酶混合物的制作方法

专利名称：酶混合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的微生物，新的酶和新的酶混合物。此外，本发明还涉及酶混合物的组合物，其制备及其在饲料、食品和造纸及纺织等其它产业中的用途。
背景技术：
酶早已在工业上被用于不同的用途。例如食物发酵、制酒和果汁行业(酶在此用于降解果胶和β-葡聚糖)，纺织行业(在此，用纤维素酶获取柔软而光滑的纤维素纤维)，以及动物饲料。在此，酶提高植物源食物的消化率。
这最后一种用途使得家畜对饲料的消化更有效。饲料的价值可用FCR(饲料转化率)衡量，这是一个饲料消耗量比动物体重增量的营养学比值。如果某饲料的FCR降低，说明相对于给定量的饲料，动物可增加更多的重量；即，动物的饲料利用效率更高。
饲料成分(淀粉、脂肪、蛋白质/氨基酸)难以消化被认为是谷类饲料，尤其是大麦或小麦含量高的饲料的特点。这时，必需配制包含由其它来源和其它补充成分(例如氨基酸)提供更高能量的饲料。这些酶可提高饲料中谷类的表观可代谢能。
解决这一问题的另一方法是在谷类饲料中添加补充酶纤维素酶，内-1，3(4)-β-葡聚糖酶(β-葡聚糖酶)，内-1，4-β-木聚糖酶(木聚糖酶)等，或活性混合酶。酶添加剂可能具有水解谷类饲料(尤其是大麦和小麦)中β-葡聚糖或阿糖木聚糖的特殊作用。加酶有不同的目的。明确证明饲料酶添加剂作用的一个优点是降低了动物接受含合适酶添加剂饲料后肠内物的粘度。粘度高在一定程度上是因为大麦和小麦中的β-葡聚糖或阿糖基木聚糖。粘度因酶作用而降低使得营养成分更容易在肠中被吸收。另一个优点是释放出了包裹在谷类细胞壁内的营养素，减少了对其它昂贵的饲料添加剂的需要。整体效果是在保持或提高FCR的同时，显著降低了饲料成本。
现已用来自不同微生物的酶制剂提高饲料的消化率。
就与酶在动物饲料中的应用有关的现有技术而言，有欧洲专利0.699.762，它说明许旺酵母分泌植酸酶的用途。这种植酸酶来自经基因修饰而包含了某种克隆基因的微生物，这种克隆基因正是本发明所要避免的。
在专利申请WO95/26398中，将外源DNA序列引入宿主细胞，改变原菌株的特性，获得一种修饰纤维素酶，所述的原菌株选自芽孢杆菌，链霉菌，酵母菌，裂殖酵母菌，曲霉菌。在本发明中，我们的主要目的是避免在生产酶的微生物中引入外源基因。
在专利申请WO96/05739中，从不同微生物获得一种酶混合物(木聚糖酶、蛋白酶，和可选的β-葡聚糖酶)。作者例举了木聚糖酶与β-葡聚糖酶活性之比为1∶5的酶混合物。已发现，当木聚糖酶在谷类饲料中的含量是或接近其最佳剂量时，共存的具有β-葡聚糖酶活性的酶提高饲料的FCR，这当然是不利的。所以，作者主张减少β-葡聚糖酶，推荐木聚糖活性与β-葡聚糖酶活性最大比为1∶0-0.25。
有时，为了保证与饲料用途相关的所有酶活性都存在，由不同的微生物制备酶制剂。许多情况下，酶制剂是由经重组DNA技术基因修饰过的微生物制备的。
我们发现并开发了一种新的索状青霉菌类微生物，它含有新的酶和活性混合酶，主要可成功提高谷类动物饲料的消化率。
发明概述所以，本发明涉及一种衍生自索状青霉菌的新的微生物，和培养这种微生物并回收由其产生的酶的方法。
此外，本发明还提供由这种微生物分泌的新的酶，它们的核酸序列和含有这些酶的新的组合物。
本发明还提供提高谷类饲料和氨基酸的氨基酸消化率的方法。
本发明的另一主题是减少来自饲养动物的仓房的磷排放和氨排放。
本发明的详细说明A.新的索状青霉菌菌株新的索状青霉菌真菌菌株保藏于布达佩斯条约(1977)认可的国际保藏单位International Mycological Institute(IMI)，Bakeham Lane，Englefield Green，EghamSurrey，TW20 9TY，UK，保藏号为IMI378536，保藏日为1998年3月24日。
起源新的菌株来自IMI134756，经对孢子连续UV和β辐照后获得，包括在选择培养基上进行筛选。没有用引入外源DNA或RNA的重组DNA技术造成任何基因修饰。
鉴定和分类通过在Czapek Dox琼脂上，25℃的生长来描述索状青霉菌IMI378536。它具有索状青霉菌典型的菌落特征和微生物形态。是索状青霉菌的微生物鉴定已经得到了International Mycological Institute，Bakeham Lane，Englefield Green，Egham，Surrey，TW20 9TY，UK的确认。生长情况为根部坚硬，气生部分呈绳状或菌丝索，菌丝呈白色，基质内略泛红色，边缘苍白，但是向中心变红，可变为深红色。这是典型的青霉菌，具有主要来自菌丝索，二轮生针状产分生孢子细胞的短分生孢子梗，分生孢子呈椭圆形，外表光滑。
用于制备本发明酶制剂的微生物培养于有氧条件下，含纤维素、玉米浸泡液、碳酸钙和硫酸铵的培养基中。
B.发酵过程这种新真菌是通过首先在种子培养基中进行保藏株的发酵来生产的，所述的种子培养基宜包含(按重量计)玉米浸泡液 1％至4％消泡剂 足以避免发泡即可水 加至100％NaOH 足以在培养基灭菌前将pH调节至约3.0至6.0培养温度为27℃至36℃。
生产培养基的组成宜为(按重量计)玉米浸泡液 0％至4.0％分批加入的纤维素0.8％至14％钙盐0至0.8％硫酸铵 0至1.0％消泡剂 足以避免发泡即可水 补足至100％NaOH 足以在培养基灭菌前将pH调节至3.0至6.0H2SO4足以将pH维持在约3.0至6.0液态或气态氨足以将pH维持在约3.0至6.0培养温度为27℃至36℃。
为了进行发酵，在发酵罐中加入足量的水，在适当搅拌的容器中，将各成分加入水中，搅拌至成分完全溶解。密封发酵罐，将内含物升温至121℃，进行灭菌。用种子罐给发酵罐接种。
发酵过程中加入的主要碳源是纤维素；在各种不同的纤维素来源中，我们优选不同级别的ARBOCEL，SOLKAFLOC，CLAROCEL，ALPHACEL，FIBRACEL。
发酵的pH宜用硫酸或其它酸，和气态或液态氨或其它碱来调节。
在发酵结束时，通过过滤或离心等固液分离来去除固体，收集液相，通过例如有机或金属膜上的超滤来浓缩。
这些酶还可以用重组DNA技术来制造，由重组的同源或异源微生物产生。用编码酶的基因转化的宿主细胞可选自真菌、细菌或植物细胞。可用各种常规技术将编码感兴趣的酶的基因插入宿主细胞，例如用质粒(整合或非整合质粒)、噬菌体载体和病毒载体。含有异源基因插入，或因同源基因的插入、缺失或修饰而致基因组被修饰的索状青霉菌也属于本发明的内容。
根据本发明，提供的酶可以是分离后的纯酶制剂，也可以是作为培养索状青霉菌的培养基的粗制剂。
含酶组合物中还可以包含一种其它酶，其类型取决于组合物的用途。所加的酶选自例如糖酶、脂酶和蛋白酶。
C.混合酶活性组合物1.液体组合物就液体组合物而言，在加入抗生素后，测定酶浓度，并将稀释度校正到产物强度(product strength)。
按重量计，液体组合物较好的组成是作为总有机固体的微生物产物 4％-10％抗生素 0.005％-0.35％，以0.01％-0.25％为佳山梨醇 20％-50％防冻剂 0-40％，15％-40％更好浓缩的过滤后发酵液 15％-40％加缓冲液，调节至pH3至5抗生素选自山梨酸和盐，苯甲酸和盐，4-羟基苯甲酸甲酯和4-羟基苯甲酸正丙酯，富马酸、盐和酯。也可使用氯化钠或氯化钾等盐。
最好的防冻剂是1，2-丙二醇，乙二醇，甘油。
2.粉末组合物要得到粉末制剂，可在填料存在下干燥浓缩液。无填料存在下干燥浓缩液所得的粉末可进一步与合适的填料混合。
较好的粉末形式的组成是作为总有机固体的微生物产物 16％-40％运载体 59％-83％其它干燥的发酵液成分 1％较好的填料选自小麦粉，淀粉，生石膏，麦芽糊精，玉米浆，和玉米渣、粗麦粒、麦麸、黑麦渣等谷类加工副产物。
我们得到一种由索状青霉菌产生的新的酶混合物。这种酶混合物含有例如纤维素酶，β-葡聚糖酶，木聚糖酶，呋喃阿糖苷酶和阿魏酰基酯酶等木聚糖酶辅酶等新酶。
1.过程用试验来描述酶制剂的特征，这包括测试纤维素酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)、β-葡糖苷酶、内-1，3(4)-β-葡聚糖酶、昆布糖酶、内-1，4-β-木聚糖酶(利用不同的底物)、β-木糖苷酶、呋喃阿糖苷酶和阿魏酰基酯酶(利用不同的底物)活性。
1.1.用DNS CMC测定纤维素酶根据羧甲基纤维素(CMC)(β-1，4-葡聚糖)内糖苷键的酶水解检测纤维素酶活性。根据反应后还原值(成为葡萄糖)的升高检定反应产物β-1，4-葡聚糖寡糖。
含1ml 1％(v/v)CMC的0.1M乙酸钠缓冲液pH5.0(或其它pH值)溶液；1ml适当稀释的酶溶液50℃孵育10分钟。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水杨酸，1.6％(w/v)氢氧化钠，30％(w/v)酒石酸钾钠溶于蒸馏水)终止酶反应。搅拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分钟后冷却至25℃。溶液中加10ml蒸馏水，用路径长度2cm的玻璃比色杯测定540nm处的吸光度。
与以同样方式用DNS溶液处理的2ml 0.00-0.04％(w/v)葡萄糖溶液的标准曲线比较，转换成μmole还原糖(例如葡萄糖)。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时DNS溶液在酶溶液之前加入。1单位纤维素酶活性定义为在试验条件下(50℃，pH5.0或其它pH)，每分钟产生1μmole葡萄糖或其它还原糖的酶量。
1.2.用对硝基苯基β-D-吡喃纤维二糖苷法测定纤维二糖水解酶根据对硝基苯基β-D-吡喃纤维二糖苷的酶水解检测纤维二糖水解酶。用比色法测定反应产物，对硝基苯酚。
含1ml 0.1％(w/v)对硝基苯基β-D-吡喃纤维二糖苷的蒸馏水溶液；1ml蒸馏水；1ml 0.2M乙酸钠缓冲液，pH5.0；1ml适当稀释的酶溶液在50℃孵育30分钟。加4ml 0.4M甘油溶液终止酶反应。搅拌溶液并冷却至20℃。用路径长度1cm的玻璃比色杯测定400nm处的吸光度。
