改进的酶的制作方法

专利名称：改进的酶的制作方法
技术领域：
本发明提供了经修饰的酶，其具有比相应的野生型酶更高的II型GTP环化水解酶活性。所述经修饰的酶和编码它的多核苷酸可被用于生产核黄素、核黄素前体、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及其衍生物。
所有植物及很多微生物都合成核黄素(维生素B2)，但其不被高等动物生产。因为其是碳水化合物酶促氧化所需的辅酶(例如黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸)的前体，因此核黄素对于基础代谢来说是必不可少的。在高等动物中，核黄素不足会导致脱发、皮肤炎症、视力退化以及生长障碍。
过去已经以多种不同的方式获得了对具有提高的核黄素比例(rate)和产量的核黄素生产菌株的工程化。例如，(1)经典诱变被用于产生在选用生物的基因组中具有随机突变的变体，接着通过针对嘌呤类似物的更高抗性进行选择和/或针对核黄素生产增加进行筛选。(2)或者，核黄素生物合成的终点酶，即催化鸟苷三磷酸酯(GTP)和核酮糖-5-磷酸酯向核黄素转化的酶，被过量表达，也导致向目标产物的更高通量。但是，在后一种手段中，核黄素生物合成蛋白的强烈过量表达对宿主细胞造成了额外的代谢负担，其可能随之诱导胁迫应答反应以及其它不利的对细胞生理的副作用。
催化从鸟苷三磷酸酯(GTP)和核酮糖-5-磷酸酯生物合成核黄素所需的酶在B.substilis中由四个基因(ribG、ribB、ribA和ribH)编码。这些酶定位于操纵子中，其基因顺序不同于这些酶催化的酶反应的顺序。例如，催化核黄素生物合成中第一个步骤的II型GTP环状水解酶，由操纵子中的第三个基因ribA编码。ribA基因还编码第二种酶活性，即，3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸酯合酶(DHBPS)，其催化核酮糖-5-磷酸酯向四碳单元3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸酯(DHBP)的转化。脱氨酶和还原酶是操纵子的第一个基因ribG所编码的。核黄素生物合成中的倒数第二个步骤是2，4-二氧四氢蝶啶合酶催化的，该酶是最后一个rib基因ribH的产物。控制该途径最后一步的核黄素合酶由操纵子的第二个基因ribB所编码。位于rib操纵子3’末端的基因的功能目前还不清楚；但是该基因的产物不是核黄素合成所需要的。
核黄素操纵子从ribPl启动子的转录由弱化机制所控制，该机制涉及位于ribPl和ribG之间的调控引导区域。该引导区域中ribO突变导致核黄素操纵子的表达被负调(deregulate)。在含有ribC基因中的错义突变的菌株中也能观察到被负调的表达。ribC基因还显示出能编码B.subtilis的黄素激酶/FAD合酶(Mack，M.，et al.，J.Bacteriol.，180950-955，1998)。负调突变降低了ribC基因产物的黄素激酶活性，导致黄素单核苷酸(FMN)(核黄素调控体系的效应器分子)的细胞内浓度减少。
近来，Bacillus subtilis被遗传改造为能在短发酵周期生产高产量的核黄素(美国专利5,837,528)。该手段将对经典遗传突变选择和发酵的改进与通过负调和增加基因表达水平对核黄素生物合成基因进行的遗传工程组合起来。在该系统中，通过突变黄素激酶编码ribC基因、通过将rib基因与强且组成型的启动子连接以及通过增加rib基因的拷贝数来增加rib基因的表达。
如已讨论的，rib基因的过量表达对生产菌株施加了额外的负担，其可能对核黄素前体、核黄素、FMN、FAD或它们的衍生物的生产造成负面影响。为了避免该缺点，本发明的一个目的是提供具有提高的比活性的II型GTP环化水解酶突变体。在生产菌株中单独使用这些突变酶或将其与其它Rib蛋白的改进突变体组合使用，将允许更高的通量率，同时对细胞代谢的额外负担更少或没有。
本文中使用的术语“II型GTP环化水解酶”可包括能催化GTP向2，5-二氨基-6-核糖氨-4(3H)-嘧啶酮-5’-磷酸酯(DRAPP)的转化的任何酶。该酶是否能催化进一步的反应，例如核酮糖-5-磷酸酯向DHBP的转化是不相干的。“II型GTP环化水解酶”可与

图1或表4所示的氨基酸序列的一种或多种酶同源。“同源”指与图1或表4所示的氨基酸序列中的一种或多种至少大约50％相同，优选至少大约60％相同，更优选至少大约70％相同，进一步更优选至少大约80％相同，进一步更优选至少大约85％相同，进一步更优选至少大约90％或95％相同，以及最优选至少大约98％相同的II型GTP环化水解酶。
术语“％相同”如在本领域已知的一样，表示多肽或多核苷酸序列之间的相关性，可以是通过对此类序列的链之间进行匹配来测定的。“相同性”可用已知方法容易地测定，例如，用程序BESTFIT(GCG WisconsinPackage，version 10.2，Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA92121-3752，USA)来进行，其中使用下述参数缺口产生惩罚8，缺口延伸惩罚2(缺省参数)。
“野生型酶”或“野生型II型GTP环化水解酶”可以包括与图l或表4所示的任意一种酶同源的任何II型GTP环化水解酶，其可用作为起始点，用于设计根据本发明的具有提高的活性的菌株。本发明上下文中的“野生型”可以包括可从自然界获得的II型GTP环化水解酶序列，以及合成的II型GTP环化水解酶变体(只要它们与图1或表4所示序列中任意一条同源)，如果它们可通过本发明的任何教导具有更高活性的话。术语“野生型II型GTP环化水解酶”和“未经修饰的II型GTP环化水解酶”在本文中可以替代使用。
“突变体”、“突变体酶”或“突变体GTP环化水解酶II”可以包括可根据本发明的教导从给定的野生型酶/II型GTP环化水解酶(根据上文定义)获得的、且比相应的野生型酶具有更高活性的任何变体。就本发明的范围而言，其与突变体是如何获得的并不相关；此类突变体可例如通过定点诱变、饱和诱变、随机诱变/定向进化、对整个细胞/生物体的化学或UV诱变和本领域已知的其它方法来获得。这些突变体还可以例如通过设计合成基因来产生和/或通过体外(不含细胞的)翻译来生产。为测试比活性，可通过本领域技术人员已知的方法来表达突变体。术语“突变体II型GTP环化水解酶”和“经修饰的II型GTP环化水解酶”在本文中可互换使用。这还应用于术语“突变体酶”和“经修饰的酶”。
“核黄素前体”和“核黄素衍生物、FMN或FAD”在本专利申请的上下文中可以包括在它们的(生物)合成中需要II型GTP环化水解酶作为中间产物酶的任何和所有代谢物。在本专利申请的上下文中，此类(生物)合成途径是天然的或非天然的(即，不是天然存在的途径，而是通过生物技术工程改造的)并不相干。优选地，该合成途径是自然界中生物化学途径。核黄素前体和核黄素衍生物、FMN或FAD包括但不限于DRAPP；5-氨基-6-核糖氨-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5’-磷酸酯；2，5-二氨基-6-核糖醇氨基(ribitylamino)-4-(3H)-嘧啶酮-5’-磷酸酯；5-氨基-6-核糖醇氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5’-磷酸酯；5-氨基-6-核糖醇氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮；6，7-二甲基-8-核糖醇二氧四氢蝶啶(DMRL)；以及黄素蛋白。术语“核黄素”还包括核黄素衍生物，例如，核黄素-5-磷酸酯及其盐，例如，核黄素-5-磷酸钠。
一般而言，本发明的一个目的是提供具有II型GTP环化水解酶活性的酶，所述酶被修饰为其催化性质较之未经修饰的II型GTP环化水解酶更有利(即，展示出更高的比活性)。
本发明涉及一种经修饰的II型GTP环化水解酶，其较之相应的未经修饰的II型GTP环化水解酶展示出更高的(比)活性，其中，(i)经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列较之相应未经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列含有至少一处突变，以及(ii)所述至少一处突变位于下述位置，所述位置选自由对应于SEQID NO2所示的Bacillus subtilis II型GTP环化水解酶氨基酸序列的第261、270、276、279、308和347位的氨基酸位置构成的组。
因此，本发明的一个目的是提供一种经修饰的II型GTP环化水解酶，其中(i)所述经修饰的酶较之相应未经修饰的酶的比活性增加，以及(ii)所述经修饰的酶的氨基酸序列包含一处或多处突变，所述突变包括在对应于SEQ ID NO2的261、270、276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处突变。
术语“至少一处突变”指在上文定义的位置的、导致产生较之未经修饰的酶具有提高的比活性的经修饰II型GTP环化水解酶II的一处或多处突变。上文所述的经修饰的酶可由在上文所定义的位置的、导致产生较之未经修饰的酶的提高比活性的仅1、2、3、4、5或6处突变构成，但是也可包括在其它位置的其它氨基酸突变，只要得到的经修饰的酶具有增加的比活性即可。因此，经修饰的酶包括一处或多处突变，所述突变包括对应于SEQ ID NO2所示的Bacillus subtilis II型GTP环化水解酶氨基酸序列的第261、270、276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处突变。在上文定义的这些位置之外的位置上的突变的例子是对应于SEQ ID NO2的196、282和/或325位氨基酸位置的位置上的氨基酸突变。
本文中使用的术语“比活性”指在适宜给定的反应条件下，例如Ritzet al.(J.Biol.Chem.276，22273-22277，2001)、Koh et al.(Mol.Gen.Genet.251，591-598，1996)或Schramek et al.(J.Biol.Chem.276，44157-44162，2001)中所述的，或在实施例2中详细描述的反应条件下，野生型和突变体II型GTP环化水解酶的反应速率。“比活性”定义为给定温度下每给定量的蛋白在给定的时间段产生的产物和/或消耗的底物的量。典型地，“比活性”表示为每分钟每mg蛋白形成的μmol产物或消耗的μmol底物。典型地，μmol/分钟被简写为U(＝Unit)。因此，针对μmol/分钟/(mg蛋白)或U/(mg蛋白)的比活性的单位定义在本文中可互换使用。
应当理解，在本发明的上下文中，比活性应当在相似，或者优选相同长度的多肽链的基础上进行比较。增加给定的野生型酶的长度，例如形成融合蛋白，由此降低总体酶的表观比活性，并不能绕开本发明。
根据本发明，经修饰的II型GTP环化水解酶展示出比对应的未经修饰的酶要高的比活性。优选地，较之对应的未经修饰的II型GTP环化水解酶，本发明的经修饰的II型GTP环化水解酶的比活性增加了至少大约5、10、25、40、60、70、80、85、90％，更优选地，至少大约70％(关于比活性测量，见下文)。优选地，比活性的增加对应本申请实施例1所述的实验条件。试验混合物中存在大约0.004-0.02U/ml(对应大约40μg/ml Bacillus subtilis II型GTP环化水解酶或20μg/ml本文所述的最优突变体)，优选大约0.004U/ml II型GTP环化水解酶活性，反应在37℃进行。
较之对应的未经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列，本发明的经修饰II型GTP环化水解酶的氨基酸序列具有上文定义的至少一处突变。所述突变可以是一处或多处添加、缺失和/或取代，优选地，一处或多处取代，其中，未经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列中存在的给定氨基酸在本发明的经修饰的II型GTP环化水解酶中被不同的氨基酸替换。经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列较之对应的未经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列可以含有至少一处氨基酸取代，即，可以包含一处或多处突变，包括对应于SEQ ID NO2的第261、270、276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处氨基酸取代，优选地，2、3、4或5处氨基酸取代。因此，经修饰的酶较之对应的未经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列优选含有至少2、至少3、至少4或至少5处取代。
