专利名称：小鼠DNA聚合酶δ相互作用蛋白基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及小鼠基因，具体涉及DNA聚合酶δ相互作用蛋白基因。
背景技术：
在真核细胞中，已发现四种参与DNA复制的DNA聚合酶，即DNA聚合酶α、DNA聚合酶β、DNA聚合酶γ、DNA聚合酶δ。DNA聚合酶α负责起始DNA前导链和后随链的复制，然后由DNA聚合酶δ负责前导链和后随链的延伸。DNA聚合酶δ在DNA前导链的持续延伸过程中需要蛋白质辅因子-增殖细胞核抗原(PCNA)的参与。哺乳动物的DNA聚合酶δ包含一个催化亚基和一个小亚基，其中小亚基不行使酶的功能，但是对DNA聚合酶δ和PCNA的相互作用是必需的。
He等人通过酵母双杂交技术发现一个可与DNA聚合酶δ小亚基相互作用的新蛋白，并命名为PDIP1(DNA polymerase delta-interacting protein 1)，进一步研究发现，该蛋白还能与PCNA相互作用并在PCNA存在时促进DNA聚合酶δ的活性(He等，2001，Pro.Natl Acad.Sci.USA.，9811979-11984)。He等人还发现人类PDIP1基因的表达受TNF α诱导。
PDIP1蛋白能够促进DNA聚合酶δ的活性，而DNA聚合酶δ是真核细胞DNA复制的主要聚合酶，并且还参与DNA修复，因此PDIP1很可能参与DNA的复制，而且还具有促进DNA修复和抗细胞凋亡作用。PDIP1基因的表达可以被TNF-α所诱导，而TNF-α是一种多功能的细胞因子，参与细胞的复制、凋亡等的调控，因此，PDIP1基因家族可能在TNF-α诱导和DNA复制/修复之间起到了一个桥梁作用。研究小鼠的PDIP1基因及其功能，对治疗细胞调亡相关疾病的药物开发具有十分重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了在小鼠细胞中克隆出人类PDIP1基因的同源基因-小鼠的PDIP1基因，以便用小鼠动物模型研究PDIP1基因的功能以及PDIP1基因与人类疾病的关系。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。本发明应用生物信息学、cDNA末段快速扩增、分子克隆、DNA测序等手段克隆了小鼠PDIP1基因的全长cDNA，并对其功能进行了研究。
下面结合附图进一步详述本发明。
图1.PDIP1基因的cDNA核苷酸序列和编码的氨基酸序列。图中粗体的ATG和TGA表示开放阅读框的起始密码子和终止密码子。
图2.小鼠PDIP1、大鼠PDIP1和人PDIP1蛋白的氨基酸序列比较。一致序列用反白的字体表示。
图3.小鼠PDIP1蛋白与PCNA相互作用的GST-Pulldown实验结果。1.蛋白质分子量标准，2.GST-PDIP1+PCNA，3.GST+PCNA。
图4.小鼠PDIP1蛋白与PCNA相互作用的免疫共沉淀实验结果。
图5.小鼠PDIP1蛋白在PCNA存在下促进DNA聚合酶δ活性。
图6.TNF-α诱导小鼠PDIP1基因的表达。
本发明用人的PDIP1的cDNA序列去搜索GenBank的小鼠EST数据库，发现两段部分重叠的EST序列(GenBank登陆号分别为AI849007和AA546545)和人PDIP1基因cDNA高度相似，我们将这两段EST序列拼接成一段1006bp的重叠群。然后，根据AI849007的5’端序列和AA546545的3’端序列设计一段引物，用PCR扩增出一段1006bp的序列并测序。最后，用cDNA末段快速扩增(RACE)的方法分别扩增出这段1006bp序列的两侧序列。经测序后，拼接出小鼠PDIP1基因的全长cDNA。用小鼠PDIP1的cDNA搜索小鼠基因组DNA序列数据库，发现小鼠PDIP1基因位于小鼠第7号染色体的7F3区域内，基因全长16.7kb，含有6个外显子。
小鼠PDIP1的cDNA全长为1674bp，含有一个990bp的完整开放阅读框，编码一个含329个氨基酸的蛋白质(图1)。小鼠PDIP1蛋白和人的PDIP1蛋白氨基酸序列非常相似，两者的序列一致性达91.8％。小鼠PDIP1蛋白41-138氨基酸为一个BTB/POZ结构域，249-255氨基酸(QTKVEFP)为一个与增殖细胞核抗原(PCNA)相互作用的基序(motif)(图2)。
