专利名称：一种蛋白酶及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶学中的一种蛋白酶及其制备工艺。
背景技术：
近年来，美国、日本等各发达国家十分重视骨系列食品的开发研制，诸如骨松、骨泥、骨味素、骨味汁等。我国生猪饲养约占世界总量的46％，年出拦肉猪达4.8亿头，猪骨占胴体的12.9％，猪骨的营养价值高，充分利用尤其重要。而目前还未被很好利用，尤其是胴杂骨，甚至废弃污染环境。从中国蓖种西南保藏中心筛选出的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeraginosa)PA303，该菌株产生的胞外酶能水解骨汁蛋白，但该菌株产酶量很低，发酵液酶活低，仅76U/ml。
发明内容
为了充分利用猪骨资源开发骨系列食品，通过生物酶技术转化，利用猪骨生产骨味素及其副产品。本发明研制了一种蛋白酶及其制备工艺，以铜绿假单胞菌PA303为出发菌株，经紫外线照射和CO2激光幅射复合诱变与底物诱导相结合，引起菌体DNA突变、染色体畸变、酶的激活和钝化而筛选得到一种能产生中性蛋白酶的变异株PA303-023，用该变异株做菌种发酵制备中性蛋白酶水解骨汁，使骨蛋白的水分解度达42.4％，且骨蛋白经中性蛋白酶降解成多种氨基酸和多肽后，营养价值、功能性质和生理效果显著提升。制备的工艺流程是(1)将菌种接种在斜面试管内进行培养；(2)将在斜面试管内经过培养的菌种植入三角瓶培养基内进行培养；(3)将在三角瓶内经过培养的菌种植入种子发酵罐内进行培养，发酵罐内的空气需先经空气压缩机压缩并经过空气过滤系统杀菌过滤处理。
(4)按配方称量好原辅材料，并进行杀菌处理；(5)将原料和种子发酵内的菌种置于发酵罐内进行培养，发酵罐内的空气需先经过杀菌过滤处理；(6)发酵完成后对发酵的原料进行压滤分离，滤渣作饲料用；将滤液收集到清液桶内再用超滤器进行过滤；
(7)对滤液进行浓缩处理后得浓缩酶液。
将铜绿假单胞菌PA303置于培养基中进行菌种诱变选育，培养基包括种子培养基、粗筛培养基、复筛培养基、摇瓶发酵培养基；每100ml种子培养基中有牛肉膏0.5g、NaCl 0.5g、蛋白胨0.8g、骨汁3ml；每100ml粗筛培养基中有明胶2g、蛋白胨0.4g、猪骨汁2ml、葡萄糖1g、KH2PO40.05g、MgSO4.7H2O 0.02g、NaCl 0.01g、琼脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5；每100ml复筛培养基中有葡萄糖2g、酵母膏0.15g、猪骨汁2ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.25g、KH2PO4.2H2O 0.04g、琼脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5；每100ml摇瓶发酵培养基中有葡萄糖2g、黄豆粉4g、蛋白胨2g、猪骨汁4ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O0.04g、PH7.0-7.5。对培养后的出发菌株进行紫外线照射诱变是用15W的紫外灯管，照射距离30cm，照射时间5min；CO2激光辐辐射诱变是将经紫外线诱变后的出发菌株经筛选后进行，激光束光斑直径Φ0.4cm，照射距离20cm，照射时间30s，激光器的输入电压210V、功率10W；用紫外线和激光辐射反复诱变，并在培养基中加入猪骨汁进行底物诱导而获得变异株PA303-023。发酵制酶工艺是(1)种子培养a、以变异株PA303-023为菌种，植入斜面试管菌种培养，每100ml培养基中有葡萄糖2g、黄豆粉4g、蛋白胨2g、猪骨汁4ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.04g、琼脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5、121℃灭菌20min，接种32℃培养48h后，转入冰箱保存备用。b、植入三角瓶种子培养，培养基用摇瓶发酵培养基，接种量为1接种环，32℃振荡培养20h；c、植入30L种子罐培养，培养基每升葡萄糖20g、黄豆50g、蛋白胨20g、猪骨汁40ml、CaCl20.2g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.4g、PH7.0-7.5，装量15L，121℃罐内湿热灭菌20min，冷却至32℃，接入三角瓶种子，接种量5％，温度32℃，搅拌转速300r/min，通气比1∶1，罐压0.05Mpa，培养18h；(2)200L发酵罐发酵发酵培养基每升有葡萄糖25g、黄豆粉60g、蛋白胨20g、猪骨汁40ml、CaCl20.2g、K2HPO4.3H2O 2.8g、KH2PO4.2H2O 0.4g、pH7.0-7.5，装量(含种子)120L，121℃罐内湿热灭菌20min，冷却至32℃，接入种子罐培养的种子，接种量10％；控温32℃，搅拌转速250r/min，通气比1∶0.8，罐压0.05Mpa，用单硬脂酸甘油酯作消泡剂，发酵72h，检测发酵液酶活力达950U/m。(3)提制酶液发酵液经板框压滤机压滤，除去菌体后，经截流分子量为10000D的中空纤维超滤器超滤，除去无机盐及其它杂质，浓缩5倍得到浓缩酶液22L，检测酶活力达4650U/ml，-10℃冷冻储存。本发明采用紫外线照射和CO2激光辐射对铜绿假单胞菌PA303复合诱变，并结合底物诱导的方法，选育出一种能产生中性蛋白酶的变异株PA303-023，再用该变异株做菌种，发酵制备能水解骨汁的中性蛋白酶，发酵液酶活提升到950U/ml，比出发菌株PA303提高了12.4倍，且变异株的遗传性能稳定，是优良的工业生产菌株。
图1是制备的工艺流程图，图2是实施例的菌种选育技术路线图。