在一种实施方式中，提供了可从Bacillus(优选Bacillus subtilis)获得的经修饰的II型GTP环化水解酶，其中(i)所述经修饰的酶较之相应未经修饰的酶的比活性增加，以及(ii)所述经修饰的酶的氨基酸序列包含一处或多处突变，所述突变包括在对应于SEQ ID NO2的261、270、276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处突变。
在一种实施方式中，未经修饰的酶对应SEQ ID NO2所示的Bacillussubtilis II型GTP环化水解酶。因此，较之野生型酶具有增加的比活性的经修饰的酶包含一处或多处突变，所述突变包括在对应于SEQ ID NO2的261、270、276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处突变。在另一种实施方式中，具有增加的上文定义的比活性的经修饰的酶除了上述氨基酸位置之外，还含有其它氨基酸突变，所述其它突变在选自由第196、282、235位或其任意组合组成的组的位置上，优选地，含有氨基酸取代，更优选地，所述取代是Y196C(半胱氨酸代替酪氨酸)、A282T(苏氨酸代替丙氨酸)或F325Y(酪氨酸代替苯丙氨酸)。
未经修饰的II型GTP环化水解酶可以是任何这样的II型GTP环化水解酶，对其来说增加比活性是人们所想要的。未经修饰的II型GTP环化水解酶包括但不限于从自然界获得的II型GTP环化水解酶，例如真核或原核来源的酶，优选地，真菌或细菌来源的。更优选地，未经修饰的酶选自图1或表4所示的那些或者与图1或表4所示的氨基酸序列中任意一条同源，尤其选自Ashbya、Saccharomyces、Eremothecium、Candida、Neurospora、Schizosaccharomyces、Archeoglobus、Streptomyces、Helicobacter、Escherichia、Corynebacterium、Thermotoga、Arabidopsis、Lycopersicum、Oryza、Alcaligenes、Pseudomonas、Dinococcus、Lactobacillus、Photobacterium和Bacillus构成的组，优选选自Candidaguilliermondii、Ashbya gossypii(Eremothecium ashbyii)(SEQ IDNO33)、Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa、Schizosaccharomyces pombe、Archeoglobus fulgidus、Streptomycescoelicolor、Helicobacter pylori J99、Escherichia coli(SEQ ID NO35)、Corynebacterium glutamicum(SEQ ID NO37)、Bacillus amyloliquefaciens(SEQ ID NO39)、Bacillus cereus(SEQ ID NO41)、Bacillushalodurans(SEQ ID NO43)、Thermotoga maritima、Arabidopsisthaliana、Lycopersicum exculentum、Oryza sativum、Alcaligeneseutrophus、Pseudomonas putida菌株KT2440、Corynebacterium efficiens、Deinococcus radiodurans、Lactobacillus plantarum、Photobacteriumphosphoreum、Pseudomonas putida菌株KT2440(第二个基因)和Bacillussubtilis(SEQ ID NO2)构成的组。最优选的未经修饰的酶可从Bacillussubtilis获得。
本发明的经修饰的II型GTP环化水解酶可通过对对应的未经修饰的II型GTP环化水解酶进行突变来获得。在一种实施方式中，未经修饰的酶对应SEQ ID NO2所示的B.subtilis II型GTP环化水解酶，经修饰的酶包含一处或多处突变，所述突变包括在对应于SEQ ID NO2的261、270、276、279、308和/或347位氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处突变，其中，所述经修饰的酶的比活性较之未经修饰的酶有所增加。
优选地，所述至少一处突变位于下述一处或多处氨基酸位置，所述位置选自由对应于SEQ ID NO2所示的Bacillus subtilis II型GTP环化水解酶氨基酸序列的第261、279、308和347位的氨基酸位置构成的组。因此，在一种实施方式中，经修饰的II型GTP环化水解酶包含一处或多处突变，所述突变包括在对应于SEQ ID NO2的261、279、308和/或347位氨基酸位置上的1、2、3或4处突变。在一种优选的实施方式中，经修饰的酶可从Bacillus subtilis获得，其包含突变的SEQ ID NO2所示的第261、279、308和/或347位氨基酸，分别对应氨基酸V261、Q279、K308和M374。
在另一种优选的实施方式中，所述至少一处突变位于下述一处或多处氨基酸位置，所述位置选自由对应于SEQ ID NO2所示的Bacillussubtilis II型GTP环化水解酶氨基酸序列的第270、279、308和347位的氨基酸位置构成的组。因此，在一种实施方式中，经修饰的II型GTP环化水解酶包含一处或多处突变，所述突变包括在对应于SEQ ID NO2的270、279、308和/或347位氨基酸位置上的1、2、3或4处突变。优选地，经修饰的酶可从Bacillus subtilis获得，其包含突变的SEQ ID NO2所示的第270、279、308和/或347位氨基酸，分别对应氨基酸G270、Q279、K308和M374。
在另一种优选的实施方式中，所述至少一处突变位于下述一处或多处氨基酸位置，所述位置选自由对应于SEQ ID NO2所示的Bacillussubtilis II型GTP环化水解酶氨基酸序列的第276、279、308和347位的氨基酸位置构成的组。因此，在一种实施方式中，经修饰的II型GTP环化水解酶包含一处或多处突变，所述突变包括在对应于SEQ ID NO2的276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3或4处突变。优选地，经修饰的酶可从Bacillus subtilis获得，其包含突变的SEQ ID NO2所示的第276、79、308和/或347氨基酸，分别对应氨基酸A276、Q279、K308和M374。
优选地，经修饰的II型GTP环化水解酶的一处或多处氨基酸突变是一处或多处氨基酸取代。
经修饰的II型GTP环化水解酶可以包含一处或多处突变，所述突变包括上文定义的氨基酸位置上的仅一处突变，此类突变(特别是氨基酸取代)可以包括在对应于SEQ ID NO2所示的Bacillus subtilis II型GTP环化水解酶氨基酸序列的第261、270、276、279、308或347位的氨基酸位置上的一处突变。存在于未经修饰的II型GTP环化水解酶中对应于261位的氨基酸可以是缬氨酸，存在于未经修饰的II型GTP环化水解酶中对应于270位的氨基酸可以是甘氨酸，存在于未经修饰的II型GTP环化水解酶中对应于276位的氨基酸可以是丙氨酸，存在于未经修饰的II型GTP环化水解酶中对应于279位的氨基酸可以是谷氨酰胺，存在于未经修饰的II型GTP环化水解酶中对应于308位的氨基酸可以是赖氨酸，存在于未经修饰的II型GTP环化水解酶中对应于347位的氨基酸可以是甲硫氨酸。
未经修饰的II型GTP环化水解酶中的氨基酸可以改变，从而，对应于261位的氨基酸可变为丙氨酸(例如，V261A)，对应于270位的氨基酸可变为丙氨酸或精氨酸(例如，G270A和G270R)，对应于276位的氨基酸可变为苏氨酸(例如，A276T)，对应于279位的氨基酸可变为精氨酸(例如，Q279A)，对应于308位的氨基酸可变为精氨酸(例如，K308R)，对应于347位的氨基酸可变为异亮氨酸(例如，M347I)。在一种实施方式中，经修饰的酶可从Bacillus subtilis获得，其包含SEQ IDNO2的下述位置的氨基酸取代，所述位置选自由261、270、276、279、308和347位构成的组。优选地，所述取代是V261A、G270A、G270R、A276T、Q279R、K308R或M347I。
经修饰的II型GTP环化水解酶可以包含一处或多处突变，所述突变包括在上文定义的氨基酸位置上的两处突变，此类突变(特别是氨基酸取代)可以包括对应于上文定义的位置中两处的氨基酸位置上的突变，例如，对应于SEQ ID NO2所示的261/270、261/276、261/279、261/308、261/347、270/276、270/279、270/308、270/347、276/279、276/308、276/347、279/308、279/347或308/347的位置的组合。优选的是氨基酸取代，例如，V261A/A276T、V261A/Q279R、V261A/K308R、V261A/M347I、G270A/Q279R、G270A/K308R、G270A/M347I、A276T/Q279R、A276T/K308R或A276T/M347I，其中，这些位置对应于SEQ ID NO2的氨基酸位置。在一种实施方式中，此类优选取代包括在可从Bacillus subtilis获得的经修饰的II型GTP环化水解酶中，其中，未经修饰的酶对应于SEQ ID NO2。优选地，SEQ ID NO2的经修饰的II型GTP环化水解酶包含取代V261A/A276T或A276T/M347I。
经修饰的II型GTP环化水解酶可以包含一处或多处突变，所述突变包括在上文定义的氨基酸位置上的三处突变，此类突变(特别是氨基酸取代)可以包括对应于上文定义的位置中三处的氨基酸位置上的突变，例如，对应于SEQ ID NO2所示的261/279/308、261/279/347、261/308/347、270/279/308、270/279/347、270/308/347、276/279/308、276/308/347或276/279/347的位置的组合。优选的是氨基酸取代，例如，V261A/Q279R/K308R、V261A/K308R/M347I、V261A/Q279R/M347I、G270A/Q279R/K308R、G270A/K308R/M347I、G270A/Q279R/M347I、A276T/Q279R/K308R、A276T/K308R/M347I或A276T/Q279R/M347I，其中，这些位置对应于SEQ ID NO2的氨基酸位置。在一种实施方式中，此类优选取代包括在可从Bacillus subtilis获得的经修饰的II型GTP环化水解酶中，其中，未经修饰的酶对应于SEQ ID NO2。优选地，SEQ IDNO2的经修饰的II型GTP环化水解酶包含取代A276T/Q279R/M347I。
经修饰的II型GTP环化水解酶可以包含一处或多处突变，所述突变包括在上文定义的氨基酸位置上的四处突变，此类突变(特别是氨基酸取代)可以包括对应于上文定义的位置中四处的氨基酸位置上的突变，例如，对应于SEQ ID NO2所示的261/279/308/347、270/279/308/347或276/279/308/347的位置的组合。优选的是氨基酸取代，例如，V261A/Q279R/K308R/M347I、G270A/Q279R/K308R/M347I或A276T/Q279R/K308R/M347I，其中，这些位置对应于SEQ ID NO2的氨基酸位置。在一种实施方式中，此类优选取代包括在可从Bacillus subtilis获得的经修饰的II型GTP环化水解酶中，其中，未经修饰的酶对应于SEQ ID NO2。优选地，SEQ ID NO2的经修饰的II型GTP环化水解酶包含取代A276T/Q279R/K308R/M347I。
最优选的是表1或2公开的突变的组合(见下文)。这些实施例中鉴定出的氨基酸位置可被转入不同来源的II型GTP环化水解酶，例如，图1或表4所示的那些。
本发明的经修饰的II型GTP环化水解酶可以包含外源氨基酸，优选地，在其N或C末端包含。“外源氨基酸”表示在天然(天然存在)的II型GTP环化水解酶中不存在的氨基酸，优选地，在天然II型GTP环化水解酶中不存在的至少大约3、至少大约5或至少大约7个连续氨基酸的小段。外源氨基酸的优选小段包括但不限于促进重组产生的经修饰II型GTP环化水解酶的提纯的“标签”。此类标签的例子包括但不限于“His6”标签、FLAG标签、myc标签等。为计算比活性，需要针对这些额外的氨基酸对值进行校正(还见上文)。