通过与上述条件下对硝基苯酚的摩尔浓度延伸系数比较，将结果转换成μmole对硝基苯酚。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时甘油溶液在酶溶液之前加入。1单位纤维二糖水解酶酶活性定义为在试验条件下(50℃，pH5.0)，每分钟由对硝基苯基β-D-吡喃纤维二糖苷产生1μmole对硝基苯酚所需的酶量。
1.3.用对硝基苯基β-吡喃葡萄糖苷法测定β-葡萄糖苷酶根据对硝基苯基β-吡喃葡萄糖苷的酶水解测定β-葡萄糖苷酶活性。用比色法检定反应产物对硝基苯酚。
含1ml 0.1％(w/v)对硝基苯基β-吡喃葡萄糖苷蒸馏水溶液；1ml蒸馏水；1ml0.2M乙酸钠缓冲液，pH5.0；1ml适当稀释的酶溶液在50℃孵育30分钟。加4ml0.4M甘油溶液终止酶反应。搅拌溶液并冷却至20℃。用路径长度1cm的玻璃比色杯测定400nm处的吸光度。
通过与上述条件下对硝基苯酚的摩尔浓度延伸系数比较，将结果转换成μmole对硝基苯酚。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时甘油溶液在酶溶液之前加入。1单位β-葡萄糖苷酶活性定义为在试验条件下(50℃，pH5.0)，每分钟由对硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷产生1μmole对硝基苯酚的酶量。
1.4.用DNS大麦β-葡聚糖法测定内-1，3(4)-β-葡聚糖酶根据大麦β-葡聚糖(一种β-1，3(4)-葡聚糖)内糖苷键的酶水解测定内-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性。根据反应后还原值(葡萄糖)的升高检定反应产物β-1，3(4)-葡聚糖寡糖。
含1ml 0.1％(w/v)大麦β-葡聚糖的0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0(或其它pH值)溶液；1ml适当稀释的酶溶液在50℃孵育10分钟。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水杨酸，1.6％(w/v)氢氧化钠，30％(w/v)酒石酸钾钠溶于蒸馏水)终止酶反应。搅拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分钟后冷却至25℃。溶液中加10ml蒸馏水，用路径长度2cm的玻璃比色杯测定540nm处的吸光度。
与以同样方式用DNS溶液处理的2ml 0.00-0.04％(w/v)葡萄糖溶液的标准曲线比较，将结果转换成μmole还原糖(例如葡萄糖)。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时DNS溶液在酶溶液之前加入。1单位内-1，3(4)-β-葡聚糖酶活定义为在试验条件下(50℃，pH5.0或其它pH)，每分钟产生1μmole葡萄糖或其它还原糖的酶量。
1.5.用偶氮大麦β-葡聚糖法测定内-1，3(4)-β-葡聚糖酶根据大麦β-葡聚糖的酶水解测定内-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性，这种大麦葡聚糖含有一个生色基团(偶氮大麦β-葡聚糖)。根据反应后590nm处吸光度的升高检定反应产物，这是一种在乙醇沉淀后可溶的寡聚物。
含0.5ml偶氮大麦β-葡聚糖底物(即用型)和0.2ml酶稀释液(在0.01M乙酸钠缓冲液，pH4.6中含0.15至0.60单位/ml)的溶液在30℃孵育20分钟。加2.5ml沉淀溶液(18.1g乙酸钠和3.0g锌混合于300ml蒸馏水，用盐酸将pH调至5.0，转移到烧杯中，用96％的乙醇定容)终止酶反应。搅拌溶液，并在室温下静置10分钟。将溶液转移到离心管中，在台式离心机上以1000g离心10分钟。用路径长度1cm的玻璃比色杯测定上清液在590nm处的吸光度。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时沉淀溶液在酶溶液之前加入。1单位内-1，3(4)-β-葡聚糖酶活定义为在试验条件下(30℃，pH4.6)，用标准底物，底物水解使得590nm吸光度为0.820单位所需的酶量。
1.6.用DNS昆布糖法测定昆布糖酶(内-1，3-β-葡聚糖酶)根据昆布糖(一种β-1，3-葡聚糖)内糖苷键的酶水解检测昆布糖酶(内-1，3-β-葡聚糖酶)活性。根据反应后还原值(葡萄糖)的升高检定反应产物β-1，3-葡聚糖寡糖。
含1ml 1％(w/v)昆布糖的0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0溶液；1ml适当稀释的酶溶液在50℃孵育10分钟。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水杨酸，1.6％(w/v)氢氧化钠，30％(w/v)酒石酸钾钠溶于蒸馏水)终止酶反应。搅拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分钟后冷却至25℃。溶液中加10ml蒸馏水，用路径长度2cm的玻璃比色杯测定540nm处的吸光度。
与以同样方式用DNS溶液处理的2ml 0.00-0.04％(w/v)葡萄糖溶液的标准曲线比较，将结果转换成μmole还原糖(例如葡萄糖)。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时DNS溶液在酶溶液之前加入。1单位昆布糖酶活定义为在试验条件下(50℃，pH5.0)，每分钟产生1μmole葡萄糖或其它还原糖的酶量。
1.7.用DNS桦木木聚糖法测定内-1，4-β-木聚糖酶根据桦木木聚糖即β-1，4-木聚糖内木聚糖苷键的酶水解检测内-1，4-β-木聚糖酶活性。根据反应后还原值(例如木聚糖)的升高检定反应产物β-1，4-木聚糖寡糖。
含1ml 1％(w/v)桦木木聚糖0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0(或其它pH)溶液；1ml适当稀释的酶溶液在50℃孵育10分钟。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水杨酸，1.6％(w/v)氢氧化钠，30％(w/v)酒石酸钾钠溶于蒸馏水)终止酶反应。搅拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分钟后冷却至25℃。溶液中加10ml蒸馏水，用路径长度2cm的玻璃比色杯测定540nm处的吸光度。
与以同样方式用DNS溶液处理的2ml 0.00-0.03％(w/v)木聚糖溶液的标准曲线比较，将结果转换成μmole还原糖(木聚糖)。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时DNS溶液在酶溶液之前加入。1单位内-1，4-β-木聚糖酶活定义为在试验条件下(50℃，pH5.0或其它pH)，每分钟产生1μmole木聚糖或其它还原糖的酶量。
1.8.用DNS小麦阿糖木聚糖法测定内-1，4-β-木聚糖酶根据小麦阿糖木聚糖即阿糖取代的β-1，4-木聚糖内木聚糖苷键的酶水解检测内-1，4-β-木聚糖酶活性。根据反应后还原值(例如木聚糖)的升高检定反应产物阿糖-β-1，4-木聚糖寡糖。
含1ml 1％(w/v)小麦阿糖木聚糖0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0(或其它pH)溶液；1ml适当稀释的酶溶液在50℃孵育10分钟。加2ml DNS溶液(1％(w/v)3，5-二硝基水杨酸，1.6％(w/v)氢氧化钠，30％(w/v)酒石酸钾钠溶于蒸馏水)终止酶反应。搅拌溶液，置于至少95℃的沸水浴中，5分钟后冷却至25℃。溶液中加10ml蒸馏水，用路径长度2cm的玻璃比色杯测定540nm处的吸光度。
与以同样方式用DNS溶液处理的2ml 0.00-0.03％(w/v)木聚糖溶液的标准曲线比较，将结果转换成μmole还原糖(木聚糖)。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时DNS溶液在酶溶液之前加入。1单位内-1，4-β-木聚糖酶活定义为在试验条件下(50℃，pH5.0或其它pH)，每分钟产生1μmole木聚糖或其它还原糖的酶量。
1.9.用DNS小麦阿糖木聚糖粘度法测定内-1，4-β-木聚糖酶根据标准小麦阿糖木聚糖溶液的酶水解检测内-1，4-β-木聚糖酶活性。根据相对粘度随时间降低检定所述活性。
将含1ml，1％(w/v)小麦阿糖木聚糖的0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.5(或其它pH)溶液；3ml蒸馏水和1ml适当稀释的酶溶液注入Haake微量粘度计中(使用标定到0.1-2.0mPa.s的金球)，在30℃，在15至20分钟的时间内，每隔30秒测定一次球的落下时间(T测试)。分别测定水(5m蒸馏水)和底物(1ml，1％(w/v)小麦阿糖木聚糖的0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.5(或其它pH)溶液；4ml蒸馏水)的平均落球时间，即T水和T底物。用同样的方式测定对照。如下计算相对流度(Fr) 计算Fr对时间(每次测定T测试时已经过的时间)图中的斜率，即每分钟的相对流度改变(ΔFr.min-1)，它与酶浓度成正比。一单位内-1，4-β-木聚糖酶活性定义为在试验条件下(30℃，pH5.5或其它pH)每分钟通过水解底物使得溶液的相对流度改变1(无量纲单位)的酶量。
1.10.用对硝基苯基β-D-吡喃木糖苷法测定β-木糖苷酶根据对硝基苯基β-D-吡喃木糖苷的酶水解测定β-木糖苷酶。用比色法检定反应产物对硝基苯酚。
含1ml 1％(w/v)对硝基苯基β-D-吡喃木糖苷蒸馏水溶液；1ml蒸馏水；1ml0.2M乙酸钠缓冲液，pH5.0；1ml适当稀释的酶溶液在50℃孵育30分钟。加4ml0.4M甘油溶液终止酶反应。搅拌溶液，并冷却至20℃。用1cm路径长度的玻璃比色杯测定400nm处的吸光度。
