专利名称：水稻稻瘟菌dna指纹图谱带型编码程式分类分析方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻病菌变异性的研究分析方法，尤其是一种水稻病菌变异性的遗传性状研究分析方法，属于农业科学技术领域。
背景技术：
稻瘟病以及白叶枯病、纹枯病在我国南北稻区都有严重危害，为我国水稻的三大病害。其中稻瘟病菌(Magnapor the grisea)引起的稻瘟病是流行最广、危害最大的世界性水稻病害。培育和利用抗病品种是目前最有效和最实用的防治方法。然而，由于稻瘟病菌的致病性分化严重，生理小种繁多、致病性变化较大，容易发生变异，往往一个高抗品种不到3～5年便成为高度的感病品种，给抗病品种的选育和推广带来了极大的困难。
为了掌握水稻病菌的变异规律，从而便于对症下药，采取行之有效的相应措施，长期以来一直采取对病菌致病性研究的方法，了解病菌的变异情况。这种方法通常需要经过以下主要步骤1、采样——采集病株；2、分离——将病菌从病株上分离出来；3、培养——培养病菌；4、接种——将病菌接种到实验株上；5、症状分析——通过比较接种病株的症状，分析变异情况。
由于以上过程需要一定周期，受季节影响，至少需要一年以上的时间，因此无法做到对变异的快速监测和及时分析。
随着生物工程技术的迅速发展，上世纪九十年代，人们开始从遗传学角度对稻瘟病菌的变异进行研究，并取得一定成绩。尤其是通过rep-PCR指纹图谱分析技术，逐渐摸索出一些稻瘟病菌的变异系谱(Hamer1991，1993；Levy1993；沈瑛1996；George1998)。但是，由于不同研究者对自己所报道的稻瘟菌系谱并未公开相应的获取方法，也没有按统一的带型标准去命名系谱，加之所采用的软件和计算公式互不相同，因此与异地其他研究者报道的相应研究结果很难直接进行比较。
发明内容
本发明的目的在于针对以上现有技术存在的问题，提出一种可以对稻瘟病菌生理小种致病性分化快速监测、并便于异地研究结果相互比对的水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法，从而使有关研究成果标准化，有利于实现资源共享。
为了达到以上目的，本发明的水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法包括以下基本步骤1、采样——采集病株，分离单孢菌株；2、基因组DNA提取2、1提取菌丝——单孢菌株在产孢培养基上培养产孢后，洗取孢子至液体培养基中培养，再冻干或在干燥器中抽干菌丝；2、2提取DNA——将菌丝研磨成粉，先后加入提取液、SDS、NaCl、CTA、氯仿∶异戊醇，异丙醇，每次加入均需充分混匀，低温沉淀DNA；3、rep-PCR扩增——加入前后引物，使两端核苷酸序列进行反向扩增；4、电泳形成指纹图谱——将以上PCR产物放入琼脂糖凝胶电泳，形成指纹图谱；5、根据指纹图谱得出编码程式
5、1确定主带——将出现频率较高的扩增带定义为主带，并以此为参照带确定其它条带的位置；5、2主带编码——以大写字母顺序按分子量由小到大排列主带的代号，所缺主带分别用小写字母表示；5、3形成主带程式——程式的第一部分表示主带数目；5、4形成副带程式——程式的第二部分为主带之间的扩增带，即副带，用小写字母表示，以相邻两主带之间距离中线划分，比中线分子量小的带编码为前一分子量主带的符号，符号前面加上负号；比中线分子量大的带编码为后一分子量主带的符号，前面加上正号；5、5形成编码程式——将主带程式与副带程式合并。
可以理解，本发明的上述方法不仅可以借助分子遗传学技术实现对水稻病菌变异的快速监测，并且由于提出了切实可行的相应编码程式，因此易于解读，便于异地研究结果相互比对，使有关研究成果得以标准化，既可以相互参照，又可以避免重复研究。
由此可见，本发明以清晰完整的思路，解决了本领域的一大技术难题，与现有技术相比，取得了显著的实质性进步。
具体实施例方式
实施例一本实施例的水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法具体针对江苏和中国北方粳稻种植区的稻瘟病菌进行，其详细过程如下1、采样rep-PCR带型、系谱研究供试材料来自于穗瘟样品，分别采自江苏省五大稻区的穗期水稻。样品经单孢分离后用于基因组DNA提取。样品菌株经培养产孢低温干燥保存在稻秸和滤纸碟上。rep-PCR带型分析的样品总数为296个。
2、稻瘟病菌基因组DNA提取2、1提取菌丝用CTAB/NaCl微量法置备稻瘟菌基因组DNA，方法为单孢菌株在产孢培养基上培养产孢后，洗取孢子至25ml液体培养基(PDA液体培养基)中，27～30℃振荡培养3天左右。冻干或在干燥器中抽干菌丝。
