专利名称：一种利用基因工程技术培育抗褐化甘薯的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、酶学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种利用基因工程技术培育抗褐化甘薯的方法，具体涉及甘薯多酚氧化酶基因cDNA及其反义链序列，以及利用构建的高效表达载体和工程菌株在植物中表达该基因和反义基因、筛选转化子的具体程序。本发明还提供利用基因工程获得的转多酚氧化酶及反义多酚氧化酶的细胞和毛状根及其培养的子代、再生植株、植物组织或种子。
背景技术：
多酚氧化酶是一类广泛分布于植物体内，能催化单元酚、二元酚、多元酚到联苯酚的羟基化及羟基酚到醌的脱氢反应，它特殊的催化功能是引起植物褐变、降低品质的根本原因。它与甘薯生产加工和运输密切相关。甘薯兼有粮食作物和经济作物的特点，甘薯块根中淀粉含量高，其淀粉可作为粉丝、变性淀粉、淀粉糖和柠檬酸等产品的工业原料。但目前我国甘薯的利用仍以供人食用或做家畜饲料为主，甘薯的深加工受到限制，其中关键的一个问题就是甘薯淀粉与玉米淀粉、马铃薯淀粉相比，甘薯淀粉的品质差，白度低。主要原因是甘薯中少量的果胶、单宁、多酚类物质在甘薯破碎后，受多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)的作用形成黑色素，吸附在淀粉颗粒上，这是造成甘薯淀粉白度低的主要原因；同时多酚氧化酶的氧化产物还会产生不良的风味，降低甘薯淀粉产品品质。
为了防止甘薯的褐化，生产上运用多种常规方法来降低甘薯中多酚氧化酶活性和含量，例如，以抗坏血酸、硫酸钠、柠檬酸等为主剂的复合护色剂，用沸水烫，套袋等，但这些都不能从根本上解决问题。
相比之下，利用基因工程技术改良甘薯，培育抗褐化的甘薯就具有很大的优势(1)在生物技术研究领域中，研究人员对甘薯离体培养长期广泛而深入的研究和甘薯遗传转化的屡屡成功，为利用生物技术培育抗褐化的转基因甘薯奠定了良好的理论和实践基础；(2)由于目前基本阐明了甘薯的褐变机理，克隆了多个物种多酚氧化酶基因，利用反义RNA技术已经获得了抗褐化的转基因马铃薯，故利用基因工程技术在基因水平上快速、高效地改良甘薯，获得遗传修饰转基因甘薯(包括幼苗、细胞系等)和其他生命体成为可能，因而利用反义RNA技术是培育抗褐化转基因甘薯的最佳途径。
目前，尚未有任何与本专利申请中所提及的应用基因工程技术培育抗褐化的转基因甘薯的相关报道，包括专利和文献。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种利用基因工程技术培育抗褐化甘薯的方法，该方法将多种转移反义多酚氧化酶基因核心片断到甘薯中。
在本发明的另一方面，还提供了一种反义表达载体，它包含上述多酚氧化酶基因核心片断。
在本发明的另一方面，还提供了一种用上述反义表达载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是甘薯。
本发明的技术方案如下本发明分离出的DNA分子具有编码甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列的核心片段。该核心片段来源于由申请人在GenBank中登录的甘薯多酚氧化酶基因(AY822711)的核苷酸序列，用引物P15’-cgagctctatgttcagaccgattacccc-3’和P25’-cggatccatggtccacattcggtcgac-3’可以从甘薯中扩增出该核心片段，序列见SEQ ID NO1。
一种利用反义RNA技术降低甘薯多酚氧化酶含量的方法，特征在于利用具有编码甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列核心片段的反义表达载体，采用任何转基因方法在甘薯细胞、组织、器官、植株中反义表达其步骤如下(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)获得甘薯多酚氧化酶基因的核心片断；(2)把多酚氧化酶基因核心片断可操作地连于表达调控序列，形成反义表达载体；(3)采用任何转基因方法转移多酚氧化酶基因核心片断到甘薯细胞、组织、器官、植株中；(4)在特定的条件下筛选和鉴定转化子；
(5)在适合的条件下培养的转化子，获得转基因后代。
本发明涉及的载体包含具有编码甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列的核心片段的DNA。
用上述方法获得的生命体，它是可生产多酚氧化酶含量降低甘薯的细胞、组织、器官、植株。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。在本发明中，术语“生命体”指甘薯的细胞、组织、器官、植株。
在本发明中，术语“任何可能的手段”为获得甘薯多酚氧化酶基因的方法，具体包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文库筛选而后人工合成甘薯多酚氧化酶基因及其变异体。
在本发明中，术语“任何转基因方法”包括根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化、发根农杆菌Ri质粒介导基因转化、植物病毒载体介导基因转化、如PEG介导基因转化、脂质体介导基因转化、电击法介导基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束介导基因转化、基因枪法介导基因转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。