在另一种实施方式中，经修饰的II型GTP环化水解酶较之对应的未经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列可含有一处或多处，例如两处缺失。优选地，缺失影响对应的未经修饰II型GTP环化水解酶的N或C末端氨基酸，而不会显著降低酶的功能属性，例如比活性。
本发明的多肽和多核苷酸，包括经修饰的II型GTP环化水解酶，可以以经分离的形式提供，优选地，被纯化至同质(homogeneity)。本文中使用的术语“经分离的”指物质被从其原始环境(例如，如果是天然存在的话，天然环境)移出。例如，存在于活体微生物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未经分离的，但是从天然系统中共存在的物质中的一些或全部分离出的同样的多核苷酸或多肽就是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但仍是经分离的，因为此类载体或组合物并非其天然环境的一部分。经分离的多肽优选超过80％纯，更优选超过90％纯，进一步更优选超过95％纯，最优选超过99％纯。纯度可以通过本领域已知的方法来测定，例如，通过SDS-PAGE以及随后的蛋白染色。然后可以通过密度测定来对蛋白条带加以定量。用于测定纯度的其它方法都是技术人员已知的。
本发明还涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述序列编码根据本发明的经修饰II型GTP环化水解酶。本文中使用的“多核苷酸”指多聚核糖核苷酸或者多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA，是单双链区域混合物的DNA，单链或双链RNA，是单双链区域混合物的RNA，杂交分子(其包括可以是单链或更典型地双链或单双链区域混合物的DNA和RNA)。术语“多核苷酸”包括下述DNA或RNA，其中包含一个或多个不常见碱基，例如，肌苷，或者一个或多个经修饰的碱基，例如，三苯甲基化碱基。
可通过对编码未经修饰的II型GTP环化水解酶的多核苷酸序列加以修饰来获得本发明的多核苷酸。此类编码未经修饰的II型GTP环化水解酶的多核苷酸序列的例子包括但不限于图1或表4的氨基酸序列，特别是SEQ ID NOs2、33、35、37、39、41和43。编码根据本发明的经修饰II型GTP环化水解酶的多核苷酸的非限制性例子是SEQ ID NOs6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26所示的。
用于向编码未经修饰的II型GTP环化水解酶的核苷酸序列引入突变(例如添加、缺失和/或取代)的方法包括但不限于定点诱变和基于PCR的方法。
可通过体外诱变的方法(见，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)，从编码本领域已知的II型GTP环化水解酶的基因组或cDNA序列开始来构建本发明的DNA序列，如可从例如Genbank(Intelligenetics，California，USA)、EuropeanBioinformatics Institute(Hinston Hall，Cambridge，GB)、NBRF(Georgetown University，Medical Centre，Washington DC，USA)和Vecbase(University of Wisconsin，Biotechnology Centre，Madison，Wisconsin，USA)或从图1或表4公开的序列信息获得的。对本发明实践而言也是优选的、对给定DNA序列进行突变的另一种方法是通过聚合酶链式反应(PCR)进行诱变。可用本领域已知的、例如在in Sambrook et al.(MolecularCloning)中描述的方法从各种菌株/生物来分离作为起始材料的DNA。但是，应当理解，编码待根据本发明构建/突变的II型GTP环化水解酶的DNA还可基于已知DNA序列来制备，例如，通过本领域已知的方法构建合成基因来制备(例如，EP 747483所述)。
本发明的多核苷酸可以是经分离的多核苷酸，即，基本不含其它核酸序列(例如但不限于其它染色体和染色体外DNA和RNA)的多核苷酸。本领域技术人员已知的传统核酸纯化方法可用于获得经分离的多核苷酸。该术语还包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
在又一种实施方式中，本发明涉及功能性多核苷酸，其中，启动子、核糖体结合位点(如果必要的话，在细菌细胞的情况下)和终止子与根据本发明的多核苷酸可操作地连接。在另一种实施方式中，本发明涉及包含此类多核苷酸的载体或质粒。载体或质粒优选包含至少一种标记基因。术语“可操作地连接”在本文中被用来表示核酸序列在单条核酸片段上的缔合，使得一条序列的功能受到另一条影响。例如，当能影响编码序列表达的时候，即，编码序列处于启动子的转录控制之下时，启动子就是与该编码序列可操作地连接的。编码序列可以与调控序列以正义或反义定向可操作地连接。术语“表达”指DNA序列转录为mRNA和/或mRNA翻译为氨基酸序列，术语“过量表达”表示经修饰的生物(例如，通过转化或转染修饰的)中基因产物的生产超过了对应的未经修饰的生物中的生产水平，这是通过对基因表达进行负调和/或通过在生物体内增加基因自身来实现的。
一旦获得了本发明的完整DNA序列，它们即可被整合进载体或者直接引入宿主生物的基因组，这通过本领域已知的、在Sambrook et al.(s.a.)中描述的方法来进行，以在合适的宿主系统中(过量)表达被编码的多肽。但是，本领域技术人员知道，DNA序列自身也可用于转化本发明的合适宿主系统，以获得被编码多肽的(过量)表达。
合适的宿主细胞可以是真核或原核细胞。合适的宿主细胞的例子包括但不限于，细菌细胞，例如藻青菌、链球菌、葡萄状球菌、肠球菌，例如，Bacillus，例如，Bacillus subtilis或Streptomyces，例如，Streptomyceslividans或Streptococcus pneumoniae，E.coli，例如，E.coli K12菌株，例如M15 or HB 10l。宿主细胞可以是真菌细胞，包括酵母细胞，例如Aspergilli的细胞，例如Aspergillus niger或Aspergillus oryzae，Trichoderma，例如Trichoderma reesei，Ashbya，例如Ashbya gossypii，Eremothecium，例如Eremothecium ashbyii，Saccharomyces，例如，Saccharomyces cerevisiae，Candida，例如Candida flareri，Pichia，例如Pichia pastoris，Hansenula polymorpha，例如H.polymorpha(DSM 5215)和Kluyveromyces。合适的宿主细胞还可以选自动物细胞，包括哺乳动物细胞，例如，CHO、COS、HeLa、3T3、BHK、293、CV-1和昆虫细胞，例如Drosophila S2和Spodoptera Sf9细胞以及植物细胞，例如，裸子或被子植物细胞。
可用于在真菌中表达的载体是本领域已知的，其被描述于例如EP420358中或由Cullen et al.(Bio/Technology 5，369-376，1987)、Ward(inMolecular Industrial Mycology，Systems and Applications for FilamentousFungi，Marcel Dekker，New York，1991)、Upshall et al.(Bio/Technology 5，1301-1304，1987)、Gwynne et al.(Bio/Technology 5，71-79，1987)或Puntet al.(J.Biotechnol.17，19-34，1991)所述，关于酵母的，由Sreekrishna etal.(J.Basic Microbiol.28，265-278，1988；Biochemistry 28，4117-4125，1989)、Hitzemann et al.(Nature 293，717-722，1981)所述或描述于EP183070、EP 183071、EP 248227或EP 263311中。可用于在E.coli中表达的合适的载体是本领域已知的，其被描述于Sambrook et al.(s.a.)中。可用于在杆菌(Bacilli)中表达的合适的载体是本领域已知的，其被描述于例如EP 207459或EP 405370中，或由Yansura and Henner在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，439-443(1984)或由Henner，Le Grice和Nagarajan在Meth.Enzymol.185，199-228，1990中所述。可用于在H.polymorpha中表达的合适的载体是本领域已知的，其被描述于例如Gellissen et al.，Biotechnology 9，291-295，1991中。
此类载体已经携带有调控元件，例如启动子，或者本发明的多核苷酸可被工程化，以含有此类元件。可使用的合适启动子元件是本领域已知的，其例如是对Trichoderma reesei而言，cbh1-或pki1-启动子，对Aspergillus oryzae而言，amy-启动子，对Aspergillus nige而言，glaA-、alcA-、aphA-、tpiA-、gpdA-和pkiA-启动子。可用于在酵母中表达的合适的启动子元件是本领域已知的，例如它们是对在Sacsharomycescerevisiae中表达而言，pho5-或gap-启动子，以及例如，对Pichia pastoris而言，aox1-启动子，对H.polymorpha而言，FMD-或MOX启动子。
用于细菌表达的合适启动子和载体包括，例如，Giacomini et al.(Gene 144，17-24，1994)所述的合成启动子，来自Bacillus subtilis的vegI启动子或强细菌噬菌体T5启动子。关于通过合适质粒或通过编码II型GTP环化水解酶的DNA序列来向染色体DNA中的整合，从而在细菌中表达所要求的(突变体)II型GTP环化水解酶的合适教导可在例如美国专利6,322,995中找到。
因此，包含本发明多核苷酸的载体，优选地，用于在细菌、真菌、动物或植物宿主中表达所述多核苷酸的载体，以及此类经过转化的细菌或真菌、动物或植物宿主也是本发明的目的。
本发明还涉及用于生产核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其一种或多种衍生物的方法，所述方法包括(a)在合适的培养基中，于允许经修饰的II型GTP环化水解酶在合适宿主中表达的条件下培养所述宿主细胞；以及(b)可选地，从培养基中分离出产物(核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其一种或多种衍生物)。
此类方法可用于对下述产品中的一种或多种进行生物技术生产核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其一种或多种衍生物。此类衍生物可包括黄素蛋白。
对根据本发明的合适宿主细胞进行遗传和代谢工程改造的方法是本领域技术人员已知的。类似地，针对核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其一种或多种衍生物的(可能)合适的纯化方法是精细化学生物合成和生产领域所公知的。
应当理解，根据本发明用于对核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其一种或多种衍生物进行生物技术生产的方法不限于如上所述的全细胞发酵工艺，其还可使用，例如，透过的(permabilized)宿主细胞、细胞粗提取物、从细胞残余物(例如通过离心或过滤)纯化的细胞提取物，或者甚至用经过分离的酶重构的反应途径。此类工艺的组合也在本发明的范围内。
在不含细胞的生物合成的情况(例如，用重构的反应途径)下，经分离的酶是否从宿主细胞制备以及是否从宿主细胞分离(通过体外转录/翻译或其它方法)都是不相干的。
本发明还涉及一种方法，用于生产本发明的经修饰的II型GTP环化水解酶，所述方法包括(a)在允许本发明的经修饰的II型GTP环化水解酶表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)从细胞或从培养基中回收经修饰的II型GTP环化水解酶。
本发明的经修饰的II型GTP环化水解酶可从经过遗传工程改造的宿主细胞制备，所述细胞包含合适的表达系统。
