一种定量检测未获培养微生物au126的方法

专利名称：一种定量检测未获培养微生物au126的方法
技术领域：
本发明关于一种定量检测微生物的方法，具体地说，本发明关于一种定量检测未获培养微生物AU126的方法。
背景技术：
自然界中不超过1％的微生物可以通过实验室培养技术进行检测。通过微生物的16S rRNA基因，可以不使用培养技术，实现对包括未获培养微生物在内的所有微生物物种的检测。近年来，一种被命名为AU126的未获培养微生物经多个科研机构的研究，被判定为与牙周病的发生发展密切相关的微生物之一。
对未获培养的牙周可疑致病微生物AU126进行定性检测的方法已经公开发表，这类技术中使用的聚合酶链反应(PCR)引物的扩增产物片段较大，不能应用在定量检测时使用的实时荧光定量聚合酶链反应(Real TimePCR)。由于微生物与疾病的关系不仅与特定微生物的存在相关，还取决于宿主特定部位微生物的定植数量，因此有必要对未获培养的牙周可疑致病微生物AU126进行定量检测，以深入研究未获培养的微生物与疾病发生发展的关系。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种定量检测未获培养微生物AU126的方法。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的由人类口腔菌斑中提取微生物DNA作为模板，使用特异性引物，应用实时荧光定量聚合酶链反应仪进行检测。反应使用的技术参数如下第一步预变性95℃10秒，第二步PCR反应，共40循环，步骤为95℃5秒、55-65℃31秒，72℃30秒，第三步溶解曲线分析95℃15秒、6060秒，95℃15秒。使用经梯度稀释的已知浓度聚合酶链反应产物DNA作为标准品，与待检测DNA同时检测，能够由实时荧光定量聚合酶链反应仪给出的实验结果中直接读出未获培养的牙周可疑致病微生物AU126的16S rRNA基因拷贝数，从而推算获得微生物的数量。
一种定量检测未获培养微生物AU126的方法，该方法包括以下步骤(1)标本采集(2)标本总DNA提取；(3)定量检测AU126的16S rRNA基因。
在步骤(3)中AU126的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
在步骤(3)中使用Real Time PCR仪、采用SYBR GREEN I染料模式进行标本定量检测。
SYBR GREEN I染料模式中包括AU126专用引物，菌斑DNA模板，灭菌去离子水。
所述AU126专用引物序列如下
AU126fGTAAACGGAAGAGGCATCTTTTTTGTTAU126rCGTACAGTACTTGCAATAAAACAC。
引物结合位点为SEQ ID NO.1中第174-200位gtaaacggaagaggcatcttttttgtt，第460-483位gtgttttattgcaagtactgtacg。
Real Time PCR仪的反应条件为预变性95℃变性30s；95℃变性5s，62℃退火20s，72℃延伸31s，共40个循环。
本发明使用去离子水作为阴性对照。使用AU126特异片段倍比稀释物作为标准品和阳性对照。
根据标准品制作的标准曲线自动计算出每个标本中AU126 16S rRNA基因的含量，此数值除以AU126中16S rRNA基因启动子数量，乘以1000换算获得每个临床菌斑标本中AU126的数量。
16S rRNA基因可以比喻为微生物的身份证，每种微生物都有16SrRNA基因，根据16S rRNA基因进行分类是目前微生物分类的新标准。
本发明发明了针对AU126 16S rRNA基因设计的定量PCR引物，能够定量地特异地检测AU126的16S rRNA基因，因此也就能够定量地特异地检测AU126这种未获培养的微生物。
本发明所公开一种定量检测未获培养微生物AU126的方法，其优点表现在(1)能够准确定量检测一种未获培养的牙周可疑致病微生物AU126的代表其菌种特异性的16S rRNA基因，其应用于定性检测的敏感度也远高于普通聚合酶链反应(PCR)。
(2)应用本发明可以拓展牙周病的病因研究，可能辅助牙周病治疗疗效的研判。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
定量检测AU126详细步骤一、标本采集使用无菌刮匙刮取一定数量(湿重约1mg)的患者口腔需要检测部位的菌斑，立即转入含有1ml无菌传送液的无菌离心管中，立即保存-20℃冰箱内。
二、标本总DNA提取菌斑总DNA的提取使用胍去垢剂裂解液DNAzolTMReagent(Invitrogen，美国)。具体步骤如下1.室温融化菌斑标本，将细菌传送液中的临床菌斑标本于AllegraTMX-22R Centrifuge离心机(Beckman Coulter，德国)中4℃条件下12,000g离心3分钟，弃上清后加入1mlDNAzol液体，轻微振荡1分钟，静置10分钟，4℃条件下10,000g离心10分钟，吸取上清液至新离心管中，加入无水乙醇0.5ml，立即振荡混匀，静置3分钟，4℃条件下4,000g离心2分钟，弃上清。
2.加入1ml 75％乙醇，吹打振荡洗涤1分钟，4℃条件下4,000g离心2分钟，弃上清。75％乙醇洗涤的过程重复一次。
3.弃上清后静置1分钟以挥发残余乙醇，最后加入500μl 8mMNaOH溶液振荡溶解DNA。提取标本的总DNA，-20℃保存。
三、定量检测AU126的16S rRNA基因使用Real Time PCR仪、采用SYBR GREEN I染料模式进行标本定量检测。
1.Real Time PCR仪器名称ABI Real Time PCR System7300(Applied Biosystems，美国)。
2.Real Time PCR反应采用20μl体系，组成如下SYBRPremixEx TaqTM(2×)(Takara，中国)10μl，ROX Reference Dye(50×)(Takara，中国)0.4μl，10μmol/l本专利发明的定量特异检测AU126专用引物(合成单位sangon，中国)各0.4μl，菌斑DNA模板0.5μl，灭菌去离子水加至20μl。