本发明用体外GST-Pulldown(图3)和体内免疫共沉淀实验(图4)证实了PDIP1蛋白能够与PCNA相互作用。并证实PDIP1在PCNA存在下能够促进DNA聚合酶δ的活性(图5)；实验也发现重组小鼠TNF-α能显著诱导小鼠PDIP1基因的表达(图6)。
1小鼠PDIP1基因的cDNA编码区扩增和表达载体构建(1)小鼠PDIP1基因的cDNA编码区的扩增在37℃温度条件下，在5％CO2培养箱中用DMEM完全培养液(含10％新生牛血清，2mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素)培养NIH3T3细胞，然后采用大连宝生物公司的Catrimox-14RNA提取试剂盒，提取NIH3T3细胞的RNA；并采用德国Qiagen公司的Sensiscript反转录试剂盒，以所提取的RNA为模板，按照产品说明书反转录成cDNA。然后以cDNA作为模板用PCR扩增出小鼠PDIP1基因的cDNA编码区序列。PCR引物为正向5’-AAAGGTCGACTCCGCTCACTGGCATGT-3’
反向5’-GGGGTACCTCAGTCCTTGAAGACAATCTGT-3’。
(2)将PCR产物进行琼脂糖电泳，切下约1Kb大小的片段，用Qiagen的凝胶回收试剂盒纯化回收的扩增片段。
(3)用NEB公司生产的Sal I和KpnI酶切PCR扩增产物，然后连接到哺乳动物细胞表达载体pCMV-Myc(Clontech公司)中，得到在哺乳动物细胞表达PDIP1蛋白的表达载体pCMV-Myc-PDIP1，该载体可在培养的哺乳动物细胞中表达PDIP1蛋白。
(4)用NEB公司生产的Sal I和Not I酶切pCMV-Myc-PDIP1，回收约1Kb大小的片段，连接到Promega公司生产的原核表达载体pGEX-4T-2中，得到GST-PDIP1融合蛋白表达载体pGEX-4T-2-PDIP1，该表达载体可在大肠杆菌细胞中表达GST-PDIP1融合蛋白。
2重组小鼠PDIP1蛋白的表达和纯化(1)将pGEX-4T-2-PDIP1重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中。
(2)将转化菌液涂抹在含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基平板上，37℃培养过夜，挑单菌落于2×YT液体培养基，在37℃下震荡培养。
(3)当培养液出现浑浊时，在600nm下测定菌液光密度(OD)值，当OD值达到0.5时，加入IPTG至终浓度为1mM，在17℃下诱导培养6小时。
(4)4℃下4000g离心15分钟，收集细菌沉淀。弃上清，每500ml细菌沉淀用冰预冷的20ml PBS溶液重悬，加入1mM PMSF，在冰上30分钟，用超声波破碎细胞。
(5)加入终浓度为1％的Triton X-100，冰上摇1小时，充分溶解GST融合蛋白。
(6)4℃，18000g离心30分钟，沉淀细菌残渣和不溶解的杂质。
(7)取出上清置于50ml离心管，向其中加入1ml 50％的耦连有谷胱甘肽的Sepharose 4B珠子。
(8)室温，缓慢的上下颠倒混匀1小时，使耦连有谷胱甘肽的Sepharose 4B与GST融合蛋白充分结合。
(9)4℃，500g离心并收集沉淀。
(10)小心移走上清，10ml PBS洗沉淀，4℃，500g离心，小心弃去上清。重复洗3次。(11)加入2倍凝胶珠体积的洗脱液(125mM Tris-HCl pH8.0，25mM glutathione，100mM NaCl，0.1％Triton X-100)，洗脱5次，每次10min，离心收集洗脱的上清，即为所要提取的GST-PDIP1的融合蛋白溶液。
3小鼠PDIP1蛋白与PCNA相互作用的GST-Pulldown实验(1)按2所述的方法表达和纯化GST蛋白、GST-PDIP1融合蛋白。
(2)取2ug GST蛋白和2ug His-PCNA融合蛋白，2ug GST-PDIP1融合蛋白和2ug His-PCNA融合蛋白分别置于两个Eppendorf管中。每管加入800ul结合缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，1-0％glycerol，1mM EDTA，0.05％Nonidet P-40，5mM DTT and proteaseinhibitors)，充分混匀后于4℃上下颠倒混匀2h。
(3)加入用1×PBS活化好的50％的谷胱甘肽琼脂糖4B凝胶珠50ul，置于4℃再上下颠倒混匀2h。