在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指用在离体培养的条件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)选择出有抗生素抗性的转化子；可以使用PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。
在本发明中，术语“在适合的条件下培养甘薯多酚氧化酶活性降低的转化子，获得转基因后代”是指对经过鉴定的转化子离体培养，并检测多酚氧化酶含量与活性，筛选多酚氧化酶活性低的优良转化子进行培养，获得转基因后代。
在本发明中，我们从甘薯中克隆多酚氧化酶基因核心片断，并构建了植物高效反义表达载体，导入农杆菌并遗传转化甘薯，以降低甘薯块根中多酚氧化酶基因的表达水平，提高了甘薯及其加工产品的品质。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1甘薯多酚氧化酶基因核心片断的合成及双元表达载体及规程菌的构建1.反义多酚氧化酶基因核心片段的获得根据多酚氧化酶基因的全长序列，在多酚氧化酶基因的内部第1个碱基至第488个碱基之间设计引物，扩增502bp序列作为反义基因片段，并根据植物双元载体pCAMBIA1304的多克隆酶切位点，分别设计两条含有SacI及BamHI限制性内切酶位点以及保护碱基的PCR扩增引物，其引物序列为P15’-cgagctctatgttcagaccgattacccc-3’P25’-cggatccatggtccacattcggtcgac-3’从甘薯的块茎提总RNA(上海华舜生物工程有限公司的RNA提取试剂盒)，反转录成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为50ul，包含去离子水，10xPCR buffer 5ul，dNTP 1ul，MgCl23ul，引物各1ul，cDNA摸板1ul，Taq酶0.5ul。PCR条件为94℃3分钟，随之以94℃45秒、58℃45秒、和72℃1分钟进行29个循环，最后以72℃延伸8分钟。1％琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为502bp。
电泳分离后，回收(赛百胜PCR产物回收试剂盒)PCR产物，取适量回收产物与PMD18-T easy Vector载体连接(TaKaRa PMD 18-T Vector试剂盒)后转入DH5α，LB+氨苄青霉素(100mg/l)固体培养基上抗性筛选阳性克隆，PCR鉴定后送测序(赛百胜公司完成)。
2. CaMV35S组成型启动子表达载体pCAMBIA1304+-ppoF的构建。
选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件，构建双元三价植物表达载体pCAMBIA1304+(p1304+)。构建流程如下1)HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121表达盒，回收pCAMBIA1304大片段；连接这两个回收产物，转化DH5α，在卡那霉素LB平板上筛选得到单克隆，摇菌扩大培养，抽提质粒，HindIII和EcoRI双酶切验证；即构建好pCAMBIA1304+。
将经过测序正确后的DH5α(已经转入多酚氧化酶基因核心片段)摇菌，扩大培养，提取质粒，用BamHI及sacI双酶切后，1％琼脂糖电泳后回收小片段。
将构建好pCAMBIA1304+与多酚氧化酶基因核心片段用T4连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞，LB+Kan(100mg/l)固体培养基上筛选抗性克隆，PCR和双酶切鉴定。获得转多酚氧化酶核心片段的重组质粒并命名为pCAMBIA1304+-ppoF。
3.pCAMBIA1304+-ppoF转化农杆菌LBA 4404将pCAMBIA1304+-ppoF转化入农杆菌菌株LBA 4404，划板挑取阳性单菌落摇菌，取少量菌液抽提质粒，进行PCR和酶切鉴定。阳性克隆定义为LBA4404-ppoF。
实施例2获得PPO活性降低的抗褐化转基因甘薯1、农杆菌LBA4404-ppoF。使用前自冰箱取出，接种于50ml YEB液体(Rif+，Str+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养两次；2、第二次活化OD600达0.3时加100μmol/mL乙酰丁香酮，继续28度，200rpm振荡培养，OD600达0.6时室温下4000r离心10min；3、弃上清，菌体用MS(100μmol/mL乙酰丁香酮)液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.3左右；称转化液；4、取无菌甘薯顶芽、侧芽、叶、茎、根等植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成1cm2左右，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，侵染2-10min后取出，用无菌卫生纸吸干，接入100μmol/mL乙酰丁香酮的MS+1mg/LNAA，培养基中共培养2天且在光照条件下进行共培养，既有效地防止了根癌农杆菌的过度生长，又有利于茎段外植体的成活及抗性芽的萌动与生长。