与相同条件下对硝基苯酚的摩尔浓度延伸系数比较，将结果转化为μmole对硝基苯酚。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时甘油在酶溶液之前加入。一单位木糖苷酶活性定义为在试验条件下(50℃，pH5.0)每分钟由对硝基苯基β-D-吡喃木糖苷产生1μmole对硝基苯酚的酶量。
1.11.用对硝基苯基α-L-呋喃阿糖苷法测定α-N-呋喃阿糖苷酶根据对硝基苯基α-L-呋喃阿糖苷的酶水解测定α-N-呋喃阿糖苷酶(呋喃阿糖苷)。用比色法检定反应产物对硝基苯酚。
含1ml 1％(w/v)对硝基苯基α-L-呋喃阿糖苷蒸馏水溶液；1ml蒸馏水；1ml0.2M乙酸钠缓冲液，pH5.0；1ml适当稀释的酶溶液在50℃孵育30分钟。加4ml0.4M的甘油溶液终止酶反应。搅拌溶液，并冷却至20℃。用1cm路径长度的玻璃比色杯测定400nm处的吸光度。
与相同条件下对硝基苯酚的摩尔浓度延伸系数比较，将结果转化为μmole对硝基苯酚。
对测得的酶反应液吸光度进行非特异性吸光度校正，为此，反应时甘油溶液在酶溶液之前加入。一单位呋喃阿糖苷酶活性定义为在试验条件下(50℃，pH5.0)每分钟由硝基苯基α-L-呋喃阿糖苷产生1μmole对硝基苯酚的酶量。
1.12.FAXX法测定阿魏酰基酯酶根据O-[5-O-(反-阿魏酰基)-α-L-呋喃阿糖基]-(1→3)-O-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-D-吡喃木糖(FAXX)的酶水解测定阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)。FAXX由小麦麸皮水解制得，用NMR纯化并描述其特征。用分光光度法测定FAXX的水解。
在325nm处跟踪酶反应，用路径1cm的测定比色杯，含0.050mM FAXX的0.1M MOPS缓冲液，pH6.0溶液，37℃。
FAXX的一个单位阿魏酰基酯酶活性定义为在试验条件下(37℃，pH65.0)每分钟将1μmole底物转化成产物所需的酶量。
1.13.Ara2F法测定阿魏酰基酯酶根据Ara2F(在1，2位与阿拉伯糖连接的阿魏酸)的酶水解测定阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)。由甜菜瓤酶水解制备Ara2F，NMR纯化并描述特征。用分光光度法测定Ara2F的水解。
在325nm处跟踪酶反应，用路径1cm的比色杯，含0.050mM Ara2F的0.1MMOPS缓冲液，pH6.0溶液，37℃。
一单位阿魏酰基酯酶活性定义为在试验条件下(37℃，pH6.0)每分钟将1μmole底物转化为产物的酶量。
1.14.根据以下甲酯的水解测定阿魏酰基酯酶阿魏酸甲酯(MFA)；血凝酸甲酯(MCA)；芥子酸甲酯(MSA)；对香豆酸甲酯(MpCA)根据阿魏酸甲酯(MFA)，血凝酸甲酯(MCA)，芥子酸甲酯(MSA)，对香豆酸甲酯(MpCA)的酶水解测定阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)。在0.1M MOPS缓冲液中，pH6.0，37℃测定甲酯的水解。试验以两种不同的技术为基础。
在分光光度法中，甲酯底物的浓度是0.10mM，用路径1cm的比色杯在325nm处跟踪酯水解。该方法中底物的初始浓度是限定的。
在HPLC中，甲酯底物的浓度是1.0mM，用HPLC以10-30分钟的间隔测定游离酸的释放来跟踪酯水解。该方法对底物浓度没有限定，所以，测得的活性比分光光度法测得的高。
一单位阿魏酰基酯酶活性定义为在试验条件下(37℃，pH6.0)每分钟将lμmole底物转化为产物的酶量。
1.15.用改良Bradford考马斯蓝结合蛋白试验测定蛋白质浓度根据改良Bradford考马斯蓝结合蛋白试验测定蛋白质浓度，用Brilliant蓝G(考马斯蓝)，用路径1cm的玻璃比色杯在分光光度计中测定595处的吸光度。用牛血清白蛋白(Sigma P 0914)将该方法(Sigma B 6916)标准化。
1.16.用等电点聚焦法测定等电点在NOVEXXCell IITMMini-Cell中，使用NOVEXpH3-10(pI3.5-8.5)或pH3-7(pI3.0-6.5)的预制5％垂直聚丙烯酰胺凝胶用标准法测定蛋白质的等电点。使用NOVEX阳极和阴极，pH3-10或pH3-7的IEF样品缓冲液。使用NOVEX的等电点聚焦、固定、考马斯R-250蓝染色和脱色标准方法。
1.17.SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)用SDS-PAGE标准法进行蛋白质的分析分离和分子量测定。在NOVEXXCell IITMMini-Cell中使用预制NOVEXNuPAGETM凝胶(NuPAGETM双Tris凝胶或NuPAGETMTris乙酸凝胶，并使用NOVEX推荐的电泳缓冲液)。使用的是NOVEX的样品制备和电泳缓冲液，以及分子量标准物。使用NOVEX的SDS-PAGE、固定、考马斯R-250蓝染色和脱色标准方法。
2.有关酶混合物的结果2.1.最适pH2.1.1.内-1，3(4)-β-葡聚糖酶的活性用DNS大麦β-葡聚糖法，在50℃的标准条件下进行索状青霉菌内-1，3(4)-β-葡聚糖酶试验。测定pH3.0至pH7.0之间的酶活性。酶活性的最适pH在pH4.0-5.0。
2.1.2.内-1，4-β-木聚糖酶活性用DNS桦木木聚糖法，在50℃的标准条件下进行索状青霉菌内-1，4-β-木聚糖酶试验。
2.2.最适温度2.2.1.内-1，3(4)-β-葡聚糖酶的活性用DNS大麦β-葡聚糖法，在pH5.0(该酶的最适pH)的标准条件下进行索状青霉菌内-1，3(4)-β-葡聚糖酶试验。测定30℃至70℃之间的酶活性。酶活性的最适温度在50至60℃之间，60℃时的酶活性最高。以下温度与活性表给出了详细的结果。
2.1.2.内-1，4-β-木聚糖酶活性用DNS桦木木聚糖法，在pH5.5和pH3.5的标准条件下进行索状青霉菌内-1，4-β-木聚糖酶试验。测定30℃至70℃之间的酶活性。酶活性的最适温度在50℃至60℃之间，pH5.5时50℃的酶活性最高，pH3.5时，60℃的酶活性最高。以下温度与活性表给出了详细的结果。
索状青霉菌产生的酶具有高水平的纤维素酶，内-1，3(4)-β-葡聚糖酶及其它聚糖水解酶(glycanolytic)活性。此外，它们还具有高水平的内-1，4-β-木聚糖酶和木聚糖酶辅酶活性。半纤维素水解酶(hemicellulolytic)的广谱性是该微生物的酶制剂的特征之一。
被测的每种酶活性都可以表示为与制剂主活性的比例。表A是所得结果的一实例。这些比例可能随不同的发酵批次而不同。
表A对不同底物的相对活性
3-酶混合物中各组分的特性3.1.纯化方法疏水层析将发酵培养基过滤浓缩，得到蛋白质浓度为112.6mg/ml的制剂，用疏水层析(HIC)缓冲液(50mM磷酸缓冲液，pH7.0/1.7M(NH4)2SO4/0.04％叠氮钠)进行1/1稀释，交换到HIC缓冲液中(PD-10柱；Pharmacia)。每份10ml上样在PhenylSepharoseTM高效HIC凝胶柱(10×5cm直径，200ml)(Pharmacia)上，用还原性硫酸铵((NH4)2SO4)浓度梯度(1.7-0.0M)分离，速度为10ml/min。收集流份(10ml)，测定木聚糖酶活性。
HIC产生2个木聚糖酶活性峰。第一个称A峰，当(NH4)2SO4浓度减低到0.6M时从柱上洗脱，第二个称B峰，约在(NH4)2SO4浓度为0.25M时洗脱。分别合并各次注入样品后含A峰和B峰的流份。按总计，流份A相当于总木聚糖活性的2.8％，流份B相当于97.2％。得率为77％。
离子交换层析沉淀HIC中A峰和B峰的合并流份将(NH4)2SO4浓度提高到100％饱和，然后离心(10,000×g，30分钟)。沉淀重溶于20mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0/0.04％叠氮钠中，用PD-10柱脱盐到同一缓冲液中。MonoQTMHR10/10阴离子交换柱(Pharmacia)事先以20mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0/0.04％叠氮钠平衡，上样5ml，在同一缓冲液中逐步升高氯化钠浓度(NaCl(0-1M))以2ml/min的速度洗脱。收集流份(2ml)，测定木聚糖活性。
A峰阴离子交换层析分离的A峰产生木聚糖酶活性单峰，在0.3M NaCl时洗脱。合并活性最高的流份，进行SDS-PAGE分析(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。产生一条分子量48kDa的主带。IEF(等电点聚焦)后回收木聚糖酶活性证实这一被考马斯蓝染色的主带是木聚糖酶。
B峰阴离子交换层析分离的B峰产生2个木聚糖酶活性主峰，一个在纯水中洗脱(不结合的物质；B-I峰)，另一个在0.1M NaCl时洗脱(B-II峰)。在0.13M和0.19MNaCl时还洗出2个副峰。合并对应于各峰的活性流份，进行SDS-PAGE分析，这些样品都不纯。
凝胶过滤层析将含B-I和B-II的合并流份冷冻干燥，重溶于水，脱盐(用PD-10柱)。将样品(0.2ml)上样在SuperdexTM75HR柱(Pharmacia)上，用20mM Bis-Tris缓冲液，pH6.0/0.2M NaCl/0.04％叠氮钠洗脱。收集流份(0.4ml)，分析木聚糖酶活性。
3.2.木聚糖酶的性质3.2.1.用等电点聚焦法测定等电点用标准方法，使用pH3-10和pH3-7的NOVEX预制5％垂直聚丙烯酰胺凝胶板测定蛋白质的等电点。使用NOVEX阳极、阴极和IEF样品缓冲液，等电点聚焦、固定、考马斯R-250蓝染色和脱色的标准方法。