(4)4℃，500g离心5min，去上清。沉淀下来的凝胶珠用结合缓冲液重悬，4℃下混匀洗涤3min，500g离心5min，去上清。再重复洗涤三次，最后用20ul的载样缓冲液重悬，100℃加热5min，随之进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(5)用电转移的方法(恒压14v，4℃电转移过夜)将蛋白质转移到尼龙膜上。
(6)将转移好的尼龙膜用含10％脱脂奶粉的TBS缓冲液作为封闭剂封闭30-60min。然后按1∶1000的比例用封闭剂稀释PCNA的单抗，让稀释的抗体与尼龙膜结合1h。随后用TBS缓冲液洗膜4次，每次10min。将与辣根过氧化物酶偶连的羊抗鼠IgG作为二抗，用封闭剂稀释2000倍，将膜浸没其中，结合1h，随后用TBS缓冲液洗膜4次，每次10min。最后用DAB/NiCl2显色。
(7)结果(图3)表明GST-PDIP1和His-PCNA混合后，用谷胱甘肽琼脂糖4B凝胶珠能将His-PCNA沉淀下来，而GST和His-PCNA混合后，用谷胱甘肽琼脂糖4B凝胶珠不能将His-PCNA沉淀下来。说明PDIP1和PCNA能相互作用。
4小鼠PDIP1蛋白与PCNA相互作用的免疫共沉淀实验(1)将小鼠的PCNA基因和PDIP1基因的编码区分别克隆到pCMV-HA和pCMV-Myc载体上，构建真核表达质粒HA-PCNA和Myc-PDIP1。
(2)质粒HA-PCNA和Myc-PDIP1共转染NIH3T3细胞。
(3)转染48小时之后，收集细胞。在4℃条件下，800g离心2分钟，弃上清。沉淀用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.2，150mM NaCl，1％Triton X-100，1％Sodium Dexycholate，0.1％SDS，1mM PMSF)重悬。细胞于-70℃快速冷冻15分钟，然后于37℃快速融解15分钟。重复三次。
(4)细胞裂解液在4℃条件下18000g离心10分钟，上清转移至一新管中，并加入抗Myc抗体(2ug)室温反应2小时。加入蛋白质-A/G偶联的Sepharose继续在室温反应2小时。在4℃条件下800g离心2分钟，弃上清珠子用裂解缓冲液重悬。重复三次，在第四次洗涤后，Sepharose用20μl的加样缓冲液重悬，100℃加热5分钟。
(5)进行SDS/PAGE电泳后，转移蛋白质于尼龙膜。用抗PCNA的抗体做Western Blot检测。
(6)同时，用抗PCNA的抗体来做免疫沉淀反应，而用抗Myc的抗体做Western blot检测。
结果见附图4，用抗Myc的抗体可以沉淀HA-PCNA，用抗PCNA的抗体也可以沉淀Myc-PDIP1，说明，PCNA和PDIP1在细胞内可以相互作用。
5、小鼠PDIP1蛋白在PCNA存在下促进DNA聚合酶δ活性。
GST蛋白和GST-PDIP1融合蛋白分别与小牛胸腺DNA聚合酶δ在4℃温度条件下保温30分钟，然后用Tan等人的方法(参见J.Biol Chem，86，2611230-12316)测定DNA聚合酶的活性。如图5所示空心柱表示在PCNA不存在下小牛胸腺DNA聚合酶δ的活性，而实心柱表示在PCNA存在下小牛胸腺DNA聚合酶δ的活性。
6TNF-α诱导小鼠PDIPl基因的表达(1)小鼠NIH3T3细胞的培养与TNF-α处理在37℃温度条件下，在5％CO2培养箱中用DMEM完全培养液(含10％新生牛血清，2mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素)培养NIH3T3细胞，至细胞密度为70％左右时往培养基中加入放线菌酮(终浓度为10μg/ml)处理30分钟，然后加入重组小鼠TNF-α(终浓度为20ng/ml)。分别在加入TNF-α后0小时、2小时、4小时、6小时、8小时，收获细胞。
(2)然后采用大连宝生物公司的Catrimox-14RNA提取试剂盒，提取经TNF-α处理不同时间的NIH3T3细胞的RNA。
(3)cDNA的合成采用德国Qiagen公司的Sensiscript反转录试剂盒，以所提取的RNA为模板，按照产品说明书反转录合成cDNA的第一条链，作为定量PCR反应扩增的模板。。
(4)定量PCR定量PCR在伯乐公司的iCycler iQ实时PCR仪上进行。小鼠PDIP1基因的定量PCR引物为正向5’-GGGACGATGAAGAGAACCGAG-3’和反向5’-GTCCTTGAAGACAATCTGTTGGC-3’。
