专利名称：一种快速红细胞冻存和解冻方法及其使用的冰冻保护液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实验用试剂红细胞的长期保存技术。
背景技术：
现有技术均是将红细胞先悬浮在高渗透压冻存保护液中，其中主要有效成分是甘油或葡萄糖。
例如Meryman液57％甘油，3％乳酸钠，0.2％Na2HPO4，0.03％KCl。
Huggins液79％甘油，8％葡萄糖，1％果糖，0.3％EDTA-2Na。
Krijnen液35％甘油，2.9％山梨醇，0.63％NaCl。
Valeri液35％甘油，2.88％甘露醇，0.65％NaCl。
其工作原理是让高渗透压甘油渗入红细胞内部，置换出其中的水份，从而减少在冻存过程中红细胞内外冰晶的形成，保护红细胞不被破坏。在红细胞解冻的过程中，由于红细胞内部的高渗状态，必须通过逐步降低红细胞解冻液渗透压的方法，将红细胞内部的甘油或葡萄糖重新置换出来，以防止红细胞内部渗透压相对过高而造成的红细胞涨破。整个过程需要2-3小时左右。红细胞的回收率大约在70％-85％。如果将冰冻红细胞直接置于等渗的溶液中解冻，则红细胞将基本完全溶血。
这种将红细胞先悬浮在高渗透压冻存保护液中再重新置换的方法，其主要缺点是过程比较复杂，且耗时。
例如Meryman液保存方法在1单位红细胞(约50ml)中加入160ml甘油保护剂，20分钟加完，室温放置30分钟后，直接放入-80℃冰箱。解冻时先在37-40℃快速融化，离心去除甘油，10分钟内缓慢加入9％高渗NaCl溶液80ml，静置3分钟后加入300ml羟乙基淀粉，混匀后，离心10分钟去上清，再加入150ml羟乙基淀粉和100ml生理盐水，1500g离心10分钟。去上清，加200ml生理盐水，1500g离心10分钟。去上清。冰冻和溶解洗涤总耗时约3.5小时。红细胞回收率约85％。
Huggins液保存方法冷冻方法同上。解冻方法使用和红细胞等体积(50ml左右)的50％葡萄糖溶液和1000ml5％果糖，离心10分钟。去上清，再加入5％果糖500ml，混匀后离心10分钟。去上清。同样方法再洗涤1-2次，至上清液中无明显溶血。耗时和回收率大体同上。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的长期冰冻保存红细胞的方法，该方法解决了现有试剂红细胞冻存技术繁琐、耗时等问题。
本发明的目的之二是提供一种与上述冰冻保存红细胞的方法相适应的红细胞解冻方法。
同时，本发明还提供了上述方法所使用的红细胞冰冻保护液和解冻液。
本发明利用等渗的保存液，加入高浓度大分子胶体介质，配置成红细胞冰冻保护液。该冰冻保护液悬浮红细胞时，不会使红细胞内外出现高渗状态。在随后的解冻过程中，利用和冻存保护液类似的溶液快速融化红细胞，然后通过生理盐水洗涤去除大分子胶体物质，即可以得到红细胞盐水悬液，用于相关试验，整个冻融过程大约15分钟。红细胞的得率可达到80％以上。
本发明具体的技术方案是一种红细胞冰冻保护液/解冻液，由基本等渗的溶液和具有生物相容性的大分子物质组成，其中基本等渗的溶液渗透压在250-400mOsm/L，大分子物质的分子量在20000-400000之间，浓度为15-40％。
上述基本等渗的溶液可以是市售的各种试剂红细胞保存液，也可以根据试剂红细胞保存液的配方自行配置，渗透压要求在250-400mOsm/L(毫渗)范围内(血浆的渗透压约为313mOsm/L，约相当于7个大气压或5330毫米汞柱)。例如下述的柠檬酸缓冲液柠檬酸0.8％、氯化钠0.4％、葡萄糖1.8％。
上述的大分子物质包括聚乙烯基吡咯烷酮40T(PVP)、右旋糖苷或白蛋白等，要求分子量在20000-400000之间。
一种快速红细胞冻存方法，首先将新鲜红细胞洗涤压积，然后取上述的红细胞冰冻保护液配成体积浓度为50％或以下的红细胞悬液，混匀后用滴管滴入液氮中。然后可在液氮或-80℃保存。
上述快速冻存红细胞的解冻方法，在液氮中取出冰冻红细胞小球，立即放入上述的解冻液中，待红细胞完全融化后加入解冻液1倍或以上体积量的生理盐水离心洗涤红细胞，去除离心上清液后，将压积红细胞直接配制成红细胞盐水悬液即可。
本发明和现有方法的最大区别在于冰冻保护液的成份。冰冻保护液即红细胞在冰冻时所处的液体，其作用在于保护悬浮于其中的红细胞不受冰冻过程的伤害。本发明的冰冻保护液中没有使用高浓度的甘油、葡萄糖等药品，因此不会在红细胞内部或/和外部造成高渗透压的环境。本发明所用的冰冻保护液含有基本等渗的柠檬酸缓冲液加大分子物质。