就木聚糖酶A而言，在MonoQ之后使用一份样品。就木聚糖酶B-I和B-II而言，在HIC和木聚糖B之后使用一份样品。就A和B分别而言，将一小份样品(10μl)加入一格中，将一大份(50μl)样品加入3格。样品聚焦后，凝胶对半切开，使得其中一半包含两个小份样品(A+B)和分子量标记(这一半用考马斯蓝染色)，另一半包含两个大份样品。切割含大份样品的那一半凝胶将两样品泳道分开，然后分别将两泳道分成2mm的片。分别将2mm的片在100mM MOPS缓冲液、pH6.0/0.04％叠氮钠中浸泡过夜。测试各小片的木聚糖酶活性。
就木聚糖酶A样品而言，染色后的IEF凝胶展示对应pI3.55标记物的一条主带和一些含量甚微的条带。只有对应于主带的部分测得了木聚糖酶活性，证明这是木聚糖酶主带。
就木聚糖酶B样品而言，染色后的IEF凝胶展示一定p1范围内的数条条带。未染色的凝胶上的两份部分凝胶中测到了木聚糖酶活性，这两部分对应于pI4.2和4.8。
3.2.2.SDS-PAGE测定分子量为了确认HIC B峰中木聚糖酶的分子量，将从IEF凝胶上洗脱的具有木聚糖酶活性的部分脱盐、冷冻干燥和SDS-PAGE分离。用10％Tris-甘油凝胶(NOVEX)进行变性PAGE，在样品缓冲液中加入二硫苏糖醇(DTT50mM)作为还原剂。
染色后的凝胶显示，分子量36kDa和15kDa的木聚糖酶B-I和木聚糖酶B-II都是纯的。
对纯化后的以下三种木聚糖酶进行SDS-PAGE分析阴离子交换层析后的木聚糖酶A，凝胶过滤层析后的木聚糖酶B-I和木聚糖酶B-II。木聚糖酶A呈现一条分子量48kDa的条带。考马斯染色后，木聚糖酶B-I呈现1条主带和4条副带。经确认，主带是木聚糖酶，因为它的分子量为36kDa。据估计，纯度为90％。木聚糖酶B-II呈现1条分子量15kDa的主带和2-3条副带。这种木聚糖酶的纯度约为95％。
3.2.3.酶活性酶活性的测试已在先前说明过了。
3.2.3.1.木聚糖酶A的测试[蛋白质]0.4(mg/ml)
nd未测定n/a不适用木聚糖酶对桦木木聚糖的活性与pH
3.2.3.2.木聚糖酶B-I的分析[蛋白质] 0.096(mg/ml)
nd未测定n/a不适用木聚糖酶对桦木木聚糖的活性与pH
3.2.3.3.木聚糖酶B-II的分析[蛋白质]0.165(mg/ml)
nd未测定n/a不适用木聚糖酶对桦木木聚糖的活性与pH
3.2.4.序列本发明的实施例之一是关于上述蛋白质及其变异体的氨基酸和核酸序列。
为此，根据纯化蛋白(木聚糖酶A，木聚糖酶B-I和木聚糖酶B-II)的氨基酸序列和与已知真菌木聚糖酶氨基酸序列及核苷酸序列的比较来确定各木聚糖酶的序列。
在本发明中，变异体应理解成指，具有相同于天然蛋白或多肽的生物活性的各种蛋白类似物、蛋白质片段、天然蛋白或多肽的衍生或突变蛋白。不同的变异体可以不同的自然状态存在。所述的变体可能是等位变体，特征在于编码所述蛋白的基因序列内的差异，或者来自差异剪接或转导后修饰。变体可通过取代、缺失、添加和/或修饰一个或多个氨基酸得到。所述的修饰都是本领域技术人员熟知并可根据标准方法予以实施的。
变体即具有(例如)更高的底物亲合性或新的生物特性的分子。
本发明的另一目的是在单细胞或多细胞生物宿主细胞内用序列表达在此揭示的蛋白质或多肽。为此，可将所述序列结合到载体的基因组内。所述载体可以是质粒、噬菌体或病毒。因此，本发明的另一实施例是分离自单细胞或多细胞生物，并用所述载体转染或感染的宿主细胞。在优选实施例中，宿主细胞是细菌。
用含所述蛋白质的核酸序列的所述载体在各种宿主细胞内表达所述蛋白是本发明的另一实施例。
3.2.4.1.木聚糖酶C的序列探针的制备是根据已知真菌木聚糖酶氨基酸序列及核苷酸序列的比较。检定出保守区域，用于设计PCR引物，产物被用来筛选索状青霉菌的基因组文库。
制备了两对简并引物。第一对被设计成由B型(或2型)木聚糖酶基因扩增200bp(大约)的产物。第二对设计用来由A型(或1型)木聚糖酶基因扩增250bp的产物。
引物3和4产生一条258bp的条带。克隆到pGEMT内并测序后发现，该条带与A/1型真菌木聚糖酶具有显著的序列相似性。含有该克隆产物的质粒命名为pPFXYLA。
图1和SEQ IN NO1显示了木聚糖酶C的完整序列。
3.2.4.2.木聚糖酶BI的序列用内部氨基酸序列，并与其他真菌纤维二糖水解酶进行序列排列对比来设计简并PCR引物(SEQ ID NO.2和3)。扩增得到290bp的产物(SEQ ID NO.4)，克隆到pGEMT(Promega)内产生pGEMTCB2，然后测序。如图2所示，引物序列加了下划线。该PCR产物目前被用作探针筛选索状青霉菌IMI134756基因组文库。
3.2.4.3.木聚糖酶BII的序列木聚糖酶BII基因的完整序列包括1.3kb的5’非翻译上游区和0.85kb的3’非翻译区，一个54bp内含子和编码一个223氨基酸蛋白质的669bp。
用逆转录PCR(RT-PCR)证明54bp内含子的存在。由索状青霉菌IMI-134756的菌丝体分离总RNA，菌体是在1％(w/v)燕麦木聚糖上生长4天后收获的。引物设计成用来由信使RNA扩增多至195bp片段(基因组DNA的249bp)和433bp片段(基因组DNA的487bp)。
测定质粒(pPFXYNC2，3’末端的3kb序列揭示了一个基因(称为perA)，其中含有两个推定内含子，编码一个约570氨基酸的多肽。该多肽与真菌氨基酸透酶具有显著的序列相似性。
3.2.4.4.木聚糖酶A的序列测得木聚糖酶A的内序列，其氨基酸序列为AEAINYNQDY3.3.阿魏酰基酯酶的特征3.3.1.纯化实施过程与木聚糖酶的相同。
酶混合物包含至少两种不同的阿魏酰酯酶。其中一种(FaeB)质谱测定的分子量为38,945-41,051Da(根据一级氨基酸序列为35,450Da，SDS-PAGE测得的是37Da)。FaeB的pI为4.2，它是一种B型阿魏酰酯酶，对MpCA和Ara2F底物具有特异性(对MpCA、MCA、MFA和Ara2F有活性；但对MSA和FAXX没有活性)。
另一阿魏酰酯酶(FaeA)的分子量为29kDa(由SDS-PAGE测得)。FaeA的pI为4.65，它是一种A型阿魏酰酯酶，对FAXX和MSA底物具有特异性(对MSA、MCA、MFA和FAXX具有活性，但对MpCA和Ara2F没有活性)。
3.3.2.等电点聚焦法测定等电点用标准方法测定蛋白质的等电点。将酶混合物上样在IEF凝胶上成一宽带(约20mm)，低温(5℃)电泳。在聚焦和条带清晰化后，在样品泳道的中部切下凝胶。用标准方法将样品泳道的一半和IEF标准物固定，染色，脱色。将另一半泳道切成2mm的切片，都在1ml 100mM MOPS缓冲液，pH6.0中浸泡过夜。用MFA、MpCA和MSA底物测定各凝胶切片的阿魏酰酯酶活性。
染色后的IEF凝胶显示有许多纤维素酶蛋白，它们的pI从强酸性(pI2.4)到大约pI7。蛋白中大多数是酸性的(pI为2.4-5)。在切自凝胶的各份中测得两个阿魏酰酯酶活性峰。一个对应于FaeB，pI4.2，只对MFA和MpAC(不是MSA)具有活性。另一个对应于FaeA，pI4.65，对三种测试底物都有活性。
3.3.3.SDS-PAGE测定分子量用SDS-PAGE，使用10％Tris-甘油凝胶测定分子量。采用标准方法，进行SDS-PAGE凝胶电泳，固定，考马斯染料染色和脱色。
酶混合物含至少2种不同的阿魏酰酯酶。一种对应于FaeB(pI4.2)，分子量37kDa。另一种对应于FaeA(pI4.65)，分子量29kDa。
3.3.4.阿魏酰酯酶的活性用分光光度法，以酶混合物测定阿魏酰酯酶活性。
酶混合物对所有测试底物都有活性。在甲酯中，对MpCA的活性最高，对MSA的活性最低。对Ara2F和FAXX的活性高于对甲酯的活性，说明酯酶活性来自真正的阿魏酰酯酶而不是笼统的酯酶或其它细胞壁降解性酯酶(例如乙酰木聚糖酯酶，果胶酯酶)的副活性。
3.3.5.序列3.3.5.1.FEA-A的序列根据纯化蛋白的胰蛋白酶消化，得到内氨基酸序列序列1QYTLTLPSNYNPNK序列2AVAVMSGANL序列3TEYSG(C/A)DSEHPVWWIAFDGP序列4DTFVKDDHCTPTNPPAPAAGSGTHIKYV根据由纯化蛋白得到的氨基酸序列设计了一些简并PCR引物。将产物克隆到pGEMT(Promega)中，然后测序。
PCR发现，质粒pGEMTD19(180bp)(图3)含有上述肽序列4。图3中，引物序列加双下划线，已知序列加单下划线。
SEQ ID NO.5是FAE-A的核酸序列和氨基酸序列。
3.3.5.2.FEA-B的序列将根据FAE-B的肽序列设计的引物用作扩增探针，然后用于筛选索状青霉菌基因组文库。分离到一段2291bp的克隆并测定了序列(SEQ ID NO.6)。该基因编码一个304氨基酸的多肽，并具有一个推定内含子。图4显示推定氨基酸序列，其中成熟蛋白(成熟蛋白长338氨基酸)以粗体表示。该蛋白包含2个不同的结构域，由一个高度糖基化的接头隔开。在图4中，催化区是粗体，结合区具有粗双下划线，接头以粗虚线表示。
该蛋白的特征还在于具有推定的活性位点基序(丝氨酸＝亲核)，见图4中的下划线部分，具有以下推定的催化三联体(1)S136/D174/H216(2)S136/D220/H276FAE-B蛋白还有一段分泌序列(353)和10个半胱氨酸。
3.4.葡聚糖酶的特性对酶混合物进行2D凝胶电泳。在NOVEXXCell IITMMini-Cell中，用pH3-7(pI3.0-6.5)的NOVEX预制5％垂直聚丙烯酰胺凝胶进行IEF。使用NOVEX阳极、阴极和pH3-7的IEF样品缓冲液和等电点聚焦的标准方法。切下一条泳道，用10％Laemmli SDS-PAGE凝胶进行第二维度的电泳。从凝胶中分离出第二泳道，切成35份，将凝胶条浸在缓冲液中，分析各份的酶活性。将第三泳道留在凝胶上，用NOVEX标准方法固定，考马斯R-250蓝染料染色，脱色。
在pI4.2，分子量36kDa和pI5.4，分子量27kDa的部分中发现了显著的内-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性(DNS大麦β-葡聚糖法)和纤维素酶活性(CMC法)。为了去除各等份之一中的木聚糖酶B-I，用DNS桦木木聚糖法测定各等份的活性。在β-葡聚糖酶或纤维素酶等份中没有测到木聚糖酶活性。