共培养结束后转移至含250mg/L头孢霉素(Cef)、50mg/L潮霉素(Hygromycin)的MS+1mg/LNAA培养基中培养，转移4～5次直至无细菌为止，获得抗性芽；5、长度在1cm以上的抗性芽插入至成苗培养基(MS+50mg/L Hygormycin+250mg/LCef)上培养。获得完整的潮霉素抗性植株；6、用PCR和Southern blotting检测潮霉素抗性植株，用Northern blotting检测多酚氧化酶基因的表达水平；7、对转基因甘薯进行田间试验，用薯块检测多酚氧化酶的活性。进一步筛选多酚氧化酶活性低的转基因甘薯；8、多酚氧化酶活性的测定。甘薯(包括幼苗、毛状根、细胞系等)中的多酚氧化酶采用比色发测定活性(姜绍通，罗志刚，等，2001)。
实施例4转基因甘薯和非转基因甘薯多酚氧化酶活性比较和抗褐化性能比较1、比较转基因和非转基因甘薯薯块多酚氧化酶的活性，采用姜绍通等人建立的方法(2001)；2、转基因甘薯块根中多酚氧化酶的活性0.09，非转基因甘薯块根中多酚氧化酶活性为0.89；3、按照V.Sciancale和V.Zongne发明的方法(1984)测定甘薯褐化的强度，转基因甘薯块根褐化强度为0.11，非转基因甘薯块根中多酚氧化酶活性为0.58。
SEQ ID NO1<110>西南师范大学<120>一种利用基因工程技术培育抗褐化甘薯的方法<160>1<210>1<211>569<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(569)<223>甘薯多酚氧化酶基因核心片断<400>1tatgttcaga ccgattaccc cgacaaggaa atccaagtcc acaattcatg gctgtttttc 60cctttccaca gatggtactt atatttctac gagagaatct tggggaagct aatcaacgac 120cccaccttcg ggcttccgtt ctggaactgg gatacccccg cgggaatgct gattcctcag 180tatttccgaa accaaaactc gccgttgtac gatgagaatc gtttgcaatc ccatctccca 240ctcgttatgg acctcggcta cgccgggacc gacactgacg tcacggatga tgagagaatc 300tctaacaacc tggccttgat gtacaagagt atggtgacta acgccggaac cgccgagctt 360ttcctcggga aaccgtacaa agccggcgac gacccggtca acaaaggcgg cgggtcgatc 420gagaatatcc cgcatacccc ggtccaccgc tgggtcggcg acgttcaacc gagaacacaa 480aatggggagg atatggggaa cttttactcg gccgggcggg atattttgtt ttactgtcac 540cattccaacg tcgaccgaat gtggaccat 569
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括具有编码甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列的核心片段，序列见SEQ ID NO1。
2.一种利用反义RNA技术降低甘薯多酚氧化酶含量的方法，特征在于利用具有编码甘薯多酚氧化酶的核苷酸序列核心片段的反义表达载体，采用转基因方法在甘薯细胞、组织、器官、植株中反义表达权利1中的DNA分子；其步骤如下(1)采用基因克隆或人工合成基因方法获得甘薯多酚氧化酶基因的核心片断；(2)把多酚氧化酶基因核心片断连于表达调控序列，形成反义表达载体；(3)采用转基因方法转移多酚氧化酶基因核心片断到甘薯细胞、组织、器官、植株中；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养的转化子，获得转基因后代。
3.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。
4.用权利要求2所述方法获得的生命体，其特征在于它是可生产多酚氧化酶含量降低甘薯的细胞、组织、器官、植株。
5.用权利要求4所述方法获得多酚氧化酶含量降低甘薯的细胞、组织、器官、植株等转基因生命体的后代。
全文摘要
本发明提供了一种利用基因工程技术培育抗褐化甘薯的方法。涉及包含甘薯多酚氧化酶基因核心片段的获得及利用反义RNA技术培育抗褐化的转基因甘薯的方法。其过程是从甘薯中克隆多酚氧化酶基因核心片断，并构建了植物高效反义表达载体，导入农杆菌并遗传转化甘薯。本方法可以降低甘薯块根中多酚氧化酶基因的表达水平，提高了甘薯及其加工产品的品质。
文档编号C12N15/53GK1699574SQ200510057070
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月18日 优先权日2005年5月18日
发明者廖志华, 陈敏, 杨春贤, 谌容, 付玉凡, 张启堂 申请人:西南师范大学