本发明的第二个特点在于解冻方法。在解冻过程中，直接将冰冻红细胞置于解冻液(成份同冰冻保护液，20-50℃)中，待红细胞完全解冻，加入倍量或更多的盐水离心洗涤红细胞，去除离心上清液后，将压积红细胞直接配制成红细胞盐水悬液即完成解冻过程。
试剂红细胞属于珍稀资源，在输血领域有着十分重要的作用。免疫血液学试验的水平高低，在很大程度上依赖试剂红细胞品种的多少和质量的高低。但由于保存和溶解方法复杂，耗时，使得临床发现的许多珍稀红细胞资源难以得到有效的保存和充分的利用。本发明使得稀有试剂红细胞资源的保存和应用变得十分方便，快捷。因此将有效的提高稀有红细胞资源的利用率，节约试验时间，进而间接提高免疫血液学试验的水平，对输血的有效性和安全性的提高以及血液免疫学研究提供有力的支持。
图1是不同浓度右旋糖苷冻融液和对照冻融保护液的效果比较图具体实施方式
以下试验比较了不同浓度的右旋糖苷和柠檬酸缓冲液以及经典冰冻保护液之间的比较。方法均为快速液氮冻存和快速解冻法，将新鲜红细胞洗涤压积后，各取0.5ml用不同冰冻保护液配成50％红细胞悬液，混匀后滴入液氮中，放置2分钟左右，取出冰冻红细胞小球，立即放入相应解冻液中，用吸管吹打混匀，待红细胞完全融化，第一次离心，取上清液待测；去尽上清液后加入生理盐水，混匀，室温放置1小时，第二次离心，取上清液待测。去尽第二次离心上清液，在剩余压积细胞中加盐水至1ml，使用COULTER血细胞分析仪计算剩余回收红细胞占原始红细胞的百分比。第一次和第二次离心上清液用多功能分光光度计检测540nm光吸收值，对照标准曲线将上清液中的血红蛋白量换算成红细胞浓度。
实施例1～6所用的冰冻保护液/解冻液为柠檬酸缓冲液柠檬酸0.8％、氯化钠0.4％、葡萄糖1.8％；再加入右旋糖苷(40T)。各实施例中红细胞保存液中分别加入10％、15％、20％、25％、30％、40％的右旋糖苷(40T)。
对比例“经典方法对照”使用Valeri液，配方见前文。
结果见下图，“解冻后溶血％”即第一次离心上清液中血红蛋白换算成红细胞后，占初始红细胞的百分比，“盐水悬浮1小时后溶血％”即第二次离心上清液中血红蛋白换算成红细胞后，占初始红细胞的百分比。可见，当右旋糖苷浓度在15％-40％时其冻融红细胞的效果均好于对照。红细胞的最高回收率可达80％左右，而同样操作条件下，柠檬酸缓冲液和经典冰冻保护液的红细胞回收率仅为45％-65％。因此本方法在快速冻融条件下，效果明显好于现用方法。
权利要求
1.一种红细胞冰冻保护液/解冻液，由基本等渗的溶液和具有生物相容性的大分子物质组成，其中基本等渗的溶液渗透压在250-400mOsm/L，大分子物质的分子量在20000-400000之间，浓度为15-40％。
2.如权利要求1所述的红细胞冰冻保护液/解冻液，其特征在于基本等渗的溶液是下述的柠檬酸缓冲液柠檬酸0.8％、氯化钠0.4％、葡萄糖1.8％。
3.如权利要求1所述的红细胞冰冻保护液/解冻液，其特征在于所说的大分子物质为聚乙烯基吡咯烷酮、右旋糖苷或白蛋白。
4.一种快速红细胞冻存方法，该方法是首先将新鲜红细胞洗涤压积，然后取权利要求1～3所述的任一红细胞冰冻保护液配成体积比为50％或以下的红细胞悬液，混匀后滴入-80℃以下的环境中保存。
5.一种快速冻存红细胞的解冻方法，该方法是取出冰冻红细胞，立即放入权利要求1～3所述的任一红细胞冰冻保护液/解冻液中，待红细胞完全融化后加入解冻液1倍或以上体积量的生理盐水离心洗涤红细胞，去除离心上清液后，将压积红细胞直接配制成红细胞盐水悬液即可。
全文摘要
本发明涉及一种实验用试剂红细胞的长期保存技术。本发明所述的红细胞冰冻保护液/解冻液，由基本等渗的溶液和具有生物相容性的大分子物质组成，其中基本等渗的溶液渗透压在250－400mOsm/L，大分子物质的分子量在20000－400000之间，浓度为15－40％。本发明利用等渗的保存液，加入高浓度大分子胶体介质，配置成红细胞冰冻保护液不会使红细胞内外出现高渗状态。在随后的解冻过程中，利用和冻存保护液类似的溶液快速融化红细胞，然后通过生理盐水洗涤去除大分子物质，即可以得到红细胞盐水悬液。用于相关试验，整个冻融过程大约15分钟，红细胞的得率可达到80％以上。
文档编号C12N5/08GK1935989SQ20061011721
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月17日 优先权日2006年10月17日
发明者向东 申请人:上海市血液中心