用18S rRNA作为各个样品mRNA表达水平的内对照。18S rRNA的定量PCR引物序列如下正向5’-GCCCTGTAATTGGAATGAGTCCACTT-3’反向5’-GCTCCCAAGATCCAACTACGAGCTTT-3’。
PCR反应体系为iQ SYBR Green Supermix(伯乐公司)12.5μl，两条引物各1μl(10pg)，cDNA模板各1μl，无菌水9.5μl。反应程序为94℃预变性2分钟，然后进行40个循环(每个循环包括94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒)，最后72℃延伸5分钟。实验结果如图6所示TNF-α可以诱导小鼠PDIP1基因的表达。用TNF-α处理NIH3T3细胞，随着TNF-α处理时间延长，PDIP1基因的mRNA量增加，处理6小时的时候，PDIP1基因的mRNA量达到最大值，6小时以后，PDIP1基因的mRNA量不再增加1.本发明提供了一个小鼠新基因PDIP1基因的全长cDNA序列，并描述了其编码的蛋白产物和功能。便于以小鼠为动物模型研究PDIP1基因的功能和开发基因药物。
2.本发明的小鼠PDIP1基因编码的蛋白产物可促进DNA聚合酶δ的催化活性，从而促进DNA的复制和修复。因此，本发明的PDIP1基因可用于筛选治疗DNA的复制、修复相关疾病的药物。
3.本发明的小鼠PDIP1基因的表达可以被TNF-α所诱导，而TNF-α是一种多功能的细胞因子，参与细胞的复制、凋亡等的调控，被广泛用于肿瘤治疗、免疫性疾病的治疗。本发明的PDIP1基因可用于筛选治疗细胞凋亡相关疾病的药物。
具体实施例方式
实施例1小鼠PDIP1基因的全长cDNA的克隆(1)用人的PDIP1的cDNA序列(GenBank登陆号AF401315)去搜索GenBank的小鼠EST数据库，发现两段部分重叠的小鼠EST序列(GenBank登陆号分别为AI849007和AA546545)和人PDIP1基因cDNA高度相似，我们将这两段EST序列拼接成一段1006bp的重叠群。然后，根据AI849007的5’端序列和AA546545的3’端序列设计一段引物，用PCR扩增出一段1006bp的序列并测序。引物序列为正向5’-GTTGAAGTGCTCACAGACGC-3’反向5’-AGGTCAGTCCTTGAAGACAATC-3’。
(2)根据这段1006bp序列设计基因特异性引物(GSP)，5’端基因特异性引物5’-CTGGCACTCTCAGGCAGTGGCAC-3’3’端基因特异性引物5’-GACGATGAAGAGAACCGAGAGCACC-3’采用Clontech公司的SMART RACE试剂盒并按说明书分别扩增出这段1006bp序列的两侧序列。经测序后，拼接出长度为1674bp全长cDNA。经检索GenBank数据库发现，该序列为一新的小鼠基因，因此，我们命名为小鼠PDIP1基因(GenBank登陆号AF534881)。小鼠PDIP1的cDNA核苷酸序列和编码的氨基酸序列如图1所示。小鼠PDIP1、大鼠PDIP1和人PDIP1蛋白的氨基酸序列比较结果(见图2)表明小鼠PDIP1蛋白与大鼠和人的PDIP1蛋白的氨基酸序列高度相似。
序列表<110>湖南师范大学<120>小鼠DNA聚合酶δ相互作用蛋白基因<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1674<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>1gagagcgcgc gatggggcgg ctggtggacg tcgcggagta gctgtggaga gtgggcgtgt60gcgccgagcg gccgggcgcc ggcgctggag tcgcgggatc tcagggaacc ggaccggggc120gcagagaggg cctccgactg ccacccgcgt ccgctcactg gcatgtcggc cgaggcctcg180ggcccggcgc cggctgcggc cgaatgcttg gagtccccta gcccctcgag tgtggagcct240ggctccccct cgtacagtct gaagcccctc accccgaaca gcaagtatgt gaagctgaac300gtgggcggct cgctgcatta caccacgctg cgcaccctca cggggcagga