图1索状青霉菌木聚糖酶C蛋白的氨基酸序列；图2木聚糖酶BI(XynBI)PCR产物的核苷酸序列和氨基酸序列；图3阿魏酰酯酶A(faeA)PCR产物的核苷酸和氨基酸序列；图4索状青霉菌阿魏酰酯酶B(faeB)蛋白(FAE-V或FAE-1)的氨基酸序列。
E.用酶混合物来饲养动物实施例1在仔鸡内评价索状青霉菌产酶制剂对于小麦-大麦混合饲料能值(AMEN)的效用。
该实施例的目的是证明酶(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)对50％小麦22％大麦饲料的氮平衡校正表观可代谢能的效用。
用欧洲参考方法(Bourdillon等，1990)，放养，对对照和酶制剂(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)进行常规处理，收集18日至21日龄的排泄物。
a.材料和方法禽品种和饲养条件1日龄的Ross雄仔鸡在养鸡棚中喂养至12日龄。它们被饲以标准起始饮食。在第12日，称量仔鸡的体重，分到单独的笼子中，每种处理均为10笼，然后在适应期(最少5天)饲以实验饮食。
使用标准温度和湿度。光照条件保持为23小时光照，1小时无光，直至实验结束。
饲料仔鸡从第一天至第12天接受的是起始饮食，然后饲以实验饮食。
实验饲料含50％小麦和22％大麦的饲料(表1.1)。将酶制剂喷在20kg碎饲料上。
用测粘度法测定饲料中的酶回收率(in-feed enzyme recovery)(Sabatier & Fish，1996)。
测定可代谢能按以下过程，第18日起进行结算D17仔鸡被通宵禁食；D18称重，清洁收集盘；D19收集鸡粪，冷冻；D20收集鸡粪，冷冻，通宵禁食；D21收集鸡粪，冷冻，称量仔鸡重量，恢复喂食。
然后，将排泄物冷冻干燥，研磨得如同饲料一般(1mm，Retsch研磨机)。在一台IKA C5000绝热热量计上测定饲料和排泄物的粗能。还测定蛋白质(N*6.25，Kjeldahi法Z130)和脂肪(Z160法)含量。以蛋白质占重量增加的18％进行氮平衡校正。
b.结果与讨论氮平衡校正的表观可代谢能(AMEN)表1.2是动物工艺学表现和代谢能。不同的处理没有动物工学表现差异。
在成长期的仔鸡中，酶制剂将主要为50％小麦和22％大麦的饮食的AMEN提高了6.2％(+204kcal/kg DM(干物质))。
而且，能量的消化率变化从80kcal/kg DM降低到62kcal/kg DM。
这一大幅改善证明索状青霉菌产生的两种酶活性(木聚糖酶和β-葡聚糖酶)都能水解小麦和大麦的水溶性非淀粉多糖。
表1.1实验饮食的主要成分和被测特征