2、2提取DNA取出大约25mg的菌丝放入Ependorf管中研磨成粉末。加入500μl提取液(Extraction buffer100mmol/L tris-HCl pH8.0；100mmol/LEDTA，150mmol/L NaCl)震荡混匀；再加入50μl 10％SDS轻轻混匀，在37℃下震荡孵育1小时(80rpm)；加入75μl 5mol/L NaCl，轻轻地充分混匀，再加入65μl 10％CTAB，65℃水浴20分钟；加入700μl 24∶1氯仿∶异戊醇后，摇床上5分钟摇匀，离心10,000g/12min。水相加入0.6倍体积的异丙醇。轻轻充分混匀，置-20℃下1小时以上沉淀DNA；离心10,000g/12min，去上清液，用70％和95％酒精洗沉淀各一次，干燥后悬浮在50μl的1×TE缓冲液中，置-20℃下保存备用。
3、rep-PCR扩增在稻瘟菌中克隆的中等重复序列的两端核苷酸序列进行反向扩增，使其PCR扩增产物为该中等重复序列之间的DNA片段。进行PCR扩增的前引物Pot2-1序列为5′CGGAAGCCCTAA AGCTGTTT3′，后引物Pot2-2序列为5′CCCTCATTCGTCACACGTTC3′。由Takara大连宝森生物技术公司合成。25μl rep-PCR反应体系为15ng模板DNA、2.5μl10Buffer(Takara)、2mmol/ml MgCl2、2.5μl DNTP(2.5mM each)、引物各1.25μl、0.7u Taq酶。
PCR扩增循环为95℃/2.5min预变性；变性94℃/1min，退火62℃/1min，延伸65℃/10min四次循环；再94℃/30sec，62℃/1min，65℃/10min 26次循环；65℃/15min后结束扩增，4℃保存待测。
4、电泳形成指纹图谱电泳缓冲液均为×0.5TBE。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA的浓度，Marker为λDNA(GibcoBRL产品)。PCR产物的检测用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。指纹图谱分析用0.5％琼脂糖凝胶和0.75％Synergel配成半长胶电泳(胶长12cm)或长胶(胶长24cm)，电泳时间分别为3-4h和7～9h，电压为120v，Marker用1kb+(GibcoBRL产品)。EB染色后用Bio-Rad凝胶成像系统记录结果并进行数据处理。以Quentity One ver 4.1(Bio-rad产品)软件按UPGRAM(unweightedpair-group method with arithmetic averages)完成相似性聚类分析。
所有样品处理及所有数据均有3次以上的重复。
5、根据指纹图谱得出编码程式5、1确定主带根据296个样品指纹图谱的分析，将出现频率较高的6条带定义为主带(它们在所测菌株中出现的频率按分子量由小到大分别为92.59％、76.77％、93.27％、61.62％、100％、95.96％；在代表性49个带型中扩增带分布频率见图2)，以此为参照带确定其它条带的位置。
5、2主带编码按分子量由小到大排列主带的代号分别为A(MW＝640bp)、B(1,260)、C(1,720)、D(1,920)、E(2,780)和F(4,020)(
图1箭头所示及图2所示)，所缺主带分别用小写字母a、b、c、d、e、f表示。
5、3形成主带程式程式第一部分表示主带数目，如4、5、6分别代表主带数目为4、5、6条；主带不完全的带型，在现存主带数字后分别用小写字母a、b、c、d、e、f标出所缺主带；如所缺主带超过3条，可直接用大写字母表示现存主带编码；如4ac+b-b1-1d-nf中4ac则表示在主带中有B、D、E、F带，缺A、C带；ABE+c+d-d+e1-e+2f-nf中ABE则表示有A、B、E三条主带存在，其它带缺。
5、4形成副带程式程式的第二部分为主带之间的扩增带可看成副带，一律用小写字母表示，以相邻两主带之间距离中线划分，比中线分子量小的带编码为前一分子量主带的符号，符号前面加上负号(-)；比中线分子量大的带编码为后一分子量主带的符号，前面加上正号(+)。如4ac+b-b1-1d-nf中+b-b为主带B前有一副带，主带B后也有一副带。