caccatgctc360aaggccatgt tcagcggccg cgttgaagtg ctcacagacg cgggaggttg ggtgctgatt420gaccggagtg gccgccactt tggcacaatt ctcaactacc tgcgggacgg gtcggtgcca480ctgcctgaga gtgccagaga actcggggag ctgctaggtg aagcccgata ctacctggtc540cagggcctga ttgaagactg tcagctggcg ctgcagcaaa aaagggagaa gctgtcgcca600ctatgcctca tccccacagt gacatcaccc cgggaagagc agcagctcct ggccagcacc660tccaagcctg tggtgaagct tctacacaac cgcagtaaca acaagtactc ttacaccagc720acttcagatg acaacttact gaagaacatc gagctgtttg acaaactagc cctgcgcttc780catgggcggc tgctcttcct caaggatgtc ctaggagatg agatttgctg ctggtctttc840tacgggcagg gccgaaaaat tgccgaggtg tgctgtacct ccatagtcta tgctacggag900aagaagcaga ccaaggtgga attccctgag gctcggatct ttgaggagac actgaacatc960ttaatttatg agaattcccg tggcccagat ctcgctctcc tggaggccac agggggtgca 1020gctggaggtg gtggggcagg ccgaggggac gatgaagaga accgagagca ccgtgtccgg 1080aggattcacg tccgccgcca tatcacccac gatgagcgtc cccacggcca acagattgtc 1140ttcaaggact gaccttggcc ttcccccgct gtcctcttgc ttctgggacc tagtccctct 1200gtctctttgc cccggctctg ctggccaagt cgtgggtctt ccctctgtcc cctcgttgca 1260tgctgttttc agtgagccct ttccttccag tcataaccac tcactgctaa ccacatggta 1320cattccagca tttccctctg gcggcgctct tcagaaagcc agtgaccgcc cctcctctac 1380atccttgttc tgccatcttt ctcttaccat ctgattccct ttctgttttg ttaatacatt 1440gaacacacgt gtagaaagga cagtgctatc agccacactc caagctgctt tccgccattg 1500caacagagta ctttgcccct cctgccccac catccgccac ctccctaact ttgtactagg 1560ctggcctgga cctgtgccag ctctgctatc gtgatctgtt tcatattatt tattatttta 1620attttctatt aaattattgg aataaagttg agctgaaggt ctaaaaaaaa aaaa 167权利要求
1.一种小鼠DNA聚合酶δ相互作用蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如下gagagcgcgc gatggggcgg ctggtggacg tcgcggagta gctgtggaga gtgggcgtgt 60gcgccgagcg gccgggcgcc ggcgctggag tcgcgggatc tcagggaacc ggaccggggc120gcagagaggg cctccgactg ccacccgcgt ccgctcactg gcatgtcggc cgaggcctcg180ggcccggcgc cggctgcggc cgaatgcttg gagtccccta gcccctcgag tgtggagcct240ggctccccct cgtacagtct gaagcccctc accccgaaca