表1.2索状青霉菌产酶制剂对饲以50％小麦22％大麦饮食的仔鸡生长和表观可代谢能的作用。


实施例2索状青霉菌产酶制剂在小麦饲养的仔鸡中对饲料消化率的作用进行该实验是为了测定在饲以含54％小麦的饮食的仔鸡中，索状青霉菌产酶制剂(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)对表观可代谢能(AMEN)、蛋白质和脂类消化率的作用。对研磨的作用也进行了测定。
(1)对照1(54％研磨的小麦)(2)对照1+酶制剂(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)(3)对照2(30全小麦，24％研磨后的小麦)(4)对照2+酶制剂(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)根据欧洲参考方法(放养，收集18至21日龄的全部排泄物)(Bourdillon等，1990)。
a.材料和方法禽品种和饲养条件1日龄的Ross雄仔鸡在养鸡棚中喂养至12日龄。然后转移到单独的笼子中进行消化平衡结算。
使用标准温度和湿度。保持光照条件为23小时光照，1小时无光，直至第8日。然后因同一棚中进行的另一蛋鸡实验改为15小时30分钟光照，8小时30分钟无光。
饲料仔鸡从第一天至第12天接受的是标准起始饮食，然后饲以实验饮食。
实验饲料含54％小麦。特征见表2.1。饮食的组成见表2.2。
测定表观可代谢能按照以下过程，第17日起进行结算D17仔鸡被通宵禁食；D18称重，清洁收集盘；D19收集鸡粪，冷冻；D20收集鸡粪，冷冻，通宵禁食；D21收集鸡粪，冷冻，称量仔鸡重量，恢复喂食。
然后，将排泄物冷冻干燥，进行如同饲料的研磨(1mm，Retsch研磨机)。在一台IKA C5000绝热热量计上测定饲料和排泄物的粗能。还测定蛋白质(N*6.25，对饲料使用Kjeldahi Z130法，对粪便使用Z135法)和脂类(Z160法)含量。
用HPLC(对饲料使用Z100法，对粪便使用Z080法)测定氨基酸总体特征。用AFNOR法(NFV18-106)测定饲料和粪便的磷含量。
b.结果与讨论表观可代谢能(AMEN)表2.3中是成长表现和可代谢能数据。不同的处理之间，表现(体重增加，饲料摄入)在3天的测定中没有区别。含54％研磨小麦的对照饮食的AMEN是3173kcal/kg。小麦总含量相同但其中30％是全谷的饮食的可代谢能比理论值提高了100kcal/kg。而且，全麦还降低了测得的以不同标准的标准偏差表示的不一致性。
如果小麦都是研磨的，索状青霉菌产生的酶(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)将54％小麦饮食的可代谢能值提高3.4％(122kcal/kgDM)，如果30％的小麦是全谷颗粒，提高2.7％(101kcal/kg DM)。
营养物质(脂类、蛋白质和氨基酸)的表观消化率如果小麦全部是研磨的，脂类和蛋白质的表观消化率分别被索状青霉菌产生的酶制剂提高7％和2.7％。如果部分小麦是全谷，提高较小分别为3％和0.6％，因为营养物质的消化率被全面提高。实际上，含全麦的对照饮食的营养物质消化率与只含研磨小麦但补充了酶制剂的实验饮食的相似。
酶制剂对表观氨基酸消化率的作用见表2.4。酶制剂对全部为研磨小麦的饲料的提高平均为2.9％，对全麦饲料的提高为1.1％，由此证明了对表观蛋白质消化率的作用。
表观磷滞留和磷排泄表2.5是酶制剂对表观磷滞留的作用。添加酶制剂显著提高了表观磷滞留+8.0％。这一提高高于其他营养物质的提高(根据不同的标准(AME，蛋白质，脂类，氨基酸)在2.9％至3.5％)。所以，这样的提高可能来自营养物质消化率的改善(木聚糖酶和β-葡聚糖酶的直接作用)，也可能还来自小麦植酸酶作用的改善。在水解非淀粉多糖时，木聚糖酶和β-葡聚糖酶使得内源性小麦植酸酶更容易接近植酸。
可消化磷利用的改善降低了磷的排泄如果以“g磷/kg体重增加”表示，降低8％。
表2.1小麦的特征(％)