为重组生产本发明的多肽，可对宿主细胞进行遗传工程改造，以包括进本发明的多核苷酸或载体或质粒。将多核苷酸或载体引入宿主细胞可用本领域已知的标准方法来进行，例如，磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、微注射、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、轰击引入和感染。
大量表达系统可用于生产本发明的经修饰的II型GTP环化水解酶。此类载体还包括上文提到的那些。通常，适合在宿主中保持、增殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或载体都可用于这方面的表达。
在真核生物重组表达系统中，为将翻译的蛋白分泌进内质网内腔、分泌进周质空间或分泌进细胞外环境，可将合适的分泌信号包括进被表达的多肽。这些信号对多肽来说可以是内源，或者它们可以是异源信号。
可通过公知方法从重组细胞培养物中回收及纯化本发明的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟磷灰石色谱和高效液相色谱。当多肽在分离和/或纯化期间变性的情况下，可使用用于蛋白重折叠的公知技术来重建活性构象。
本发明的II型GTP环化水解酶还可根据例如Pen et al.在Bio/Technology 11，811-814，1994中或EP 449375中所述的方法在植物中表达，优选按照例如EP 449376所述在种子中表达。启动子和终止子的一些合适的例子包括来自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花菜花叶病毒(CaMV)基因的那些。可使用的一类有效的植物启动子是高水平植物启动子。此类启动子与本发明的遗传序列可操作地相连，其应当能促进本发明的基因产物的表达。可在本发明中使用的高水平植物启动子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基启动子(例如来自大豆的)以及叶绿体a/b结合蛋白的启动子。
对本发明蛋白的商业化生产是人们想要的，可以应用多种培养方法。例如，可以通过分批或连续培养方法获得从重组微生物宿主过量表达的特定基因产物的大规模生产。分批和补料分批培养方法是本领域内常用且公知的，其例子已由Thomas D.Brock在BiotechnologyA Textbook ofIndustrial Microbiology，Second Edition(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass.，中或由Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.36，227-234，1992描述过。用于连续发酵工艺调节营养物和生长因子的方法以及用于最大化产物形成速率的方法是工业微生物学领域公知的，前述Brock详细描述了大量方法。
发酵培养基还可含有合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于单糖，例如葡萄糖和果糖；寡糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉或纤维素或其混合物；以及来自可更新进料的未经纯化的混合物。应当认识到，在本发明中利用的碳源可包括多种不同的含碳底物，其仅受对微生物选择的限制。
本发明还涉及一种方法，用于制备具有提高的比活性的II型GTP环化水解酶，所述方法包括下述步骤(a)提供编码第一种II型GTP环化水解酶的多核苷酸，所述酶具有希望被提高的比活性；(b)将一处或多处突变引入所述多核苷酸序列，使得经突变的多核苷酸序列编码经修饰的II型GTP环化水解酶，所述酶较之第一种II型GTP环化水解酶包含一处或多处突变，其中，所述一处或多处突变包括对应于SEQ ID NO2的261、270、276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处突变；
(c)可选地，将所述经突变的多核苷酸插入载体或质粒；(d)将所述多核苷酸或所述载体或质粒引入合适的宿主细胞；以及(e)在允许所述经修饰的II型GTP环化水解酶表达的条件下培养所述宿主细胞。
本发明还包括提供一种方法，用于制备具有提高的比活性的II型GTP环化水解酶，所述方法包括下述步骤(a)提供编码第一种II型GTP环化水解酶的多核苷酸，所述酶具有希望被提高的比活性；(b)提供对于比活性有影响的位置；(c)确定用于替换(b)中确定的、野生型II型GTP环化水解酶的给定氨基酸的最佳氨基酸，以及，将一处或多处突变引入(a)多核苷酸序列中(b)确定的位置，使得经突变的多核苷酸序列编码新的II型GTP环化水解酶；(d)可选地，将所述经突变的多核苷酸插入载体或质粒；(d)将所述多核苷酸或所述载体或质粒引入合适的宿主细胞；以及(e)在允许所述经修饰的II型GTP环化水解酶表达的条件下培养所述宿主细胞。
在一种实施方式中，上述方法或步骤(c)通过饱和诱变来进行。但是应当理解，这并非用于确定将替换野生型II型GTP环化水解酶给定位置的氨基酸的氨基酸，以获得具有提高的比活性的经过修饰的II型GTP环化水解酶的唯一一种方法。
按照上文所述，例如通过饱和诱变，从未经修饰的II型GTP环化水解酶来制备具有提高的比活性的经修饰的II型GTP环化水解酶包括但不限于从图1或标4所示的未经修饰的蛋白来制备突变的II型GTP环化水解酶蛋白，特别是从SEQ ID NOs2、33、35、37、39、41和43所代表的那些，例如，Bacillus subtilis或Ashbya gossypii的未经修饰的II型GTP环化水解酶蛋白。用于PCR反应的引物是使得一条引物(例如正义引物)可含有经突变的核苷酸，以及另一条引物(例如反义引物)可含有野生型核苷酸序列。用这些引物对儿和野生型ribA的基因组DNA进行的PCR可获得在给定位置携带有特定突变的PCR产物，这取决于所用的引物的经突变核苷酸序列。使用标准方法，例如QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)对得到的PCR产物进行纯化之后，可用限制性酶(例如BamHI和EcoRI)对DNA进行切割，连接进合适的载体(例如，pQE60)，并转化进II型GTP环化水解酶阴性的菌株。此类菌株的例子是含有质粒pREP4的E.coli菌株Rib7(Richter et al.，J.Bacteriol.175，4045-4051，1993)。通过DNA测序验证了正确的序列之后，可按照上文所述对经突变的RibA进行纯化和分析。如果Ashbya gossypii被用于生产具有提高的比活性的II型GTP环化水解酶，则饱和诱变必须在T126、G135、A141、L144、N182和I221氨基酸残基/位置进行，这些位置分别对应于SEQ IDNO2所示的Bacillus subtilis II型GTP环化水解酶的V261、G270、A276、Q279、K308和M347残基，这些位置显示出对后一种酶的比活性有影响(见表4)。
该方法的优选实施方式对应于经修饰的II型GTP环化水解酶、编码它们的多核苷酸、载体和质粒、宿主细胞以及本文所述的方法的优选实施方式。第一种和第二种II型GTP环化水解酶分别对应于未经修饰的和经修饰的II型GTP环化水解酶(见上文)。
本发明的一个目的是提供一种多核苷酸，其中包含编码上文所述经修饰的II型GTP环化水解酶的核酸序列；提供一种载体(优选地，表达载体)，其中包含此类多核苷酸；提供一种宿主细胞，其已经过此类多核苷酸或载体的转化；提供一种方法，用于制备本发明的II型GTP环化水解酶，其中在合适的培养条件下培养前述宿主细胞，通过本领域已知的方法从此类宿主细胞或培养基分离出II型GTP环化水解酶；以及提供一种方法，用于对核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其一种或多种衍生物进行生物技术生产，这基于已被此类多核苷酸或载体转化过的和/或此类多核苷酸可稳定整合进其染色体的宿主细胞来进行。
本发明还有一个目的是提供(i)一种DNA序列，其编码携带有本发明的至少一种特定突变的II型GTP环化水解酶，并且能在标准条件下与本发明的特定经修饰的II型GTP环化水解酶的DNA序列中的任何一种杂交，或(ii)一种DNA序列，其编码携带有本发明的至少一种特定突变的II型GTP环化水解酶，但是因为遗传密码的简并性其不能杂交，但与能在标准条件下与本发明的特定经修饰的II型GTP环化水解酶的DNA序列中的任何一种杂交的DNA序列编码具有完全相同氨基酸序列的多肽，或(iii)一种DNA序列，其是上述DNA序列的片段，并保持有该片段来源的多肽的活性。
用于杂交的“标准条件”在本发明的上下文中表示本领域技术人员通常用来探测特定杂交信号的条件，其被描述于例如Sambrook et al.，″Molecular Cloning″，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press1989，New York中，优选地，本领域技术人员熟悉的所谓严谨杂交和非严谨洗涤条件或者更优选地所谓严谨杂交和严谨洗涤条件，其被描述于例如Sambrook et al.(s.a.)中。严谨杂交条件的一个具体例子是在42℃于包含50％甲酰胺、5 x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5 x Denhardt′s溶液、10％硫酸右旋糖苷和20μg/ml变性剪切鲑鱼静DNA的溶液中进行过夜温育，接着在0.1 x SSC中于大约65℃下洗杂交支持物。
此外，本发明的一个目的是提供一种DNA序列，其可通过基于特别描述的本发明的DNA序列设计的PCR引物，通过所谓的聚合酶链式反应(“PCR”)获得。应当理解，由此获得的DNA序列编码下述II型GTP环化水解酶，所述酶具有与对其进行设计的酶至少相同的突变，并且显示出相当的活性。
本文所述的本发明的多种实施方式可交叉组合。
图1通过GCG程序包的PILEUP程序，对使用标准数据库如SWISS-PROT和TrEMBL通过BLASTN程序发现的92条II型GTP环化水解酶计算的多条序列比对(Candida guilliermondii、Ashbya gossypii、Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa、Schizosaccharomycespombe、Archaeoglobus fulgidus、Streptomyces coelicolor、Helicobacterpylori J99、Helicobacter pylori、Pyrococcus furiosus、Thermotogamaritima、Chlamydia muridarum、Chlamydia trachomatis、Chlamydiacaviae GPIC、Arabidopsis thaliana、Lycopersicum esculentum、Oryzasativa、Alcaligenes eutrophus、Neisseria meningitidis (血清组A)、Neisseria meningitidis(血清组B，两种II型GTP环化水解酶)、Pseudomonas putida(两种II型GTP环化水解酶)、Pseudomonas syringae(两种II型GTP环化水解酶)、Actinobacillus actinomycetemcomitans(Haemophilus actinomycetemcomitans)、Haemophilus influenzae、Pasteurella multocida、Escherichia coli、Escherichia coli O6、Salmonellatyphimurium、Yersinia pestis、Buchnera aphidicola (subsp.Acyrthosiphonpisum) (Acyrthosiphor pisum共生细菌)、Buchnera aphidicola(subsp.Schizaphis graminum)、Wigglesworthia glossinidia brevipalpis、Buchneraaphidicola (subsp.Baizongia pistaciae)、Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosis、Corynebacterium efficiens、Corynebacteriumglutamicum、Corynebacterium ammoniagenes(Brevibacteriumammoniagenes)、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidid、Actinobacillus pleuropneuumoniae、Lactococcus lactis(Streptococcuslactis)、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniae、Clostridiumacetobutylicum、Fusobacterium nucleatum、Anabaena spec.