在同一区域内如存在不止一条副带，可在副带的符号前加上阿拉伯数字表示的副带数量，如有一副带紧靠着主带，在副带符号后面加写数字1。4ad+b+2c-3d1+f表示在B带的前方有一副带、C带前方有2条副带、D带后方有3条副带，其中一副带紧靠D带，F带前方还有一条副带。
具有完全相同带型编码程式或仅在其中一条带的位置上有很小差异，使用同一带型编号，编号后加小写a、b。如29a、29b有完全相同的带型编码程式，但-b带与B带的位置距离不同。
有F带或分子量比F带大的副带被认为该样品PCR扩增有效，否则被认为有可能为模板DNA降介，大分子量条带没有扩增出来。须重新提取DNA进行PCR扩增，3次以上未见F带或大于F带的副带出现，可确定该样品无此扩增带，该样品被认为扩增有效。分子量大于F带的条带可能出现不太稳定的结果，因此，带型确定主要依据分子量小于F带的扩增带的位置。
具有完全相同带型编码程式或仅在其中一条带的位置上有很小差异，使用同一带型编号，编号后加小写a、b。如29a、29b有完全相同的带型编码程式，但-b带与B带的位置距离不同。
5、5形成编码程式根据以上带型编码程式规则，将江苏稻瘟菌样品rep-PCR指纹图谱分的49个带型的编码程式列于表1。
表1.江苏稻瘟菌rep-PCR指纹图谱带型的编码程式
本实施例不仅借助本发明的方法，对江苏范围内稻瘟病菌成功进行了rep-PCR指纹图谱的带型分析，而且形成了便于直读和交流的指纹图谱带型编码程式，开国内外稻瘟菌研究方面的先河，是该菌遗传多样性方面研究的一个新尝试，将为全国以及国际上稻瘟菌指纹图谱的带型编码程式研究提供借鉴。
实施例二本实施例的水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法具体针对中国南方稻区稻瘟病菌进行，其详细过程如下1、采样——采集浙江、北方参试菌株105个，进行菌株的分离和培养。
1、1单孢分离在采集的标样中选取症状典型的穗颈2-3枝，用清水把表面冲洗干净，在小试管内浸泡6-8小时至标样完全湿润，26℃保湿24小时左右(一般以病斑产孢为准)，把标样放在改造过的显微镜的玻片上，在显微镜下观察产孢情况，用固定在载物台上的针挑取单孢，在PDA培养基(马铃薯、蔗糖)斜面上培养。
1、2培养挑取的单孢在斜面上(26℃)生长7-10天后，用挑针把菌丝和孢子轻轻刮下，移入液体培养基(马铃薯、蔗糖)内震荡培养3-4天(一般以白色菌丝球充满液体培养基，但颜色未变深为准)。
2、基因组DNA提取2、1提取菌丝——单孢菌株在产孢培养基上培养产孢后，洗取孢子至液体培养基中培养，再制成菌丝粉；2、2提取DNA——取大约25mg菌丝粉放在1.5μl Eppendourf管中，加入500μl提取缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝8.0；100mM EDTA；150mM NaCl)震荡混匀；加入50μl 10％SDS(十二烷基苯磺酸钠)轻轻混匀，恒温摇床上80rpm、37℃混合震荡1hr；加入75μl 5M NaCl轻轻地充分混匀，再加10％ CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)65μl，65℃水浴20min；加入700μl(24∶1)氯仿∶异戊醇，摇床上5min、80rpm摇匀，12000rpm低温离心12min；将水相转移至一新的Eppendourf管中，加入0.6×(约400μl)异丙醇，轻轻充分混匀，-20℃ 1hr以上沉淀DNA；12000rpm低温离心12min，去上清液，分别用75％和95％的乙醇洗沉淀一次，充分干燥；加入50μl 1×TE缓冲液，65℃ 5min溶解；0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，稀释至终浓度25ng/μl，冰箱内保存备用。
3、rep-PCR扩增——Pot2-rep-PCR扩增的前引物Pot2-1序列为5’-CGGAAGCCCTAAAGCTGTTT-3’，后引物Pot2-2序列为5’-CCCTCATTCGTCACACGTTC-3’。由Takara宝(大连)生物技术公司合成。25μl rep-PCR反应体系中含1.5ng模板DNA、2.5μl 10×taqBuffer(Takara)、2mM MgCl2、2.5μl dNTP(2.5mM each)、引物各1.25μl、0.7u Taq酶(Takara ex TaqTM)。PCR扩增循环为95℃(2.5min)预变性；94℃(1min)变性，62℃(1min)退火，延伸65℃(10min)4次循环；94℃(30s)，62℃(1min)，65℃(10min)26次循环；65℃(15min)，4℃保存待用。