3.Real Time PCR仪的反应条件设置为预变性95℃变性30s；95℃变性5s，62℃退火20s，72℃延伸31s，共40个循环，在延伸阶段收集荧光信号；循环结束后附加溶解曲线分析95℃15s，60℃23s，95℃15s。
4.去离子水作为阴性对照。AU126特异片段倍比稀释物作为标准品和阳性对照。每个标本都重复3次检测，以均值作为检测结果。
5.具体操作步骤1)计算标本数量、阴性对照、阳性对照和标准品的总数量，乘3得到本次检测的总反应管数量。
2)根据20μl体系的组成，将除DNA模板以外的反应组份配制成总反应液。振荡2分钟混匀总反应液。
3)按照每管19.5μl，将总反应液分装到MicroAmpTMOptical96-Well Reaction Plate(Applied Biosystems，美国)的单孔中。
4)往每孔内加入模板0.5μl。
5)反应板表面紧密覆盖MicroAmpTMOptical Adhesive Film(Applied Biosystems，美国)，保证密封防止反应液挥发。
6)将反应板放入Real Time PCR反应仪中，启动程序开始反应。
6.2小时后反应结束，由Real Time PCR仪的随机软件SequenceDetection System V1.2，根据标准品制作的标准曲线自动计算出每个标本中AU126 16S rRNA基因的含量，此数值除以AU126中16S rRNA基因启动子数量，乘1000(反应使用的模板为标本总DNA的千分之一)换算获得每个临床菌斑标本中AU126的数量。
SEQUENCE LISTING<110>上海交通大学医学院附属第九人民医院<120>一种定量检测未获培养微生物AU126的方法<130>/<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1481<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgataggc ttaacacatg caagtcgagg 60ggcatcacga attagcaata gtttggtggc gaccggcgca cgggtgcgta acacgtatac120aacctacctt caattgggga ataacctgga gaaatttgga ctaatacccc atagtaaacg180gaagaggcat cttttttgtt ttaaagattt attgattgga gatgggtatg cgtaggatta240gctagttggt aaggtaacgg cttaccaagg cgacgatcct taggggttct gagaggaagg300tcccccacac tggtactgag acacggacca gactcctacg ggaggcagca gtgaggaata360ttggtcaatg gtcgagagac tgaaccagcc aagtcgcgtg aaggaagacg gctctatgag420
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1.一种定量检测未获培养微生物AU126的方法，该方法包括以下步骤(1)标本采集(2)标本总DNA提取；(3)定量检测AU126的16S rRNA基因。
2.根据权利要求1所述的微生物AU126的检测方法，其特征在于在步骤(3)中AU126的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的微生物AU126的检测方法，其特征在于在步骤(3)中使用Real Time PCR仪、采用SYBR GREEN I染料模式进行标本定量检测。
4.根据权利要求3所述的AU126微生物的检测方法，其特征在于SYBRGREEN I染料模式中包括AU126专用引物，菌斑DNA模板，灭菌去离子水。
5.根据权利要求4所述的微生物AU126的检测方法，其特征在于AU126专用引物序列如下AU126rGTAAACGGAAGAGGCATCTTTTTTGTTAU126rCGTACAGTACTTGCAATAAAACAC。
6.根据权利要求5所述的微生物AU126的检测方法，其特征在于引物结合位点为SEQ ID NO.1中第174-200位gtaaacggaagaggcatcttttttgtt，第460-483位gtgttttattgcaagtactgtacg。
7.根据权利要求3所述的微生物AU126的检测方法，其特征在于RealTime PCR仪的反应条件为预变性95℃变性30s；95℃变性5s，62℃退火20s，72℃延伸31s，共40个循环。
8.根据权利要求4所述的微生物AU126的检测方法，其特征在于去离子水作为阴性对照。
9.根据权利要求4所述的微生物AU126的检测方法，其特征在于AU126特异片段倍比稀释物作为标准品和阳性对照。
10.根据权利要求9所述的微生物AU126的检测方法，其特征在于根据标准品制作的标准曲线自动计算出每个标本中AU126 16S rRNA基因的含量，此数值除以AU126中16S rRNA基因启动子数量，乘以1000换算获得每个临床菌斑标本中微生物AU126的数量。
全文摘要
本发明涉及一种定量检测未获培养微生物AU126的方法，该方法包括以下步骤标本采集、标本总DNA提取、定量检测AU126的16S rRNA基因。该定量检测方法优点表现在能够准确定量检测一种未获培养的牙周可疑致病微生物AU126的代表其菌种特异性的16S rRNA基因，其应用于定性检测的敏感度也远高于普通聚合酶链反应(PCR)。应用本发明可以拓展牙周病的病因研究，可能辅助牙周病治疗疗效的研判。
文档编号C12Q1/68GK1880475SQ20061002634
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月8日 优先权日2006年5月8日
发明者梁景平, 李超伦, 姜云涛 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院