、Synechocystisspec.、Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus)、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillushalodurans、Clostridium Perfringens、Clostridium tetani、Chlorobiumtepidum、Aquifex aeolicus、Leptospira interrogans、Deinococcusradiodurans、Bacteroides thetaiotaomicron、Caulobacter crescentus、Coxiella burnetii、Rhizobium etli、Lactobacillus plantarum、Pseudomonasglumae、Streptomyces avermitilis、Photobacterium phosphoreum、Azospirillum brasilense、Agrobacterium tumefaciens、Rhizobium meliloti(Sinorhizobium meliloti)、Brucella melitensis、Brucella suis、Rhizobiumloti(Mesorhizobium loti)、Nitrosomonas europaea、Ralstoniasolanacearum(Pseudomonas solanacearum)、Xanthomonas axonopodis、Xanthomonas campestris、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibriocholerae、Vibrio fischeri、Shewanella oneidensis、Photobacteriumphosphoreum、Photobacterium leiognathi、Pseudomonas aeruginosa、Dehalospirillum muhivorans、Xylella fastidiosa)。编号方式涉及所进行的比对。一些氨基酸序列编码仅具有II型GTP环化水解酶活性的酶，例如，来自Ashbya gossypii、Streptomyces coelicolor、Helicobacter pyloriJ99、Heliobacter pylori、Arabidopsis thaliana、Alcaligenes eutrophus、Neisseria meningitidis(血清组A)、Neisseria meningitidis(血清组B)、Pseudomonas putida、Pseudomonas syringae、Actinobacillusactinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans)、Haemophilus influenzae、Pasteurella multocida、Escherichia coli、Escherichia coli O6、Salmonella typhimurium、Yersinia pestis、Buchneraaphidicola(subsp.Acyrthosiphon pisum)(Acyrthosiphon pisum共生细菌)、Buchnera aphidicola(subsp.Schizaphis graminum)、Wigglesworthiaglossinidia brevipalpis、Buchnera aphidicola(subsp.Baizongia pistaciae)、Pseudomonas glumae、Streptomyces avermitilis或Photobacteriumphosphoreum的酶。其它酶，例如来自B.subtilis的RibA酶除此之外还含有具有DHBP合酶活性的结构域。来自B.subtilis的RibA的氨基酸序列被下划线示出。与发现对比活性具有正面影响的氨基酸残基(261、270、276、279、308、347位氨基酸残基)以及对来自B.subtilis的RibA的蛋白酶敏感性具有正面影响的氨基酸残基(196)同源或等价的、并在下述实施例之一被讨论的位置以加粗字母表示。用于这些位置的编号按照B.subtilis野生型氨基酸序列来进行。图的开始是所用序列的名称、数据库编号以及括号中的序列来源生物。
下述非限制性的实施例将进一步阐述本发明。
实施例1测量II型GTP环化水解酶活性以及测定比活性用于测量II型GTP环化水解酶活性的酶促试验改良自Ritz et al.(J.Biol.Chem.276，22273-22277，2001)。最终试验缓冲液含有50mMTris/HCl，pH 8.5，10mM MgCl2、7.5mM巯基乙醇、2.5mM GTP和0.1mg/ml牛血清清蛋白。纯化(见实施例5)之后，将酶保持于含有50mMTris/HCl，pH8.5，10mM MgCl2、7.5 mM巯基乙醇和10％甘油的缓冲液中。将底物加入酶，测量在310nm处的吸光度，此时GTP不显示吸光度，接着进行超过20-30分钟。最终反应混和物含有0.02至0.04mg/ml之间的、来自B.subtilis的II型GTP环化水解酶或表1或2所示的突变体之一。针对DRAPP的吸光系数6.28[mM-1cm-1]被用于计算活性。蛋白测定使用来自Bio-Rad(Cat.No.500-0002，Bio-Rad Laboratories AG，Nenzlingerweg 2，CH-4153 Reinach，Switzerland)的Protein Assay来进行。
根据上文给出的“比活性”的定义，一个单位是在上文描述的条件下每分钟催化1μmol DRAPP形成的RibA的量。比活性是在上文描述的条件下每分钟通过1mg RibA形成的DRAPP的量。使用上述定义，His6-标签化的B.subtilis RibA蛋白的II型GTP环化水解酶比活性是0.115U/mg。
实施例2测试酶试验的性能最优的试验应满足多种要求，例如随酶浓度的线性和随时间的线性。使用实施例l所述的条件和22μg酶，在310nm处吸光度的增加进行25分钟。为测试在何种范围内试验对酶浓度是线性的，测试该试验对逐渐增加的酶浓度(0-40μg His6-标签化的RibA)的相关性。该试验被证明在25分钟内和0至40μg His6-标签化的来自B.subtilis的RibA的情况下是线性的。
这之后，测试His6-标签化的来自B.subtilis的RibA的II型GTP环化水解酶活性对GTP浓度的相关性。使用如实施例1所述的条件。但是，GTP浓度在0.05至0.25mM终浓度之间变动。数据显示了针对GTP的Km值为0.07mM，以及对His6-标签化的来自B.subtilis的RibA的II型GTP环化水解酶活性而言37℃的比活性为大约115mU/mg蛋白。本实施例的实验显示，II型GTP环化水解酶试验实际上随时间和酶(II型GTP环化水解酶)浓度成线性，在给定的条件下，对Bacillus subtilis的II型GTP环化水解酶而言，2.5mM的GTP浓度可能是允许对酶的比活性进行可靠测量而言最优的。
实施例3 从Bacillus subtilis分离基因组DNA在Veal Infusion Broth(Becton Dickinson，Sparks，MD 21152，USA)中于30℃对B.subtilis进行过夜培养。将1.5ml培养物转移进1.5ml小管并离心。将细胞沉淀重新悬浮于0.5ml悬浮缓冲液(50mM Tris/HCl，pH7.5，50mM Na2EDTA，15％蔗糖和1mg/ml新鲜加入的裂解酶)中。室温下温育10分钟后，加入1μl二乙氧基二甲酸酯。然后加入10μl的10％SDS溶液，颠倒小管数次。将小管在70℃温育5分钟，以释放细菌DNA。加入50μl 5M乙酸钾，在冰上冷却小管，在其上放置45分钟。之后在4℃对样品进行30分钟的离心。将上清液转移进新的1.5ml小管，在室温下向其中装入乙醇(装至1.5ml)。5分钟离心之后，弃去上清液，干燥DNA沉淀。然后用70％和96％的乙醇洗DNA，将其溶解于10mM Tris/HCl，pH7.5，1mM EDTA和10μg/ml RNase A中。
实施例4 构建表达载体用于表达ribA及其突变体，ribA编码来自B.substilis的II型GTP环化水解酶和DHBP合酶通过PCR来克隆B.subtilis的ribA基因(SEQ ID NO1)，其编码II型GTP环化水解酶和DHBP合酶。根据实施例3分离B.subtilis的基因组DNA。将100ng该DNA或编码ribA基因的经突变形式的模板用于PCR，其中使用引物RibA 1S(SEQ ID NO27)和RibA lAS(SEQ IDNO28)。使用下述PCR条件每种引物2μM，每种核苷酸0.2mM，2.5U校正(proof-reading)DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101CB Amsterdam Zuidoost，The Netherlands)以及100ng基因组DNA，它们处于与DNA聚合酶一起提供的合适缓冲液中。
温度调控如下所示步骤13分钟，95℃步骤230秒，95℃步骤330秒，52℃步骤460秒，72℃
步骤2至4重复30次。
1.3 kb的PCR产物用作为PCR2的模板，其中，用RibA 2S(SEQ IDNO2)替换引物RibA 1S。该反应的PCR产物(SEQ ID NO3)编码B.subtilis ribA的N末端His6标签化版本(SEQ ID NO4)，通过琼脂糖电泳凝胶对其进行分离，从凝胶上洗脱，用EcoRI和BamHI消化，连接进用EcoRI和BamHI消化过的载体pQE60(Qiagen AG，Hilden，Germany)。该质粒被称为pQE60ribANhis。
实施例5分析野生型酶和突变体酶使用上文所述的方法和技术人员已知的方法来产生经突变的酶。被进一步分析的来自B.subtilis的RibA突变体展示于表1中。按照实施例4中所述，将所有突变体基因克隆进pQE60载体。所有最终的构建体都含有N末端的His6标签。
表1较之B.subtilis的野生型RibA蛋白的氨基酸交换定义的突变体(数字代表SEQ ID NO2中相应的氨基酸位置)。
从实施例4的质粒来表达RibA突变体酶，按照″The QiaExpressionist″，Qiagen，Hilden，Germany，March 2001，edition 5所述进行纯化。按照实施例1和实施例2所述对经纯化的酶(RibA突变体)的酶性能加以分析。表2比较了RibA突变体(见表1)的II型GTP环化水解酶比活性与B.subtilis的野生型RibA的II型GTP环化水解酶比活性。按照实施例4所述，使用RibA的N末端His6标签化的酶版本来测量活性。数字代表SEQ ID NO2中的相应的氨基酸位置。
表2比较经突变的和野生型(WT)B.subtilis RibA(全部都是N末端His6标签化的)的II型GTP环化水解酶比活性
括号中的氨基酸替换最可能不影响突变体的II型GTP环化水解酶活性。氨基酸交换Y196C降低RibA的蛋白酶敏感性。
实施例6 构建过量表达RibA突变体的重组B.subtilis菌株，所述突变体显示出更高的II型GTP环化水解酶比活性在下述实施例中，首先将经突变的ribA多核苷酸序列RibA Y196C，A276T，A282T(PCR III)，RibA Y196C，A276T，Q279R，A282T，K308R，M347I(构建体C)和RibA Y196C，A276T，Q279R，A282T，K308R，F325Y，M347I(构建体E)引入到含有强组成型启动子PvegI的载体中，然后在E.coli中进行进一步操作。用多核苷酸序列和侧翼载体序列对天然感受态B.subtilis微生物的转化得到过量表达经突变ribA的B.subtilis菌株。用标准重组DNA技术来构建多核苷酸序列和B.subtilis菌株。见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual(2ndEd.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)和Harwood and Cutting，MolecularBiology Methods for Bacillus，John Wiley and Sons(1990)。