4、电泳形成指纹图谱——Rep-PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选扩增好的样品进行Synergel凝胶电泳(0.5％Agarose+0.75％Synergel)，0.5×TBE，120V，8.5hr。用Bio-rad凝胶成像系统照相。
5、按与实施例一相同的步骤、根据指纹图谱得出编码程式。不另赘述。
对福建、安徽、广东、广西、四川、重庆、云南、湖北、江西9个稻区98个代表稻瘟菌株指纹图谱中的条带出现频率统计发现，9个稻区中分子量分别为1,260bp、1,820bp、2,300bp、2,780bp、2,900bp、3,200bp、5,000bp的7条条带出现的频率分别为90.32％、19.36％、44.09％、90.32％、67.74％、74.19％、36.56％。把这些条带定义为这些稻区稻瘟菌株指纹图谱中的主带，依此为参考带决定其他带的相对位置，参照江苏稻区稻瘟病菌指纹图谱编码程式规则并做相应的修改。为方便使用，作者把该编码程式描述为编码程式II(CII)，相对应的江浙、北方稻区编码程式描述为编码程式I(CI)。
a)7条主带按分子量大小排列分别是A(1,260bp)、B(1,820bp)、C(2,300bp)、D(2,780bp)、E(2,900bp)、F(3,200bp)、G(5,000bp)，这些条带在该稻区稻瘟菌株指纹图谱中的分布如图，所缺主带分别用小写字母a、b、c、d、e、f、g表示。
b)程式的第一部分表示主带数目，如4、5、7分别代表主带数目为4、5、7条；主带不完全的带型，在现存主带数目后边分别用小写字母a、b、c、d、e、f、g标出所缺主带；如所缺主带超过4条，可直接用大写字母表示现有主带编码；如5bg+e中5表示该带型中有5条主带，bg表示在主带中缺少B、G带；CFG-a+g中CFG则表示有C、F、G 3条主带存在，缺其他4条主带。
c)程式的第二部分为主带之间的扩增带可看成副带，一律用小写字母表示，以相临两主带之间距离中线划分，比中线分子量小的带用前面主带的符号编码，符号前加一负号(-)；比中线分子量大的带用后面主带的符号编码，符号前加一正号(+)。图，如7-a-f±g中表示在主带A后边有一副带，主带F后有一副带，主带G前、后各有一副带。
d)在同一区域内若存在2条及以上副带，可以在副带符号前加上数字表示数量，若有副带紧靠主带，则在副带符号后加1表示，如6b+2b-f±g则表示在主带B前面有2条副带。
e)分析的数据均经过3次重复，有些菌株没有大分子量的条带认为不是操作问题，并且分子量大的条带出现不太稳定，所以带型编码以分子量小于G带的条带为主。
f)有些菌株具有完全相同的编码程式，但是副带的位置不同，所以仍把它们放在表中，表明它们的DNA指纹图谱是有差异的。
根据以上编码程式规则，将南方9省稻区稻瘟菌株指纹图谱编码程式列于表1.5结果见表2。
表2.南方9省稻区菌株rep-PCR指纹图谱带型编码程式Table 1.5.Haplotypic formula of rep-PCR fingerprint patterns for M.grisea from rice inother areas in South China
通过以上实施例，可以看出，采用本发明的方法不仅可以对稻瘟病菌生理小种致病性分化快速监测，而且可以很方便地对异地研究结果进行相互比对，从而使有关研究成果标准化，有利于实现资源共享。
权利要求
1.一种水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法，其特征在于包括以下基本步骤1)、采样——采集病株，分离单孢菌株；2)、基因组DNA提取2、1)提取菌丝——单孢菌株在产孢培养基上培养产孢后，洗取孢子至液体培养基中培养，再冻干或在干燥器中抽干菌丝；2、2)提取DNA——将菌丝研磨成粉，先后加入提取液、SDS、NaCl、CTA、氯仿:异戊醇，异丙醇，每次加入均需充分混匀，低温沉淀DNA；3)、rep-PCR扩增——加入前后引物，使两端核苷酸序列进行反向扩增；4)、电泳形成指纹图谱——将以上PCR产物放入琼脂糖凝胶电泳，形成指纹图谱；5)、根据指纹图谱得出编码程式5、1)确定主带——将出现频率较高的扩增带定义为主带，并以此为参照带确定其它条带的位置；5、2)主带编码——以大写字母顺序按分子量由小到大排列主带的代号，所缺主带分别用小写字母表示；5、3)形成主带程式——程式的第一部分表示主带数目；5、4)形成副带程式——程式的第二部分为主带之间的扩增带，即副带，用小写字母表示，以相邻两主带之间距离中线划分，比中线分子量小的带编码为前一分子量主带的符号，符号前面加上负号；比中线分子量大的带编码为后一分子量主带的符号，前面加上正号；5、5)形成编码程式——将主带程式与副带程式合并。
