专利名称：陆地棉内切－1,4－β－葡聚糖酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及陆地棉内切-1，4-β-葡聚糖酶基因的克隆，属于生物技术领域。是从陆地棉的纤维中通过基于Microarray技术得到的。RT-PCR检测因其仅在纤维各发育时期特异性表达，且该基因编码蛋白与细胞壁的形成及加厚有关，因此以该基因为靶基因对棉花进行转化，在一定程度上可有效的提高棉纤维的品质，因而具有一定的经济及社会效益。
(二)技术背景棉花作为世界性的重要经济作物，其纤维是一种优良的天然纤维，是重要的纺织工业原料。由于纺织工业发展的不断加快，要求较强、较细和纤维更整齐的棉纤维，再加上人们保健意识的增强和生活水平的提高，对棉纤维品质改良的要求愈加迫切。
近10年来，棉花育种从侧重外在品质转变为侧重内在品质。目前，国内外除了利用常规育种手段外，还逐步运用遗传工程对棉纤维品质进行遗传改良，而此项工作的展开首先依赖于对棉纤维发育相关基因及其调控元件的识别与分离。
棉纤维发育过程有几千个基因表达，其相关基因的分离鉴定以及调控研究起步较晚，但进展很快。美国和澳大利亚的一些研究小组利用大规模测序获得了棉花大量的表达序列标签(EST)。目前，在GenBank中注册的EST片段已有221,498条，其中陆地棉共29,344条。这些基因片段为棉花基因表达谱的建立、基因克隆以及棉纤维发育生物信息数据库的建立打下了基础。从目前国内外的研究进展来看，已克隆的棉纤维发育相关基因仅有20余个，且多数是在纤维伸长阶段的纤维细胞中特异表达，利用分子生物学方法改良棉纤维的潜力还远没有发挥。
本专利所克隆的基因内切-1，4-β-葡聚糖酶(EGases，EC 3.2.1.4)作为纤维素酶系中三大纤维酶中的一种，是一类普遍存在于原核生物和真核生物体内的水解酶，它可以催化水解具有1，4-β-葡聚糖主链的多糖类物质。研究表明高等植物中的EGase是由一个多基因家族所编码的。拟南芥体内发现至少有12个不同的EGase家族蛋白，番茄中也发现了6个EGase蛋白，并且大多数是在不同的时间和组织器官中特异表达，这表明EGases对植物体的生长发育可能具有广泛的作用，如一些EGases在果实成熟或叶片脱落过程中特异表达，而另外一些EGases在正在伸展的细胞中高量表达表明它们可以在初生细胞壁中的多糖物质的聚集或重排等过程中发挥作用。对于EGases在植物细胞伸展过程中的作用在过去的20多年中一直受到不少研究者的关注，虽然有大量相关的研究报道，但这个问题仍存在争论。对于其在棉纤维发育过程中的作用可归纳为以下三个作为植物细胞结果材料的纤维素需在纤维素酶系中三大纤维素酶的协同作用下才能完全降解为葡萄糖，而葡萄糖作为正在伸长的棉纤维中产生渗透压的主要物质，与K+、苹果酸盐一起，共同产生了80％的纤维渗透压，从而促进棉纤维细胞的伸展发育。
棉纤维细胞的延伸还需松弛初生壁的纤维素微纤丝网络及其与基质非纤维素多糖网络之间的交联。据研究，1，4-β-内葡聚糖酶，膨胀素，内木葡聚糖转移酶参与了此过程。1，4-β-内葡聚糖酶通过松弛或剪切棉纤维细胞中的结合物从而使纤维细胞得以膨胀(Fry，1995)。此基因的转录在纤维伸长期保持高水平，其表达水平随着纤维伸长速率减慢而降低。
在一定合成途径，内切葡聚糖酶可催化产生木糖寡糖，参与细胞壁的扩张，促进细胞伸长。
植物EGases的潜在功能是修饰自身细胞的细胞壁成分，因此它们必须被分泌到细胞表面才能发挥其功能，事实上迄今已克隆出的植物EGases分子中几乎都具有典型的真核生物信号肽序列，使它们可以在细胞的内膜系统中加工修饰并最终被分泌到胞外空间。
发明内容技术问题 本发明的目的是克隆一个陆地棉纤维素酶基因(Gh EGases)cDNA的全长序列，以此设计出一对Gh EGases的特异性引物检测其在陆地棉高品质纤维种质系7235中的时空表达情况；以此基因为靶基因，通过基因工程的方法改变目前棉纤维的品质特性，获得一定的经济及社会效益。为棉花的品质育种提供基因资源，尽快提高我国棉花品种的纤维品质，并应用于高强纤维棉花品种的生产与品质检测。
技术方案陆地棉内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(Gh EGases)，长度为2036bp，序列为SEQID NO.1，如下GAAGGCACAGGATTTCTGGGATTTTTCTGCAAATTGGAAGAAAGATAAAG
GCTATGTCATGTTGGGGATCCAAAACTTTTTTTTTTGTTTATAAAAGAATGAAAGAAAGAGATGTGATTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA注阴影部分为推测的最大开放读码框(ORF)；下划线为潜在加尾信号。