表2.2实验饮食的组成与特征

表2.3酶制剂(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)在成长期的仔鸡中对以小麦为主的饮食(54％研磨小麦或24％研磨小麦+30％全麦)的AME的作用。

1饮食效果的单向偏差分析，n＝47；a，b时，上标相同的数值p都小于0.05。
2偏差的双向分析n＝47(小麦54％研磨或24％研磨+30％全麦；酶没有或加0.2l/t木聚糖)。
3FCR饲料转化率(g饲料g体重增加)表2.4在成长期的仔鸡中，酶制剂对54％小麦饮食的氨基酸表观消化率(％)的作用(每种处理取一份混合排泄物样品)


表2.5在成长期的仔鸡(n＝12)中，酶制剂对以小麦为主的饮食(54％研磨小麦)的磷(P)排泄和表观磷滞留的作用。

实施例3在成长的火鸡中评价酶制剂对以小麦为主的饮食的AMEN的作用该试验的目的是证明索状青霉菌酶制剂(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)对小麦为主饮食的表观可代谢能(AME)的作用。实验设计如下(1)对照；(2)EP1酶制剂(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)；(3)EP2酶制剂(β-葡聚糖酶活性150U.kg-1；木聚糖酶活性1650U.kg-1)；使用欧洲参考方法(Bourdillon等，1990)，放养，收集33日龄至37日龄的全部排泄物。
a.材料和方法禽品种和饲养条件1日龄的BUT9雄火鸡在养鸡棚中饲养到20日龄。将它们转移到单独的笼子中，适应至少7天后进行消化率结算。
使用标准温度与湿度。将光照条件保持为前2周，光照23小时，无光1小时；然后减少至光照15小时，无光9小时，直至实验结束。
饲料从第一天至第21天，火鸡接受的是标准完全起始饮食，然后给以实验饲料。
实验饮食饲料含47％小麦和33％大豆粉(表3.1)。在20kg对照饮食的颗粒上喷以酶。
可代谢能的测定在第21天，称量火鸡体重，均匀地分入单独的笼子，每种处理各10笼，然后饲以实验饮食。
按照以下程序，从第31天起开始结算第32天，火鸡通宵禁食；第33天，称重，清洁收集盘；第34天和第35天，收集粪便，冷冻；第36天，收集粪便，冷冻，通宵禁食；第37天，收集粪便，冷冻，称重，恢复喂食。
然后，将粪便冷冻干燥，象饲料一样磨碎(1mm，Retsch研磨机)。在IKA C5000绝热热量计上测定饲料和排泄物的粗能。
对AME进行N平衡校正，即将体重增加(g)和氮含量(21％粗蛋白)考虑在内。
然后，将粪便冷冻干燥，象饲料一样磨碎(1mm，Retsch研磨机)。在IKA C5000绝热热量计上测定饲料和排泄物的粗能。还测定了蛋白质(N*6.25，对饲料使用Kjeldahl法Z130，对粪便使用Z135法)，并用HPLC测定了氨基酸总体特征(对饲料使用Z100法，对粪便使用Z080法)。
b.结果与讨论表观可代谢能(AME)表3.2中是动物工艺学表现和可代谢能。不同的处理在结算期间，在成长表现上没有显著区别。
在成长的火鸡中，酶制剂将小麦饮食EP1和EP2的AMEN分别提高了2.2％和5.4％。
这一大幅改善证明酶制剂中的两种活性(木聚糖酶和β-葡聚糖酶)都能够水解小麦的非淀粉多糖，从而在成长的火鸡中提高谷类的能值。
表3.1实验饮食的主要成分和测试特征

表3.2在成长的火鸡(32至37天)中，酶制剂对小麦饮食经氮平衡校正的表观可代谢能(AMEN)的作用(平均值±SD)

1偏差的单向分析酶效n＝60，a，b所跟字母不同的平均值在p＜0.05时显著不同；量效0，0.2，0.3l/t。
2平均值±SEM实施例4在成长期猪中评价索状青霉菌所产酶制剂对以小麦为主的完全饲料的作用。
该实施例的目的是表明在以小麦为主的饲料中添加酶对成长期猪的小肠内能量消化的作用。酶制剂的标准活性水平是木聚糖酶1100U.kg-1，β-葡聚糖酶100U.kg-1。
a.材料和方法动物根据Latin方形设计对每种处理进行测试，用了3种饮食，3段时间，每段饮食2头猪。在整个测试期间，根据猪的体重，饲以恒定的饮食。
实验饮食给6头成长期的猪喂以以低质量的小麦为主以其它常用饲料成分补足的饮食(参见表4.1)。取以下方式之一饲以饮食1.不添加酶(基本)2.添加(1)添加1倍水平的酶制剂(β-葡聚糖酶活性100U.kg-1；木聚糖酶活性1100U.kg-1)；3.添加充(2)添加2倍水平的酶制剂(β-葡聚糖酶活性200U.kg-1；木聚糖酶活性2200U.kg-1)；先用玉米淀粉将酶制剂稀释成预混合物，然后加入适量的饮食中，由此精确控制饮食量。
样品的收集根据RPNA实验室的标准方法，每周收集48小时的回肠液。用Sanders弹式量热计测定回肠液样品和被测饮食的能量，测定可消化能。保存分成等份的样品，以备以后的测试。
统计学分析根据弹式量热计测得的回肠液、饲料的能量和饲料摄入量计算粗能量的消化率。对消化率计算进行偏差分析。
表4.1基本饮食的组分和营养素说明


b.结果与讨论在猪的饮食中添加木聚糖酶提高能量的消化率至少6％。这表明，酶加强了原料细胞壁(特别是小麦)的破坏，增加了小肠中能量的释放。
表4.2以小麦为主饲料添加酶制剂对给予成长期猪的饲料的能量消化率的作用。

实施例5在反刍动物中，索状青霉菌产酶制剂对稿草、谷草、干草和禾草饮食的作用HFT测试(Hohenheimer Futterwertesten，Menke等，1979，1988)是一种体外孵育试验，能够通过饲料在缓冲胃液中发酵产生的气体量测定原料的降解。
a.材料和方法在温控(39℃)培养箱内，在试管内，将200mg干燥并磨碎的底物与10ml胃液加20ml缓冲液一起孵育，旋转搅拌。第24小时时，记录产生的气体量。用空白(无底物)、标准干草对照和标准浓缩物对照(已知产生的气体净体积)来校正结果，计算24小时内产生的气体净体积。用24小时内产生的气体净体积和Menke等(1988)提出的预计方程式计算底物的能值和OMD(有机物消化率)。
收集2头牛的胃液，插胃管，在8a.m.和7pm喂以6kg干草和2kg浓缩物(75/25)。在上午喂食之前收集胃液。过滤胃液，不要让消化道内的颗粒物通过，将滤液保存在严格无氧条件下。
该实验的目的是测试HFT孵育前15小时酶制剂对饲料的作用。
酶制剂预处理在堆积在地的稿草、谷草、干草和禾草上喷以酶制剂。每2kg干饲料喷以1ml酶制剂。为了提高样品的一致性，弃去边缘(约10cm)的草料。处理后，手工拌和草料，喷洒后室温静置15小时。在同一系列中，与酶制剂接触的15小时后进行HFT孵育，每种处理重复6次。
b.结果与讨论表5.1给出了稿草、谷草、干草和禾草第24小时的产气净体积。
在预处理时给稿草使用纤维素酶使净产气体积比对照增加了18％。谷草的这一增加是8％，干草是9.5％，禾草是9％。
表5.2中是预处理前后不同草料的OMD。与对照相比，稿草、谷草、干草和禾草的OM消化率都分别有所提高稿草8.5％，谷草5％，干草5.4％，禾草5％。
酶制剂对草料(稿草、谷草、干草和禾草)15小时的预处理提高了胃内底物孵育的强度和底物的OM消化率。
表5.1第24小时的产气净体积

