某些改变和修改。
权利要求
1.用于消除细胞群中的肿瘤细胞的方法，包括下列步骤在感染条件下使(1)重组复制缺陷型B亚组腺病毒接触(2)包含非肿瘤细胞和肿瘤细胞的细胞群，从而产生受感染细胞群；所述腺病毒缺乏能够与功能性肿瘤抑制基因产物相结合的经表达的病毒癌蛋白，所述非肿瘤细胞包含能够与病毒癌蛋白形成结合复合物的所述功能性肿瘤抑制基因产物，所述肿瘤细胞缺乏该功能性肿瘤抑制基因产物。
2.权利要求1的方法，其中所述肿瘤抑制基因是p53或pRb。
3.权利要求2的方法，其中所述病毒癌蛋白包含腺病毒E1b或E1A多肽。
4.权利要求3的方法，其中所述B亚组腺病毒选自第3型或第34型。
5.治疗患者癌症的方法，包括下列步骤对所述患者施用重组复制缺陷型B亚组腺病毒，所述腺病毒缺乏能够与功能性肿瘤抑制基因产物相结合的经表达的腺病毒癌蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述B亚组腺病毒选自第3型或第34型。
7.权利要求6的方法，其中所述腺病毒癌蛋白包含E1b或E1A多肽。
8.包含图1中所示核苷酸序列的重组B亚组第3型人类腺病毒。
9.在严谨条件下与图1中所示核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。
10.包含图2中所示核苷酸序列的重组B亚组第34型人类腺病毒。
11.在严谨条件下与图2中所示核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。
12.权利要求8的重组B亚组第3型人类腺病毒，其在编码分别与pRb或p53相结合的癌蛋白的E1A和/或E1B区域中包含突变，所述突变可分别减轻或消除所述癌蛋白与pRb或p53的结合。
13.权利要求12的重组人类腺病毒，其中所述突变是缺失或点突变。
14.权利要求10的重组B亚组第34型人类腺病毒，其在编码分别与pRb或p53结合的癌蛋白的E1A和/或B1B区中包含突变，所述突变分别减轻或消除所述癌蛋白与pRb或p53的结合。
15.权利要求14的重组人类腺病毒，其中所述突变是缺失或点突变。
16.图1或2中显示的核苷酸序列，其中包含编码E1B 55K蛋白质的区域，或者在严谨条件下与所述序列发生杂交的核苷酸序列。
17.由图1或2中所示核苷酸序列编码的E1B 55K蛋白质，或者由在严谨条件下与所述序列发生杂交的核苷酸序列编码的蛋白质。
全文摘要
本发明提供了使用人B亚组腺病毒治疗疾病的方法和组合物，由这种病毒衍生的载体，包括其中一个或多个B亚组腺病毒基因被外源基因所替代的表达载体系统。
文档编号C12N15/86GK1934253SQ200480019901
公开日2007年3月21日 申请日期2004年6月22日 优先权日2003年7月18日
发明者Y·J·沈, A·沈, A·佩雷斯, E·塞维拉, A·阿斯佩伦德 申请人:昂尼克斯药物公司