专利名称：小鼠源NT－3基因、其克隆方法以及转基因质粒载体pEGFP－C1－NT－3的构建和NT－3 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小鼠源NT-3基因、其克隆方法以及转基因质粒载体pEGFP-C1-NT-3的构建和NT-3-C17.2细胞系的构建方法。
背景技术：
哺乳动物中枢神经系统损伤后，其内源性修复能力是有限的，因为受损的成年中枢神经系统很难产生新的神经元，也不能启动功能性轴突再生。尽管诱导内源性中枢神经系统干细胞分化为神经元是可行的，但就目前的技术水平，移植可能是修复受损中枢神经系统更为可行的途径。
较其它神经组织或细胞移植而言，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)移植有其独特的优势。神经干细胞来源于神经系统或能产生神经组织的细胞，它具有自我更新及增殖能力和定向分化能力。将神经干细胞移植到受损部位，在经过一定的增殖期后，在体内环境中可分化成机体内的特定神经功能细胞，完成特定的神经功能。
随着神经干细胞研究的深入，神经干细胞及其转基因产物被视为一种非常有潜在价值的治疗手段。目前NT-3基因多来自于人，而小鼠源的NT-3基因的同源性比较高，且作用效果也比较明显。小鼠源NT-3能促进皮质脊髓运动轴突的生长，在脊髓损伤后，能促进运动功能的恢复，而且能调节少突神经胶质细胞的功能，提示可以用NT-3来治疗脱髓鞘疾病。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种小鼠源NT-3基因。
本发明的目的之二在于提供该小鼠源NT-3基因的克隆方法。
本发明的目的之三在于提供小鼠源NT-3基因的转基因质粒载体pEGFP-C1-NT-3的构建方法。
本发明的目的之四在于提供小鼠源NT-3基因的NT-3-C17.2细胞系的构建方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种小鼠源NT-3基因，其特征在于该基因具有SEQ NO 3所示的碱基序列。
上述的小鼠源NT-3基因的克隆方法为以小鼠神经干细胞mRNA文库为模板PCR扩增得到全长基因NT-3，上下游引物序列如下，为了方便与载体连接，放入了Kpn1衔接位点上游引物5’-GAACGGTACCATGTCCATCTTGTTTTATGKpn1下游引物5’-AGA TGG TAC CTC ATG TTC TTC CAA TTKpn1。
上述的小鼠源NT-3基因的转基因质粒载体pEGFP-C1-NT-3的构建方法为将小鼠源NT-3基因插入荧光质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建重组载体pEGFP-C1-NT-3。
上述的小鼠源NT-3基因的NT-3-C17.2细胞系的构建方法为以梭华介导NT-3质粒的转染，由于NT-3质粒上带有G418筛选标记，为了富集阳性细胞，用G418筛选2周，即建立NT-3-C17.2细胞系。
本发明提供了小鼠源神经营养因子NT-3的克隆方法，构建了相应表达载体和细胞系，并进行移植，从而提供了一种有利于移植细胞存活的新途径。
具体实施例方式
实施例一小鼠源NT-3基因的克隆根据NT-3全长基因序列设计引物上游和下游引物，以小鼠神经干细胞mRNA文库为模板PCR扩增得到全长基因NT-3。上下游引物序列如下，为了方便与载体连接，放入了Kpn1衔接位点上游引物5’-GAACGGTACCATGTCCATCTTGTTTTATGKpn1下游引物5’-AGA TGG TAC CTC ATG TTC TTC CAA TTKpn1以神经干细胞mRNA文库为模板得到776bp的片段，将其连入PMD18-T载体，测序以及HindIII酶切鉴定，证实该片段即为NT-3基因。
实施例二构建转基因质粒载体pEGFP-C1-NT-3pEGFP-C1是一种哺乳动物表达载体，其报告基因编码的绿色荧光蛋白GFP受395nm的近紫外光或470～490nm的蓝光激发能发出510nm的绿色荧光。
将NT-3基因插入荧光质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建重组载体pEGFP-C1-NT-3。酶切鉴定和基因测序表明成功构建重组载体pEGFP-C1-NT-3。再经HindIII酶切做正反鉴定。
实施例三神经干细胞系的构建以梭华介导NT-3质粒的转染。由于质粒上带有G418筛选标记，为了富集阳性细胞，用G418筛选2周。建立NT-3-C17.2细胞系。2周后将细胞进行RT-PCR，检测NT-3基因的mRNA表达水平。RT-PCR实验表明，在转染NT-3的C17.2细胞中，NT-3基因mRNA的表达显著上调。