为扩增经突变的ribA，使用来自含有突变体PCRIII、构建体C或构建体E的DNA，以及RibANde+l(SEQ ID NO30)and RibA4AS(SEQ IDNO31)作为引物，通过PCR来扩增含有整条ribA编码序列的1.2kb的DNA片段。
用于PCR反应的反应条件由下述30个循环构成95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101 CB Amsterdam Zuidoost，TheNetherlands)使得PCR产生的错误最小化。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化PCR产物，使用NdeI和BamHI进行双消化。将经过消化的PCR产物克隆进pXI16载体(Huembelin et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.22，1-7，1999)，其包括合适的限制性位点，适合用于克隆来自B.subtilis的强组成型PvegI启动子下游紧接着的多核苷酸序列。pXI16载体还含有来自B.thuringiensis的cryT转录终止子，用于通过双交换事件同源重组进B.subtilis基因组的sacB侧翼序列，以及红霉素抗性标记。通过DNA测序来验证经突变的ribA含有的每种质粒。
用ApaI消化每种质粒，除去来自PvegI启动子的空白区域，重新连接，再用FspI进行消化，转入天然感受态B.subtilis 1012细胞。在含有终浓度为2μg/ml红霉素的TBAB平板(Tryptose Blood Agar Base，BectonDickinson，Sparks，MD 21152，USA)上选择转化子。DNA测序确证了这些菌株中的经突变ribA多核苷酸序列是正确的。根据实施例7来测试核黄素的的过量生产。
通过一般化的转导，将PvegI启动子驱动的经突变ribA多核苷酸序列引入过量生产核黄素的B.subtilis菌株RB50∷(pRF69)n∷(pRF93)m，其在Perkins et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.228-18(1999)中已被描述。根据Harwood and Cutting，Molecular Biology Methods for Bacillus，John Wiley andSons(1990)来使用细菌噬菌体PBS1的标准技术。在含有终浓度为2μg/ml红霉素的TBAB平板上选择转导产物。通过PCR分析和DNA测序来检查转化子，以验证经突变ribA多核苷酸序列的正确插入。
实施例7使用具有提高的比活性的II型GTP环化水解酶改进的核黄素的生产为测试突变影响II型GTP环化水解酶比活性的体内效果，将Bacillussubtilis II型环化水解酶(RibA)突变体PCR III、构建体C或构建体E引入到过量生产核黄素的B.subtilis菌株RB50∷(pRF69)n∷(pRF93)m(Perkinset al，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.22，8-18，1999)中，例如，sacB基因座。在仅因为存在或不存在ribA基因的突变而有所不同的两种B.subtilis重组菌株中直接比较核黄素的生产。按照实施例8所述来培养Bacillus菌株。
实施例8用于评估核黄素生产的培养条件在对过量生产核黄素的B.subtilis菌株RB50∷(pRF69)n∷(pRF93)m的补料分批培养中测试核黄素的生产，其中，PvegI启动子驱动的II型环化水解酶突变体PCR III、构建体C或构建体E整合进sacB基因座(见实施例6)。菌株发酵按照EP 405370来进行。
实施例9用于测定核黄素的分析方法为测定核黄素，可以使用下述分析方法(Bretzel et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.22，19-26，1999)。
色谱系统是装备有二元泵、柱热稳定仪和冷却的自动上样仪的Hewlett-Packard 1100系统。二极管阵列探测器和荧光探测器串联使用。记录两种信号，280nm处的UV和激发446nm、发射520nm处的荧光痕迹。
使用带保护柱(guard cartridge)的不锈钢Supelcosil LC-8-DB柱(150x 4.6mm，3μm颗粒大小)。移动相为100mM乙酸(A)和甲醇(B)。使用根据下述安排的梯度洗脱
时间[分钟]％A ％B0 9826 982155050255050柱温设定为20℃，流速为1.0ml/分钟。运行时间为25分钟。
不进行进一步处理，就对发酵样品进行稀释、过滤和分析。通过与外部标准物比较来定量核黄素。基于280nm处的UV信号来进行计算。从Fluka(9471 Buchs，Switzerland)购买的核黄素被用作为标准物质(纯度≥99.0％)。
实施例10 在与Bacillus subtilis II型GTP环化水解酶同源的II型GTP环化水解酶中鉴定对应的残基采用下述参数缺口产生惩罚8，缺口延伸惩罚2以及blosum62.cmp矩阵(缺省参数)，用程序“PILEUP”(GCG Wisconsin Package，version10.2，Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752，USA)来计算使用标准数据库(例如SWISS-PROT和TrEMBL，见图1)通过BLASTN程序发现的92条不同II型GTP环化水解酶的多条氨基酸序列比对。
在本发明上下文中的同源II型GTP环化水解酶可展示出与图1所示的II型GTP环化水解酶氨基酸序列中的任意一条的相似性。图1提供了对92条II型GTP环化水解酶氨基酸序列进行的多序列比对的例子，其中来自Bacillus subtilis的II型GTP环化水解酶被下划线示出。图1作为例子提供，并不表示其是所有已知II型GTP环化水解酶的全集。同源残基，即位于氨基酸序列比对中相同位置(即，位于例如图1中的同一列)上的不同II型GTP环化水解酶的残基被预计为相似地定位于每种蛋白的3D结构中，在每种蛋白中满足结构和功能方面的差不多的功能。实施例中讨论的、与来自B.subtilis的II型GTP环化水解酶的氨基酸残基同源的氨基酸残基在图1中以加粗表示，B.subtilis的氨基酸序列中的相应位置被添加到比对的每列之上。
92种不同生物中对应于特定氨基酸位置(即与已发现对Bacillussubtilis的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列(SEQ ID NO2)比活性具有正面影响的氨基酸残基(261、270、276、279、308、347位氨基酸残基)同源/等价的位置)的氨基酸残基被概括于表4中，其中，左列的编码代表生物(根据图1)，由所用的序列名称，数据库编号和括号中的序列来源生物开始(1) gch2_bacsuSWISS-PROTgch2_bacsu(Bacillus subtilis)(2) gch2_cangugeneseqpaay69776(Candida guilliermondii)(3) gch2_ashgoTrEMBLCAA02912(Ashbya gossypii(Eremotheciumgosypii))(4) gch2_yeastSWISS-PROTgch2_yeast(Saccharomyces cerevisiae)(5) gch2_neucrTrEMBLQ871B3(Neurospora crassa)(6) gch2_schpoTrEMBLQ9P7M9(Schizosaccharomyces pombe)(7) gch2_arcfuSWISS-PROTgch2_arcfu(Archaeoglobus fulgidus)(8) gch2_strcoSWISS-PROTgch2_strco(Streptomyces coelicolor)(9) gch2_helpjSWISS-PROTgch2_helpj(Helicobacter pylori J99)(10)gch2_helpySWISS-PROTgch2_helpy(Heliobacter pylori)(11)gch2_pyrfuTrEMBLQ8U4L7(Pyrococcus furiosus)(12)gch2_themaSWISS-PROTgch2_thema(Thermotoga maritima)(13)gch2_chlmuSWISS-PROTgch2_chlmu(Chlamydia muridarum)(14)gch2_chltrSWISS-PROTgch2_chltr(Chlamydia trachomatis)(15)gch2_chlcaTrEMBLAAP0563 5(Chlamydia caviae GPIC)(16)gch2_chlpnSWISS-PROTgch2_chlpn(Chlamydia pneumoniae)(17)gch2_arathSWIS S-PROTgch2_arath(Arabidopsis thaliana)(18)gch2_lycesTrEMBLCAC09119(Lycopersicum esculentum)(19)gch2_orysaTrEMBLAAO72560(Oryza sativum)(20)gch2_alceuTrEMBLQ9F184(Alcaligenes eutrophus)(21)gch2_neimaSWISS-PROTgch2_neima(Neisseria meningitidis(血清组A))(22) gch2_neimbSWISS-PROTgch2_neimb(Neisseria meningitidis(血清组B))(23) gch2_psepkSWISS-PROTgch2_psepk(Pseudomonas putida(菌株KT2440))(24) gch2_psesmSWISS-PROTgch2_psesm(Pseudomonas syringae(pv.tomato))(25) gch2_actacTrEMBLQ9JRR0(Actinobacillus actinomycetemcomitans(Haemophilus actinomycetemcomitans))(26) gch2_haeinSWISS-PROTgch2_pasmu gch2_haein(Haemophilusinfluenzae)(27)gch2_pasmuSWISS-PROT(Pasteurella multocida)(28) gch2_ecO6TrEMBLQ8FHU5(Escherichia coli O6)(29) gch2_ecoliSWISS-PROTgch2_ecoli(Escherichia coli)(30) gch2_saltyTrEMBLQ8XFY7(Salmonella tYPhimurium)(31) gch2_yerpeTrEMBLQ8ZEF0(Yersinia pestis)(32) gch2_bucaiSWISS-PROTgch2_bucai(Buchnera aphidicola(subsp.Acyrthosiphon pisum)(Acyrthosiphon pisum共生细菌))(33) gch2_bucapSWISS-PROTgch2_bucap(Buchnera aphidicola(subsp.Schizaphis graminum))(34) gch2_wigbrSWISS-PROTgch2_wigbr(Wigglesworthia glossinidiabrevipalpis)(35) gch2_bucbpSWISS-PROTgch2_wigbr(Buchhera aphidicola(subsp.Baizongia pistaciae))(36) gch2_mycleTrEMBLQ9CCP4(Mycobacterium leprae)(37) gch2_myctuSWISS-PROTgch2_myctu(Mycobacterium tuberculosis)(38) gch2_corefTrEMBLQ8FT57(Corynebacterium efficiens)(39) gch2_corglGENESEQPAAB79913(Corynebacterium glutamicum)(40) gch2_coramSWISS-PROTgch2_coram(Corynebacteriumammoniagenes(Brevibacterium ammoniagenes))(41) gch2_staauTrEMBLQ8NW14(Staphylococcus aureus(菌株MW2))(42) gch2_staepGENESEQPABP40248(Staphylococcus epidermidis)(43) gch2_actplSWISS-PROTgch2_actpl(Actinobacillus pleuropneumoniae)(44) gch2_laclaTrEMBLQ9CGU7(Lactococcus lactis(subsp.lactis)(Streptocoecus lactis))(45) gch2_stcagTrEMBLQ8E658(Streptococcus agalactiae(血清型III))(46) gch2_stcpnTrEMBLQ8DRF1(Streptococcus pneumoniae(菌株ATCC BAA-255/R6))(47) gch2_cloacTrEMBLQ97LG9(Clostridium acetobutylicum)(48) gch2_fusnuTrEMBLQ8RIR1(Fusobacterium nucleatum(subsp.nucleatum))(49) gch2_anaspTrEMBLQ8RIR1(Anabaena sp.