具体实施例方式由图1、图2，对培养后的出发菌株进行紫外线照射诱变，紫外线灯管15W，照射距离30cm，照射时间5min。经筛选后，又用CO2激光辐射诱变，激光束光斑直径0.4cm，照射距离20cm，照射时间30s，激光器的输入电压210V、功率10W。用这两种反复诱变，并在培养基中加入猪骨汁进行底物诱导，筛选获得变异株PA303-023，发酵后产中性蛋白酶由初始的76U/ml上升到940U/ml，提高了12.4倍。经8次传代培养，产酶活性稳定在940U/ml左右，性能稳定，选育效果显著。变异株PA303-023经200L/ml发酵罐发酵，发酵液平均酶活力达到950U/ml。发酵工艺参数为接种量10％，温度32℃，搅拌转速250r/min，通气比1∶0.8，罐压0.05Mpa，起始PH7.5，时间72h。
权利要求
1.一种蛋白酶及其制备工艺，其特征在于以铜绿假单胞菌PA303为发出菌株，经紫外线照射和CO2激光辐射复合诱变与底物诱导相结合，筛选得到一种能产生中性蛋白酶的变异株PA303-023，再用该变异株做菌种，发酵制备能水解骨汁的中性蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白酵及其制备工艺，其工艺流程是(1)将菌种接种在斜面试管内进行培养；(2)将在斜面试管内经过培养的菌种植入三角瓶培养基内进行培养；(3)将在三角瓶内经过培养的菌种植入种子发酵罐内进行培养，发酵罐内的空气需先经空气压缩机压缩并经过空气过滤系统杀菌过滤处理。(4)按配方称量好原辅材料，并进行杀菌处理；(5)将原料和种子发酵内的菌种置于发酵罐内进行培养，发酵罐内的空气需先经过杀菌过滤处理；(6)发酵完成后对发酵的原料进行压滤分离，滤渣作饲料用；将滤液收集到清液桶内再用超滤器进行过滤；(7)对滤液进行浓缩处理后得浓缩酶液。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白酶及其制备工艺，其特征在于将铜绿假单胞菌PA303置于培养基中进行菌种诱变选育，培养基包括种子培养基、粗筛培养基、复筛培养基、摇瓶发酵培养基；每100ml种子培养基中有牛肉膏0.5g、NaCl 0.5g、蛋白胨0.8g、骨汁3ml；每100ml粗筛培养基中有明胶2g、蛋白胨0.4g、猪骨汁2ml、葡萄糖1g、KH2PO40.05g、MgSO4.7H2O 0.02g、NaCl 0.01g、琼脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5；每100ml复筛培养基中有葡萄糖2g、酵母膏0.15g、猪骨汁2ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.25g、KH2PO4.2H2O 0.04g、琼脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5；每100ml摇瓶发酵培养基中有葡萄糖2g、黄豆粉4g、蛋白胨2g、猪骨汁4ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.04g、PH7.0-7.5。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白酶及其制备工艺，其特征在于对培养后的出发菌株进行紫外线照射诱变是用15W的紫外灯管，照射距离30cm，照射时间5min；CO2激光辐射诱变是将经紫外线诱变后的出发菌株经筛选后进行，激光束光斑直径Φ0.4cm，照射距离20cm，照射时间30s，激光器的输入电压210V、功率10W；用紫外线和激光辐射反复诱变，并在培养基中加入猪骨汁进行底物诱导而获得变异PA303-023。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白酶及其制备工艺，其特征在于发酵制酶工艺是(1)种子培养a、以变异株PA303-023为菌种，植入斜面试管菌种培养，每100ml培养基中有葡萄糖2g、黄豆粉4g、蛋白胨2g、猪骨汁4ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.04g、琼脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5、121℃灭菌20min，接种32℃培养48h后，转入冰箱保存备用；b、植入三角瓶种子培养，培养基用摇瓶发酵培养基，接种量为1接种环，32℃振荡培养20h；c、植入30L种子罐培养，培养基每升葡萄糖20g、黄豆50g、蛋白胨20g、猪骨汁40ml、CaCl20.2g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.4g、PH7.0-7.5，装量15L，121℃罐内湿热灭菌20min，冷却至32℃，接入三角瓶种子，接种量5％，温度32℃，搅拌转速300r/min，通气比1∶1，罐压0.05Mpa，培养18h；(2)200L发酵罐发酵发酵培养基每升有葡萄糖25g、黄豆粉60g、蛋白胨20g、猪骨汁40ml、CaCl20.2g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.4g、PH7.0-7.5，装量(含种子)120L，121℃罐内湿热灭菌20min，冷却至32℃，接入种子罐培养的种子，接种量10％；控温32℃，搅拌转速250r/min，通气比1∶0.8，罐压0.05Mpa，用单硬脂酸甘油酯作消泡剂，发酵72h，检测发酵液酶活力达950U/ml；(3)提制酶液发酵液经板框压滤机压滤、除去菌体后，经截流分子量为10000D的中空纤维超滤器超滤，除去无机盐及其它杂质，浓缩5倍得到浓缩酶液22L，检测酶活力达4650U/ml，-10℃冷冻储存。
全文摘要
本发明是一种蛋白酶及其制备工艺，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeraginosa)PA303为出发菌株，经紫外线照射和CO
文档编号C12N13/00GK1872998SQ20051002101
公开日2006年12月6日 申请日期2005年5月30日 优先权日2005年5月30日
发明者赵勤 申请人:四川高金翔达食品有限公司