Gh EGases的特异性引物为F5’-TCCATACAACTATTCCT-3’R5’-TTCTCCTCATACACAAC-3’本发明克隆内切-1，4-β-葡聚糖酶基因的技术路线是1.按照CLONTECH cDNA文库构建方法(CLONTECH CreatorTMSmartTMcDNAlibraies User Manual)，构建了陆地棉优质材料7235开花后1，3，5，7，11，14，17，20，23，25等不同纤维发育时期的混合cDNA文库。陆地棉优质材料7235引自江苏省农科院经济作物研究所，该种质目前已向相关研究单位免费发放。
2.随机挑取6000余个克隆进行5’端测序分析。进一步将所测序列进行聚类分析，并使用BLASTN非冗余数据库进行数据同源性比较，获1056个非冗余contig和它们的初步功能。
3.按初步分类结果，从文库中挑取一类编码与细胞壁合成有关的酶类的克隆，转化，测出全序列。根据测序结果，进一步进行BLAST比对，认知其可能的功能，并对其最大开放读码框进行全长的基因判定。
4.这一类基因中发现并确认一个编码内切-1，4-β-葡聚糖酶的基因为全长序列，根据该序列设计一对特异引物，RT-PCR检测该基因仅在纤维各发育时期渐增表达(图1)。并做了生物信息学的初步分析。
有益效果本发明的优点表现在(1)目前常见的几种用于全长cDNA基因克隆技术有文库筛选法(LibraryScreening)、cDNA末端快速扩增(RACE)和电子克隆(in silico cloning)等。而本发明所采用的是基于微阵列分析技术，因其具有高通量，后续操作方便等优点，而非常适合于大规模获取相关基因。
(2)本发明所克隆的基因编码内切-1，4-β-葡聚糖酶，从现有的资料可知，内切-1，4-β-葡聚糖酶类基因是一类基因家族，它们中的大部分与细胞壁的合成及加厚有关，而细胞壁的厚度与纤维强度又有着密切的关系。因此本发明所克隆的基因与棉纤维的强度有着直接的联系。
(3)以此基因作为靶基因，对棉花进行转化理论上可直接有效地提高其强度，打破产量品质的负相关，获得优质棉花，带来可观的经济社会效益。
(4)目前转基因的外源基因大部分来源于微生物，这类转基因作物对安全性评价要求严格。本专利报道的基因来源于棉花，再导入棉花不存在安全性评价问题。同时，与棉纤维发育相关的基因目前国内外申请的专利很少，本专利是目前具有中国自主知识产权的为数不多的专利之一。该专利的申请可提高中国棉花科研水平在国际同行中的地位。
(5)通过该基因的功能预测，表明该基因是一个棉纤维发育过程中特异表达的基因，通过农杆菌介导的方法将该基因导入棉花，使其过量表达，获得的转基因植株将在棉纤维伸长或和加厚期大量表达，有望达到大大提高棉纤维品质的目的。
图1RT-PCR检测内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(Gh EGases)在棉花不同组织表达特点，从左至右依次为根(R)、下胚轴(H)、叶(L)、开花后1、3、5、8、11、14、17、20、23天棉纤维。M示标准分子量。图1A示棉花的组蛋白Histon3内标，证明RNA模板的一致性。图1B示内切-1，4-β-葡聚糖酶基因在棉花根、下胚轴、叶中不表达，在不同棉纤维发育期特异表达。
图2内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(Gh EGases)的SignalP信号肽分析。表明N-端有一个长度为23个氨基酸残基的信号肽。
图3内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(Gh EGases)与其它物种来源的多个同源基因的同源关系树和种系发生树分析。说明Gh EGases与陆地棉β-葡糖苷酶基因(Ghbglx)亲缘关系较远。
具体实施方式
1.按照CLONTECH cDNA文库构建方法(CLONTECH公司文库构建试剂盒CreatorTMSmartTMcDNA libraies User Manual)，构建了陆地棉优质材料7235开花后1，3，5，7，11，14，17，20，23，25天等不同纤维发育时期的混合cDNA文库。陆地棉优质材料7235引自江苏省农科院经济作物研究所，该种质目前已向相关研究单位免费发放。
2.随机挑取6000余个克隆进行5’端测序，进一步将所测序列利用DNASTAR软件中的ALIGNMENT程序进行聚类分析，并使用BLASTN非冗余数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行数据同源性比较，获1056个不重复的克隆并在NCBI网站进行核酸序列比较获得它们的初步功能。
3.按照初步功能将上述克隆进行分类，从中挑取功能为与细胞壁合成有关的克隆，利用大肠杆菌E.coli为受体，分别进行转化，转化菌株分别进行插入片段的全序列测定。根据测序结果，进一步进行BLAST功能比对，明确其可能的功能，并对其最大开放读码框(ORF)进行全长的基因判定。在该ORF上游有5‘非翻译区的序列，在ORF下游3’非翻译区有cDNA的多聚腺嘌呤尾巴。