(菌株PCC7120))(50) gch2_syny3SWISS-PROTgch2_syny3(Synechocystis sp.(菌株PCC6803))(51) gch2_synelTrEMBLQ8DI64 Synechococcus elongatus(Thermosynechococcus elongatus)(52) gch2_bacamSWISS-PROTgch2_bacam(Bacillus amyloliquefaciens)(53) gch2_bacceTrEMBLAAP11030(Bacillus cereus ATCC 14579)(54) gch2_bachaTrEMBLQ9KCL5(Bacillus halodurans)(55) gch2_clopeTrEMBLQ8XMX0(Clostridium perfringens)(56) gch2_cloteTrEMBLQ897Q8(Clostridium tetani)(57) gch2_chlteTrEMBLQ8KC35(Chlorobium tepidum)(58) gch2_aquaeSWISS-PROTgch2_aquae(Aquifex aeolicus)(59) gch2_lepinTrEMBLQ8F701(Leptospira interrogans)(60) gch2_deiraTrEMBLQ9RXZ9(Deinococcus radiodurans)(61) gch2_bacthTrEMBLQ8A528(Bacteroides thetaiotaomicron)(62) gch2_caucrTrEMBLQ9A9S5(Caulobacter crescentus)(63) gch2_coxbuTrEMBLAAO90191(CoxieUa burnetii RSA 493)
(64) gch2_rhietTrEMBLQ8KL38(Rhizobium etli)(65) gch2_lacplTrEMBLQ88X17(Lactobacillus plantarum)(66) gch2_pseglTrEMBLQ8RS38(Pseudomonas glumae)(67) gch2_StravTrEMBLBAC71833(Streptomyces avermitilis)(68) gch2_phopoSWISS-PROTgch2_phopo(Photobacterium phosphoreum)(69) gch2_azobrSWISS-PROTgch2_azobr(Azospirillum brasilense)(70) gch2_agrtuTrEMBLQ8UHC9(Agrobacterium tumefaciens(菌株C58/ATCC 33970))(71) gch2_rhimeTrEMBLQ92RH2(Rhizobium meliloti(Sinorhizobiummeliloti))(72) gch2_brumeTrEMBLQ8YFL5(Brucella melitensis)(73) gch2_brusuTrEMBLQ8G298(Brucella suis)(74) gch2_rhiloTrEMBLQ985Z3(Rhizobium 1oti(Mesorhizobium loti))(75) gch2_brajaTrEMBLQ89RZ7(Bradyrhizobium japonicum)(76) gch2_niteuTrEMBLCAD86468(Nitrosomonas europaea ATCC 19718)(77) gch2_ralsoTrEMBLQ8Y1H7(Ralstonia solanacearum(Pseudomonassolanacearum))(78) gch2_neimeTrEMBLQ9JZ77(Neisseria meningitidis(血清组B，发现了第二种酶))(79) gch2_xanaxTrEMBLQ8PPD7(Xanthomonas axonopodis(pv.citri))(80) gch2_xancaTrEMBLQ8PCM8(Xanthomonas campestris(pV.campestris))(81) gch2_vibpaTrEMBLQ87RU5(Vibrio parahaemolyticus)(82) gch2_vibvuTrEMBLQ8DF98(Vibrio Vulnificus)(83) gch2_vibchTrEMBLQ9KPU3(Vibrio cholerae)(84) gch2_vibfiTrEMBLQ8G9G5(Vibrio fischeri)(85) gch2_sheonTrEMBLQ8EBP2(Shewanella oneidensis)(86) gch2_phophTrEMBLQ8G9H7(Photobacterium phosphoreum)(87) ribb_pholeTrEMBLQ93E93(Photobacterium leiognathi)
(88) gch2_psepuTrEMBLQ88GB1(Pseudomonas putida(菌株KT2440，发现了第二种酶))(89) gch2_psesyTrEMBLQ882G0(Pseudomonas syringae(pv.Tomato，发现了第二种酶))(90) gch2_pseaeTrEMBLQ9HWX4(Pseudomonas aeruginosa)(91) rib_dehmuSWISS-PROTribb_dehmu(Dehalospirillum multivorans)(92) gch2_xylfaTrEMBLQ87D69(Xylella fastidiosa(菌株Temeculal/ATCC 700964))表4对应于SEQ ID NO2的B.subtili RibA的V261，G270，A276，Q279，K308和M347位置的位置/氨基酸残基。左列数字代表不同生物(如上所述)。

表4所示的例子被用于阐述。可针对与图1或表4所示的序列中任意一条同源的所有其它II型GTP环化水解酶确定对应的残基。
序列表<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司<120>改进的酶<130>22257<160> 43<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1197<212>DNA<213>Bacillus subtilis<400>1atgtttcatc cgatagaaga agcactggac gctttaaaaa aaggcgaagt catcatcgtt 60gtagatgatg aagacagaga aaatgaagga gactttgtgg ctcttgccga gcatgcaacg 120ccggaagtca ttaactttat ggcgacacat gggagaggac tgatctgcac gccgctcagt 180gaggaaatcg cagacaggct tgatcttcac cctatggttg agcataatac agactctcac 240cacactgcat ttaccgtaag catagaccat cgtgaaacga agacaggtat cagcgctcaa 300gaaagatctt ttaccgttca agcattgctg gacagcaaat ccgtgccatc tgattttcag 360cgtccggggc acatttttcc actgattgcg aaaaaaggag gtgtcctgaa aagagcgggc 420catacagaag ctgctgttga tcttgctgaa gcttgtggat ctccaggagc cggcgtcatt 480tgtgaaatta tgaatgaaga cggaacgatg gcgagagtgc ctgagctcat tgaaattgcg 540aaaaagcatc aattaaaaat aatcaccatt aaggatttga ttcaataccg ttacaatctg 600acaacacttg tcgagcgtga agttgacatt acgctgccta ctgattttgg gacatttaag 660gtttatggat acacaaatga ggtagatgga aaagagcatg tcgcatttgt gatgggagat 720gtgccgttcg gagaagaacc ggtattggtc cgggtgcatt cagaatgtct cacaggtgac 780gtgtttggct ctcatcgctg tgattgcgga ccgcagctgc acgccgcgct gaaccaaatt 840gccgcagaag gccgtggagt gctcctgtac ttgcgccaag aaggacgagg catcggttta 900atcaataaat taaaagctta taagcttcag gaacaaggct atgacaccgt agaagccaat 960gaggcgcttg gattcttgcc ggatcttcgc aactatggca tcggagcaca aattttacgc1020gacctcggtg tccggaatat gaagcttttg acgaataatc cgcgaaaaat cgcaggcctt1080gaaggctacg gactcagtat ttcagaaaga gtgccgcttc aaatggaggc gaaagaacac1140aataaaaaat atttgcaaac caaaatgaac aagctaggtc atttacttca tttctaa 1197
<210>2<211>398<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>2Met Phe His Pro Ile Glu Glu Ala Leu Asp Ala Leu Lys Lys Gly Glu1 5 10 15Val Ile Ile Val Val Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Phe20 25 30Val Ala Leu Ala Glu His Ala Thr Pro Glu Val Ile Asn Phe Met Ala35 40 45Thr His Gly Arg Gly Leu Ile Cys Thr Pro Leu Ser Glu Glu Ile Ala50 55 60Asp Arg Leu Asp Leu His Pro Met Val Glu His Asn Thr Asp Ser His65 70 75 80His Thr Ala Phe Thr Val Ser Ile Asp His Arg Glu Thr Lys Thr Gly85 90 95Ile Ser Ala Gln Glu Arg Ser Phe Thr Val Gln Ala Leu Leu Asp Ser100 105 110Lys Ser Val Pro Ser Asp Phe Gln Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu115 120 125Ile Ala Lys Lys Gly Gly Val Leu Lys Arg Ala Gly His Thr Glu Ala130 135 140Ala Val Asp Leu Ala Glu Ala Cys Gly Ser Pro Gly Ala Gly Val Ile145 150 155 160Cys Glu Ile Met Asn Glu Asp Gly Thr Met Ala Arg Val Pro Glu Leu165 170 175Ile Glu Ile Ala Lys Lys His Gln Leu Lys Met Ile Thr Ile Lys Asp180 185 190Leu Ile Gln Tyr Arg Tyr Asn Leu Thr Thr Leu Val Glu Arg Glu Val195 200 205