gcaagtatgt gaagctgaac300gtgggcggct cgctgcatta caccacgctg cgcaccctca cggggcagga caccatgctc360aaggccatgt tcagcggccg cgttgaagtg ctcacagacg cgggaggttg ggtgctgatt420gacggagtg gccgccactt tggcacaatt ctcaactacc tgcgggacgg gtcggtgcca480ctgcctgaga gtgccagaga actcggggag ctgctaggtg aagcccgata ctacctggtc540cagggcctga ttgaagactg tcagctggcg ctgcagcaaa aaagggagaa gctgtcgcca600ctatgcctca tccccacagt gacatcaccc cgggaagagc agcagctcct ggccagcacc660tccaagcctg tggtgaagct tctacacaac cgcagtaaca acaagtactc ttacaccagc720acttcagatg acaacttact gaagaacatc gagctgtttg acaaactagc cctgcgcttc780catgggcggc tgctcttct caaggatgtc ctaggagatg agatttgctg ctggtctttc840tacgggcagg gccgaaaaat tgccgaggtg tgctgtacct ccatagtcta tgctacggag900aagaagcaga ccaaggtgga attccctgag gctcggatct ttgaggagac actgaacatc960ttaatttatg agaattcccg tggcccagat ctcgctctcc tggaggccac agggggtgca 1020gctggaggtg gtggggcagg ccgaggggac gatgaagaga accgagagca ccgtgtccgg 1080aggattcacg tccgccgcca tatcacccac gatgagcgtc cccacggcca acagattgtc 1140ttcaaggact gaccttggc ttcccccgct gtcctcttgc ttctgggacc tagtccctct 1200gtctctttgc cccggctctg ctggccaagt cgtgggtctt ccctctgtcc cctcgttgca 1260tgctgttttc agtgagccct ttccttccag tcataaccac tcactgctaa ccacatggta 1320cattccagca tttccctctg gcggcgctct tcagaaagcc agtgaccgcc cctcctctac 1380atccttgttc tgccatcttt ctcttaccat ctgattccct ttctgttttg ttaatacatt 1440gaacacacgt gtagaaagga cagtgctatc agccacactc caagctgctt tccgccattg 1500caacagagta ctttgcccct cctgccccac catccgccac ctccctaact ttgtactagg 1560ctggcctgga cctgtgccag ctctgctatc gtgatctgtt tcatattatt tattatttta 1620attttctatt aaattattgg aataaagttg agctgaaggt ctaaaaaaaa aaaa 167全文摘要
本发明涉及一种小鼠DNA聚合酶δ相互作用蛋白基因，小鼠PDIP1的cDNA全长1674bp，位于小鼠第7号染色体的7F3区域内，基因全长16.7kb。PDIP1蛋白能与DNA聚合酶δ和PCNA相互作用，并在PCNA存在下促进DNA聚合酶δ活性。PDIP1基因可能参与DNA复制、修复以及细胞凋亡。本发明的PDIP1基因可用于建立小鼠动物模型，筛选治疗DNA复制、修复以及细胞凋亡相关疾病的药物。
文档编号C12N15/12GK1757726SQ200510031929
公开日2006年4月12日 申请日期2005年7月28日 优先权日2005年7月28日
发明者张健, 周建林, 胡翔 申请人:湖南师范大学