专利名称：快速检测细小脲原体的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种性传播疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速检测细小脲原体荧光定量PCR(聚合酶链式反应)试剂盒，适用于细小脲原体的定性定量检测。
背景技术：
解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)是人类泌尿生殖道常见的共生微生物，在性传播疾病中解脲脲原体与非淋菌性尿道炎(NGU)、附睾炎有关；与前列腺炎、女性尿道症状、肾盂肾炎、盆腔炎有明显相关性或提示有病原学作用。NGU作为我国控制的8种性病之一，其发病率日益增高。解脲脲原体分为两个生物群(Biovar)和14个血清型。这两个生物群可从表型和遗传上进行鉴定。但越来越多的证据表明它可分为两个种，即Ureaplasma parvum(命名为微小脲原体，以前的B iovarl，包括血清型1，3，6，14)和Ureaplasma urealyticum(以前的Biovar 2，包括血清型2，4，5，7～13，保留原来的名称解脲脲原体)。在人类泌尿生殖道定殖或引起感染的绝大部分为第1群-细小脲原体(Ureaplasmaparvum，UP)。
近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen EffectDetermined by LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，16329-38)、病原体的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approachto the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with aFluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detectionand Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，831-10.)和定量检测(Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load bya TaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，391303-1310.；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-ThroughputReal-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37327-332.；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detection and Quantification of CMV DNA inUrine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitationof HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95111-119.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、支原体、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。
临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此焏待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测细小脲原体的荧光定量PCR试剂盒。
本发明采用以下技术方案一、PCR试剂盒该试剂盒包括a)DNA裂解液，b)荧光定量PCR反应液，c)UP标准阳性模板pU-UP，d)阴性质控标准品；荧光定量PCR反应液含有细小脲原体特异性引物对和荧光探针；细小脲原体(UP)正向引物为5′-CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA-3′，反向引物为5′-TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3′，
荧光探针序列为5′-TTGACCACCCTTACGAG-3′；荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记，并连接小型凹槽结合物-MGB基团(TaqMan MGB探针)，可以大大提高探针的退火温度(Tm值)，标准阳性模板pU-UP是含有细小脲原体高度保守基因-脲酶基因的111个碱基对的核苷酸片段构成的pUCm-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。
具体地说a)DNA裂解液DNA裂解液包含50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，体积分数为1％ Triton X-100，体积分数为1％ NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。
b)荧光定量PCR反应液荧光定量PCR反应液包含PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各0.8μl(10μmol/L)，荧光探针0.8μl(5μmol/L)，MgCl22.5μl(25mmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，HOTSTART Taq DNA聚合酶0.4μl(2.5U/μl)，无菌双蒸水10.3μl。荧光探针使用浓度为5μmol/L。
c)UP标准阳性模板pU-UPUP标准阳性模板pU-UP是含有细小脲原体高度保守基因ureE基因111个核苷酸片段构成的pUCm-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至109拷贝/μl，-20℃保存。贮存浓度为109拷贝/μl，使用前进行10倍梯度的系列稀释。
d)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水；本试剂盒的工作原理在本发明提供的快速定量检测细小脲原体荧光定量PCR试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，HOTSTART Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对细小脲原体的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
在本发明提供的检测细小脲原体荧光定量PCR试剂盒中，针对细小脲原体检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于细小脲原体定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测细小脲原体荧光定量PCR方法，并研制出检测细小脲原体荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速诊断细小脲原体的要求。
二、本发明的使用方法包括下列步骤a)对贮存浓度为109拷贝/μl标准阳性模板pU-UP进行10倍的系列稀释，制备阳性标准品，用紫外分光光度计测定A260对标准品定量；b)用DNA裂解液从待测标本中提取UP DNA；c)分别取b)步中的DNA和同样量的系列稀释的a)步中的两种阳性标准品加入到含Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；d)通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果1、定量准确；2、检测速度快，仅1小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；3、特异性好，灵敏度高；4、可鉴定区别检测细小脲原体和解脲脲原体；5、使用步骤简单，可重复性高。
本试剂盒可对细小脲原体进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。
具体实施例方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。
应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例1试剂盒组成与配制a、DNA提取试剂(裂解液)为自己配制，裂解液50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，体积分数为1％ Triton X-100，体积分数为1％ NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。
b、荧光PCR 10×Buffer组成500mM KCl、100mM Tris-HCl(PH9.0 25℃)、1.0％ Triton X-100；c、荧光定量PCR反应液PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各0.8μl(10μmol/L)，荧光探针0.8μl(5μmol/L)，MgCl22.5μl(25mmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，HOTSTART Taq DNA聚合酶0.4μl(2.5U/μl)，无菌双蒸水10.3μl。荧光探针使用浓度为5μmol/L。
d、标准阳性模板贮存液浓度为109拷贝/μl标准阳性模板pU-UP。
e、阴性质控标准品为无菌双蒸水实施实例2使用试剂盒快速检测细小脲原体a、在标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，转至1.5ml离心管中，10000g离心5min，再重复洗涤1次。沉淀直接加50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，10000g离心5min，取上清液2μl做PCR反应。
b、将阳性标准模板(试剂d)系列稀释为108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl。
c、分别取荧光定量PCR反应液(试剂c)各18μl，取第a)步所得UPDNA和第b)步稀释的UP阳性标准模板各2μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为95℃预变性400s；95℃ 10s，58℃ 40s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，同步检测波长为510nm(FAM)。
循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为UP标准阳性模板108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl的Ct值分别为12.02，15.14，17.93，22.38，26.19，29.78；阴性对照为0；反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。
从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2个小时就能完成，而传统的细胞培养法约需1周左右才能完成，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间，并且传统方法不能鉴定区别检测细小脲原体和解脲脲原体。
该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。
权利要求
1.一种快速检测细小脲原体的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于由DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板pU-UP、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有细小脲原体特异性引物对和荧光探针；正向引物为5′-CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA-3′，反向引物为5＇- TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3′；荧光探针序列为5′-TTGACCACCCTTACGAG-3′，荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记，并连接小型凹槽结合物-MGB基团，标准阳性模板pU-UP是含有细小脲原体高度保守基因-脲酶基因的111个碱基对的核苷酸片段构成的pUCm-T载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖；所述的PCR即聚合酶链式反应，所述的UP即细小脲原体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是荧光定量PCR反应液是由PCR10×buffer，10μmol/L的UP正向引物和反向引物，5μmol/L UP荧光探针，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs和无菌双蒸水组成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是UP标准阳性模板pU-UP包含的ureE基因的核苷酸序列为CATTGATGTTGCACAAGGAGAAAAAATTCCTCGTAAGGGTGGTCAAGGNATGATTAAATCAGAMTTATTTATTATTAATAAAGTTGATTTAGCTCCTTATGTTGGTGCTAA；NG或者A；MT或者C。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测细小脲原体的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种性传播疾病病原体基因检测技术，适用于细小脲原体定性定量检测。本发明由DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板pU－UP、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有细小脲原体特异性引物对和荧光探针。本发明特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可以对细小脲原体的全部4个血清型进行定性定量检测，可以替代传统的培养法，同时该试剂盒可以用于鉴别区分细小脲原体和解脲脲原体。
文档编号C12Q1/68GK1873024SQ20061001876
公开日2006年12月6日 申请日期2006年4月14日 优先权日2006年4月14日
发明者曹轩, 王业富 申请人:武汉大学