Asp Ile Thr Leu Pro Thr Asp Phe Gly Thr Phe Lys Val Tyr Gly Tyr210 215 220Thr Asn Glu Val Asp Gly Lys Glu His Val Ala Phe Val Met Gly Asp225 230 235 240Val Pro Phe Gly Glu Glu Pro Val Leu Val Arg Val His Ser Glu Cys245 250 255Leu Thr Gly Asp Val Phe Gly Ser His Arg Cys Asp Cys Gly Pro Gln260 265 270Leu His Ala Ala Leu Asn Gln Ile Ala Ala Glu Gly Arg Gly Val Leu275 280 285Leu Tyr Leu Arg Gin Glu Gly Arg Gly Ile Gly Leu Ile Asn Lys Leu290 295 300Lys Ala Tyr Lys Leu Gln Glu Gln Gly Tyr Asp Thr Val Glu Ala Asn305 310 315 320Glu Ala Leu Gly Phe Leu Pro Asp Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Gly Ala325 330 335Gln Ile Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Asn Met Lys Leu Leu Thr Asn340 345 350Asn Pro Arg Lys Ile Ala Gly Leu Glu Gly Tyr Gly Leu Ser Ile Ser355 360 365Glu Arg Val Pro Leu Gln Met Glu Ala Lys Glu His Asn Lys Lys Tyr370 375 380Leu Gln Thr Lys Met Asn Lys Leu Gly His Leu Leu His Phe385 390 395<210>3<211>1239<212>DNA<213>Bacillus subtilis<400>3atgagaggat ctcaccatca ccatcaccat gggatcgatc atatgtttca tccgatagaa 60gaagcactgg acgctttaaa aaaaggcgaa gtcatcatcg ttgtagatga tgaagacaga 120gaaaatgaag gagactttgt ggctcttgcc gagcatgcaa cgccggaagt cattaacttt 180
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Leu Gly Phe Leu Pro Asp Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Gly Ala Gln Ile340 345 350Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Asn Met Lys Leu Leu Thr Asn Asn Pro355 360 365Arg Lys Ile Ala Gly Leu Glu Gly Tyr Gly Leu Ser Ile Ser Glu Arg370 375 380Val Pro Leu Gln Met Glu Ala Lys Glu His Asn Lys Lys Tyr Leu Gln385 390 395 400Thr Lys Met Asn Lys Leu Gly His Leu Leu His Phe405 410<210>27<211>61<212>DNA<213>人工<220>
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权利要求
1.一种经修饰的II型GTP环化水解酶，其中(i)所述经修饰的酶较之对应的未经修饰的酶的比活性增加，以及(ii)所述经修饰的酶的氨基酸序列包含一处或多处突变，所述突变包括在对应于SEQ ID NO2的261、270、276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处突变。
2.如权利要求1所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，其中，所述经修饰的II型GTP环化水解酶展示出比对应的未经修饰的II型GTP环化水解酶高至少大约10％的比活性。
3.如权利要求1或2所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，其中所述一处或多处突变是一处或多处取代。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，其中所述对应的未经修饰的II型GTP环化水解酶的氨基酸序列选自由图1所列出的序列，特别是来自Ashbya，Saccharomyces，Eremothecium，Candida，Neurospora，Schizosaccharomyces，Archeoglobus，Streptomyces，Helicobacter，Escherichia，Corynebacterium，Thermotoga，Arabidopsis，Lycopersicum，Oryza，Alcaligenes，Pseudomonas，Dinococcus，Lactobacillus，Photobacterium或Bacillus的。
5.如权利要求4所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，其中所述未经修饰的II型GTP环化水解酶的序列选自由SEQ ID NOs2、33、35、37、39、41和43构成的组。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，包含在对应于SEQ ID NO2的261位的氨基酸位置上的突变，优选地，是丙氨酸对缬氨酸的取代。
7.如权利要求1至5中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，包含在对应于SEQ ID NO2的270位的氨基酸位置上的突变，优选地，是丙氨酸或精氨酸对甘氨酸的取代。
8.如权利要求1至5中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，包含在对应于SEQ ID NO2的276位的氨基酸位置上的突变，优选地，是苏氨酸对丙氨酸的取代。
9.如权利要求1至5中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，包含在对应于SEQ ID NO2的279位的氨基酸位置上的突变，优选地，是精氨酸对谷氨酰胺的取代。
10.如权利要求1至5中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，包含在对应于SEQ ID NO2的308位的氨基酸位置上的突变，优选地，是精氨酸对赖氨酸的取代。
11.如权利要求1至5中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶，包含在对应于SEQ ID NO2的347位的氨基酸位置上的突变，优选地，是异亮氨酸对甲硫氨酸的取代。
12.一种多核苷酸，包含编码根据权利要求1至11中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶的核苷酸序列。
13.如权利要求12所述的多核苷酸序列，其中，所述编码经修饰的II型GTP环化水解酶的核苷酸序列选自由SEQ ID NOs6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26构成的组。
14.如权利要求12或13所述的多核苷酸，其与启动子、核糖体结合位点和终止子序列可操作地连接，所述多核苷酸是转录功能性的。
15.一种载体或质粒，其包含如权利要求12至14中任意一项所述的多核苷酸。
16.如权利要求15所述的载体或质粒，其还包含至少一种标记基因。
17.一种宿主细胞，其包含如权利要求12至14中任意一项所述的多核苷酸。
18.如权利要求17所述的宿主细胞，其选自由细菌细胞、真菌细胞、动物细胞和植物细胞构成的组。
19.如权利要求18所述的宿主细胞，其选自由Bacillus subtilis，Candidaflareri，Eremothecium ashbyii，Ashbya gossypii和Saccharomycescerevisiae构成的组。
20.一种生产核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其衍生物的方法，所述方法包含(a)在合适的培养基中培养根据权利要求17至19中任意一项所述的宿主细胞；以及(b)可选地，从培养基中分离核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其衍生物。
21.一种方法，用于生产如权利要求1至11中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶的方法，所述方法包括(a)在合适的培养基中培养根据权利要求17至19中任意一项所述的宿主细胞的群体；以及(b)可选地，从细胞或从培养基中回收所述经修饰的II型GTP环化水解酶。
22.一种方法，用于生产具有提高的比活性的II型GTP环化水解酶，所述方法包括如下步骤(a)提供编码II型GTP环化水解酶的多核苷酸；(b)将一处或多处突变引入所述多核苷酸序列，使得经突变的多核苷酸序列编码经修饰的II型GTP环化水解酶，所述酶较之第一种II型GTP环化水解酶具有更高的比活性并包含一处或多处突变，其中，所述一处或多处突变包括对应于SEQ ID NO2的261、270、276、279、308和/或347位的氨基酸位置上的1、2、3、4、5或6处突变；(c)可选地，将所述经突变的多核苷酸与启动子、核糖体结合位点和终止子可操作地相连，或将经突变的多核苷酸插入载体或质粒；(d)将所述多核苷酸、转录功能性多核苷酸或所述载体或质粒引入合适的宿主细胞；以及(e)在允许所述经修饰的II型GTP环化水解酶表达的条件下培养所述宿主细胞。
23.如权利要求1至11中任意一项所述的经修饰的II型GTP环化水解酶或如权利要求12至14中任意一项所述的多核苷酸的用途，用于提高核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其衍生物的生产。
24.一种方法，用于生产具有提高的比活性的II型GTP环化水解酶，所述方法包括如下步骤(a)提供编码第一种II型GTP环化水解酶的多核苷酸，所述酶具有希望被提高的比活性；(b)提供对于比活性有影响的位置；(c)确定用于替换(b)中确定的、野生型II型GTP环化水解酶的给定氨基酸的最佳氨基酸，以及，将一处或多处突变引入(a)多核苷酸序列中(b)确定的位置，使得经突变的多核苷酸序列编码新的II型GTP环化水解酶；(d)可选地，将所述经突变的多核苷酸插入载体或质粒；(d)将所述多核苷酸或所述载体或质粒引入合适的宿主细胞；以及(e)在允许所述经修饰的II型GTP环化水解酶表达的条件下培养所述宿主细胞。
全文摘要
本发明涉及经修饰的II型GTP环化水解酶及编码它们的多核苷酸，所述酶展示出增加的比活性。本发明还涉及包含这些多核苷酸的载体和含有此类载体的宿主细胞。本发明提供了用于生产所述经修饰的酶的方法和用于生产核黄素、核黄素前体、FMN、FAD或其衍生物的方法。
文档编号C12N15/55GK101014705SQ200580022895
公开日2007年8月8日 申请日期2005年7月7日 优先权日2004年7月7日
发明者斯比勒·埃伯特, 汉斯-彼得·霍曼, 马丁·莱玛恩, 奈杰尔·约翰·芒希亚, 马卡斯·维斯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司