找到一个全长cDNA序列，BLAST功能比对其功能为编码内切-1，4-β-葡聚糖酶，该全长cDNA序列被定名为Gh EGases。根据该序列设计一对特异引物F5’-TCCATACAACTATTCCT-3’R5’-TTCTCCTCATACACAAC-3’进行RT-PCR检测，结果表明该基因仅在纤维各发育时期渐增表达(图1、2)，由此确定该基因是一个棉纤维发育特异表达基因。
4.对该基因Gh EGases的生物信息学初步分析4.1以此基因的最大ORF推断的氨基酸序列经BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)功能比较，该基因与已报道陆地棉葡萄糖苷酶(Ghglx)基因具最高的相似性(75％)。
4.2用Expasy pI/Mw程序(http//us.expasy.org/tools/pi_tool.html)对Gh EGases的氨基酸序列进行了一级结构的预测，该基因Gh EGases理论上的等电点pI＝8.17，分子量Mw＝68781.01Da。
4.3信号肽SignalP程序(http//genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)对由Gh EGases所推导的氨基酸序列进行分析，发现在该氨基酸序列的N-端有一个长度为23个氨基酸残基的信号肽，由此确定Gh EGases基因编码的产物是一个蛋白前体，它在被合成之后将通过分泌途径运输到其作用部位或被分泌到细胞外(图2)。
4.4蛋白功能区分析程序(BPROMPT)(http//www.jenner.ac.uk/bprompt/)分析其跨膜区位于8～17为氨基酸处。
用MotifScan程序(http//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)分析该氨基酸序列位点特征的结果显示，Gh EGases氨基酸序列的第102～339位与第411～623位分别为糖基水解家族3的N端与C端功能域。
4.5同源关系树分析(DNAMAN软件)，Gh EGases与陆地棉β-葡糖苷酶基因(Ghbglx)亲缘关系较远(图3)。
5.通过该基因的功能预测，表明该基因是一个棉纤维发育过程中特异表达的基因，通过农杆菌介导的方法将该基因导入棉花，使其过量表达，获得的转基因植株将在棉纤维伸长或和加厚期大量表达，有望达到大大提高棉纤维品质的目的。
SEQUENCE LISTING序列表<110>南京农业大学<120>陆地棉内切-1，4-β-葡聚糖酶基因<130>00<140>00<141>2005-05-26<150>00<151>2005-05-26<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2036<212>DNA<213>Gossypium hirsutum(陆地棉)<220>
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1.陆地棉内切-1，4-β-葡聚糖酶基因，长度为2036bp，序列为SEQ ID NO.1，如下GAAGGCACAGGATTTCTGGGATTTTTCTGCAAATTGGAAGAAAGATAAAG GCTATGTCATGTTGGGGATCCAAAACTTTTTTTTTTGTTTATAAAAGAATGAAAGAAAGAGATGTGATTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA注阴影部分为推测的最大开放读码框；下划线为潜在加尾信号。
2.根据权利要求1所述的陆地棉内切-1，4-β-葡聚糖酶基因，其特异性引物为F5’-TCCATACAACTATTCCT-3’R5’-TTCTCCTCATACACAAC-3’。
3.权利要求1或2所述陆地棉内切-1，4-β-葡聚糖酶基因为靶基因的应用。
全文摘要
本发明涉及陆地棉内切－1，4－β－葡聚糖酶基因的克隆，属于生物技术领域。克隆一个陆地棉纤维素酶基因(Gh EGases)cDNA的全长序列，以此设计出一对GhEGases的特异性引物检测其在陆地棉高品质纤维种质系7235中的时空表达情况；以此基因为靶基因，通过基因工程的方法改变目前棉纤维的品质特性，RT－PCR检测因其仅在纤维各发育时期特异性表达，且该基因编码蛋白与细胞壁的形成及加厚有关，为棉花的品质育种提供基因资源，尽快提高我国棉花品种的纤维品质，并应用于高强纤维棉花品种的生产与品质检测。
文档编号C12N15/56GK1699575SQ20051004023
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月26日 优先权日2005年5月26日
发明者张天真, 马国佳, 郭旺珍 申请人:南京农业大学