表5.2OMD

实施例6索状青霉菌产酶制剂对小麦或大麦喂养的蛋鸡的行为的作用该实验的目的是评价添加酶制剂对喂以小麦或大麦饲料的蛋鸡的生产力的作用。
a.材料与方法实验方案4种处理×8份重复×5笼×3只母鸡处理1.对照160％小麦2.对照1+酶制剂3.对照260％大麦4.对照2+酶制剂动物，饲养和管理对480只Hy-line种棕色母鸡进行实验。每次重复实验有共用同一食槽的5个笼子组成，也就是说，总共32次实验，每次15只母鸡。
重复实验分别在两个相同的房间内进行，光照和通风条件都相同。开始时，每天光照14小时，当17周龄时，每隔2周，光照延长30分钟，直到最多每天17小时光照。
母鸡在实验开始时为22周龄，持续至下蛋期的前5个月。
饮食和喂养有2种实验饮食，分别以60％小麦为主(饮食1)和60％大麦为主(饮食2)，并加有10％向日葵籽份。它们的组成见表6.1。谷物的特性见表6.2。
对照化学分析饲料样品通过对干物质、粗蛋白、粗脂肪和灰份的分析对实验饲料进行质量控制。
测定混合饲料的木聚糖酶活性(T-1，T-2)和β-葡聚糖酶活性(T-3，T-4)。
测定每4周记录一次饲料消耗和饲料效率。在实验开始和结束时称量母鸡的体重。在每4周的五个时段内，每天记录产蛋数，鸡蛋重量，脏蛋和坏蛋的百分比。每天核对和记录死亡率，并记录死亡原因。
b.结果与讨论表现实验表6.3至6.5列出了实验期间获得的生产参数。在前2段时间(22周至30周)，和在整个实验过程中，从统计学上看，脏蛋的百分比受处理方式的影响(p＞0.005)。喂以无酶小麦饲料的母鸡生产的脏蛋较多。从第二时段至实验结束，不同的处理在产蛋百分比和蛋重方面有统计学上的显著差异，P分别大于0.05和0.005。与饲以小麦的母鸡相比，饲以大麦的母鸡产蛋百分比更高，所产鸡蛋更重。酶制剂似乎能改善这些参数，但是并不明显，几率为0.05。
在整个实验期间，T-3和T-4处理(大麦饮食)的动物的饲料摄入量高于饲以小麦的动物，这是因为两种饲料的能量水平(大麦饮食的能量被配制成2600kcal/kg，小麦饮食配制成2800kcal/kg)。考虑到两种饮食的能值和动物饲料消耗率的差异，全过程中，所有动物具有相同的日能耗。
第一时段中，实验饮食的饲料效率(表示为g饲料/g蛋)很高，因为这段时间内母鸡的产蛋率低。在前两个时段内，小麦饲养的饲料效率优于大麦；但在产蛋率最高的第三时段，两种饲料的效率相近。从第34周至实验结束，大麦的饲料效率优于小麦。酶能够改善饲料效率(P＞0.05)。全过程中，β-葡聚糖酶改善大麦饮食的饲料效率(P＝0.066)。
表6.4显示，与无添加酶的相比，添加了酶制剂的小麦喂养蛋鸡产蛋率更高(1.5绝对百分点)，蛋更重(+0.37g)，饲料转化率更低(-2.7％)。
表6.5显示，与对照大麦饲料相比，给大麦喂养的蛋鸡增加酶制剂改善了产蛋率(+4％)，平均蛋重量(+0.7％)和饲料转化率(-5.7％)。
表6.1实验蛋鸡饮食的组成


(*)1kg饲料包含维生素A8000UI；维生素D31600UI；维生素E5mg；维生素K32mg；维生素B11.5mg；维生素B23mg；维生素B1211.8μg；叶酸0.35mg；生物素150μg；泛酸钙10mg；烟酸20mg；Mn30mg；Zn50mg；I0.3mg；Fe50mg；Cu6mg；Se0.1mg；etoxiquin125mg。
表6.2谷类的分析组成

表6.322周到24周的生产参数(完全实验方案)

1.与一只遗传性状优良的母鸡进行了比较。(数值由母鸡提供者提供)数值是每次15只母鸡的8次重复实验的平均值。各栏中，不同上标的平均值具有显著差异(p＜0.05)。
表6.4木聚糖对小麦喂养的蛋鸡的产蛋表现的影响(表示为与对照相比的绝对值1和百分比2)

3.22-42周期间表6.5酶制剂对大麦喂养的蛋鸡产蛋表现的作用(表示为与对照相比的绝对值1和百分比2)

3.22-42周期间著录Bourdillon A.，Carre B.，Conan L.，Duperray J.，Franscesch M.，Fuentes M.，Huyghebaert G.，Jansen W.M.M.A.，Leclercq B.，Lessire M.，McNab J.，Rigoni M.，Wiseman J.，1990.
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Sabatier A.M.，Fish N.M.，1996.饲料酶的分析方法方法学问题？Journal ofApplied Poultry Research 5，408-413。
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权利要求
1.一种含酶制剂，它是由根据布达佩斯条约保藏于国际微生物研究所，保藏号IMI378536的索状青霉菌产生的，所述制剂包含木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
2.一种液体组合物，包含作为全部有机固体物质的索状青霉菌IMI378536发酵产物 4％-10％抗微生物剂0.005-0.35％山梨醇20％-50％抗冻剂0-40％发酵液过滤后的浓缩液 0.3％-76％用缓冲液调节至pH3-5。
3.如权利要求2所述的液体组合物，所述抗微生物剂选自山梨酸和盐，苯甲酸和盐，4-羟基苯甲酸甲酯和4-羟基苯甲酸正丙酯，富马酸、盐和酯，氯化钠或氯化钾。
4.如权利要求2所述的液体组合物，其中的抗冻剂选自1，2-丙二醇，乙二醇或甘油。
5.如权利要求2所述液体组合物用于饲养家禽或家畜的用途。
6.一种粉末组合物，包含作为全部有机固体物质的索状青霉菌IMI378536发酵产物16％-40％载体 59％-83％干燥的其它发酵液组分 1％
7.如权利要求6所述的粉末组合物，其中的载体选自小麦面粉，淀粉，生石膏，麦芽糊精，玉米浆，玉米渣、小麦渣，小麦麸皮，黑麦渣。
8.如权利要求6所述粉末组合物用来饲养家禽或家畜的用途。
9.如权利要求5或8所述的用途，所述家禽或家畜选自禽、猪或反刍动物。
10.如权利要求5或8所述的用途，是提高饲料的消化率，所述饲料选自谷类，产油种子或谷类副产物。
11.根据权利要求10所述的用途，所述谷类选自小麦、大麦、黑麦、黑小麦、燕麦或稻米；所述产油种子选自大豆、向日葵籽或油菜籽；所述谷类副产物是小麦麸皮。
12.根据权利要求8所述的用途，是提高饲料中磷和氨基酸的消化率。
全文摘要
本发明涉及新的微生物，索状青霉菌，涉及由其获得的新的酶混合物，还涉及这些酶的核酸序列。
文档编号C12N9/46GK1944639SQ20061010039
公开日2007年4月11日 申请日期1999年5月6日 优先权日1998年5月6日
发明者A·萨巴捷, N·M·菲什, N·P·黑格 申请人:安迪苏法国联合股份有限公司