实施例四转基因细胞对移植的影响将培养的C17.2神经干细胞和NT-3-C17.2细胞系移植入脊髓损伤的小鼠体内，四周后做冰冻切片，检测细胞的存活状况。实验结果表明，NT-3基因可以促进细胞的存活，比对照组有明显的增多。
序列表<110>上海大学<120>小鼠源NT-3基因、其克隆方法以及转基因质粒载体pEGFP-C1-NT-3的构建和NT-3-C17.2细胞系的构建方法<160>3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1gaacggtacc atgtccatct tgttttatg 19
<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2agatggtacc tcatgttctt ccaatt 16<210>3<211>777<212>DNA<213>NT-3<400>3atgtccatct tgttttatgt gatatttctt gcttatctcc gtggcatcca aggcaacagc 60atggatcaaa ggagtttgcc ggaagactct ctcaattccc tcatcatcaa gctgatccag 120gcggatatct tgaaaaacaa gctttccaaa cagatggtgg atgttaagga aaattaccag 180agcaccctgc ccaaagcaga ggcacccagg gaaccagagc agggagaggc caccaggtca 240gagttccagc caatgattgc aacggacaca gagctactac ggcaacagag acgctacaat 300tcgccccggg tcctgctgag tgacagcacc cctttggagc cccctccctt atacctaatg 360gaggattatg tgggcaaccc ggtggtagcc aatagaacct caccacggag gaaacgctat 420gcagaacata agagtcaccg aggagagtac tcagtgtgtg acagtgagag cctgtgggtg 480accgacaagt cctcagccat tgacattcgg ggacaccagg tcacagtgct gggggagatc 540aaaaccggta actctcctgt gaaacaatat ttttatgaaa cgagatgtaa agaagccagg 600ccggtcaaaa acggttgcag ggggattgat gacaaacact ggaactctca gtgcaaaact 660tcgcaaacct atgtccgagc actgacttca gaaaacaaca aactcgtagg ctggcgctgg 720atacgaatag acacttcctg tgtgtgtgcc ttgtcgagaa aaattggaag aacatga 77权利要求
1.一种小鼠源NT-3基因，其特征在于该基因具有SEQ NO 3所示的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的小鼠源NT-3基因的克隆方法，其特征在于该方法为以小鼠神经干细胞mRNA文库为模板PCR扩增得到全长基因NT-3，上下游引物序列如下，为了方便与载体连接，放入了Kpn1衔接位点上游引物5’-GAACGGTACCATGTCCATCTTGTTTTATGKpn1下游引物5’-AGA TGG TAC CTC ATG TTC TTC CAA TTKpn1。
3.根据权利要求1所述的小鼠源NT-3基因的转基因质粒载体pEGFP-C1-NT-3的构建方法，其特征在于该方法为将小鼠源NT-3基因插入荧光质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建重组载体pEGFP-C1-NT-3。
4.根据权利要求1所述的小鼠源NT-3基因的NT-3-C17.2细胞系的构建方法，其特点在于该方法为以梭华介导NT-3质粒的转染，由于NT-3质粒上带有G418筛选标记，为了富集阳性细胞，用G418筛选2周，即建立NT-3-C17.2细胞系。
全文摘要
本发明详述了小鼠源神经营养因子NT－3的DNA序列，其克隆方法，构建了相应表达载体和细胞系，并进行移植，提供了一种有利于移植细胞存活的途径。
文档编号C12N15/63GK1912120SQ200610026209
公开日2007年2月14日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者文铁桥, 张露亿 申请人:上海大学