2.根据权利要求1所述形水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法，其特征在于所述电泳形成指纹图谱步骤中——电泳缓冲液均为×0.5TBE；——用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测经采样后提取的基因组DNA的浓度，Marker为λDNA(GibcoBRL产品)；——PCR产物的检测用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；——指纹图谱分析用0.5％琼脂糖凝胶和0.75％Synergel配成半长胶电泳(胶长12cm)或长胶(胶长24cm)，电泳时间分别为3～4h和7～9h，电压为120v，Marker用1kb+(GibcoBRL产品)；——EB染色后用Bio-Rad凝胶成像系统记录结果并进行数据处理；样品处理及数据至少作3次以上的重复。
3.根据权利要求1所述形水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法，其特征在于所述电泳形成指纹图谱中——将经采样后提取的DNA基因组所得的Rep-PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；——筛选扩增好的样品进行Synergel凝胶电泳(0.5％Agarose+0.75％Synergel)，0.5×TBE，120V，8.5hr；——用Bio-rad凝胶成像系统照相。
4.根据权利要求2或3所述形水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法，其特征在于所述根据指纹图谱得出编码程式步骤中确定主带——根据样品指纹图谱的分析，将出现频率较高的6条带定义为主带以此确定其它条带的位置；主带编码——按分子量由小到大排列主带的代号分别为A(MW＝640bp)、B(1,260)、C(1,720)、D(1,920)、E(2,780)和F(4,020)，所缺主带分别用小写字母a、b、c、d、e、f表示；形成主带程式——程式第一部分表示主带数目，主带不完全的带型，在现存主带数字后分别用小写字母a、b、c、d、e、f标出所缺主带；形成副带程式——程式的第二部分为主带之间的扩增带可看成副带，一律用小写字母表示，以相邻两主带之间距离中线划分，比中线分子量小的带编码为前一分子量主带的符号，符号前面加上负号(-)；比中线分子量大的带编码为后一分子量主带的符号，前面加上正号(+)；形成编码程式——将所述主带程式与副带程式合并。
5.根据权利要求4所述形水稻病菌DNA指纹图谱带型编码程式分类分析方法，其特征在于所述形成副带程式步骤中——在同一区域内如存在不止一条副带，可在副带的符号前加上阿拉伯数字表示的副带数量；——具有完全相同带型编码程式或仅在其中一条带的位置上有很小差异，使用同一带型编号，编号后加小写a、b；——有F带或分子量比F带大的副带被认为该样品PCR扩增有效，否则被认为有可能为模板DNA降介，大分子量条带没有扩增出来；须重新提取DNA进行PCR扩增，3次以上未见F带或大于F带的副带出现，可确定该样品无此扩增带，该样品被认为扩增有效；——具有完全相同带型编码程式或仅在其中一条带的位置上有很小差异，使用同一带型编号，编号后加小写a、b。
全文摘要
本发明涉及一种水稻病菌变异性的研究分析方法，属于农业科学技术领域。本发明的方法通过采集病株，分离单孢菌株，基因组DNA提取，rep－PCR扩增，电泳形成指纹图谱，根据指纹图谱得出编码程式，不仅可以借助分子遗传学技术实现对水稻病菌变异的快速监测，并且由于提出了切实可行的相应编码程式，因此易于解读，便于异地研究结果相互比对，使有关研究成果得以标准化，从而解决了本领域的一大技术难题，与现有技术相比，取得了显著的实质性进步。
文档编号C12N15/00GK1699564SQ20051004023
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月26日 优先权日2005年5月26日
发明者周益军, 程榜, 范永坚, 白娟 申请人:江苏省农业科学院