专利名称：一种rna等温转录扩增检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及RNA扩增检测技术的改进。
背景技术：
在核酸检测过程中，许多情况下样品中待测核酸含量比较低，为了能便检测达到一定的灵敏度和准确度，需要对样品中的待测核酸片段进行有效扩增。自1985年美国Cetus公司和加利福利亚大学联合创造了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)以来，大大推动了核酸检测技术乃至整个分子生物学技术的发展，并日渐成为核酸检测技术中的重要手段，也同时成为现代分子生物学技术的基础。随后，又衍生出了诸如逆转录酶—聚合酶链反应(Reverse Transcriptase-PCR，简称RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real Time Fluorescent Quantified PCR)等一系列核酸扩增检测方法，可用于核酸样品的扩增及其定性定量检测。由于扩增过程的误差往往直接影响到核酸检测的结果，因此，后续的扩增子(即核酸扩增反应中的扩增产物)检测过程就显得尤为重要。目前，大多数核酸检测方法都是按“基因扩增+扩增子检测”的模式操作，传统的“基因扩增+电泳”检测方法还被广泛应用。此外，由于PCR方法在实际应用中易引起非特异性扩增，实验前后也容易受到环境中其他外源核酸的污染，因此常造成实验结果和假阳性或假阴性现象，这样使得该技术的实际应用尤其是临床检测受到很大的局限性。实时荧光定量PCR虽然在技术上有了很大的改进，检测反应也达到了定量化，但其昂贵的设备及高成本的检测试剂，阻碍了大规模的推广与运用。
1991年Compton提出了基于核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid SequenceBased Amplification，简称NASBA)(Nature，350(6313)91-92，1991)，为基因扩增技术提出了新的概念。这项技术特别适用于RNA分子的检测。其特点是整个扩增过程在恒温条件下进行，因此不需要特殊的控温装置(如PCR仪)，大大避免了PCR扩增过程中复杂的温度变化。该技术使用3种酶(逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶)以及2条特别设计的寡核苷酸引物，通过单向的等温扩增，短时间内形成相当于原RNA拷贝数近百万倍的RNA扩增子。NASBA是一种连续扩增技术，并不像PCR需要实时退火(real-time annealing)，所以在同一时间内，NASBA拥有比PCR更高的扩增效率。此外，有很多因素会影响PCR反应，如一些PCR抑制物质(特别在取样过程中)，NASBA技术却不会受这些因素的影响，而且即使在有DNA污染或存在的情况下，同样具有较高的特异性和灵敏度。该技术已成功应用于病毒、细菌、霉菌、寄生虫和细胞因子等的检测，如人类艾滋病病毒1型、丙型肝炎病毒、EB病毒、麻疹、带状疱疹、人类乳头瘤状病毒16型、沙门氏菌、沙眼衣原体、麻风分支杆菌、念珠菌、曲霉菌、疟原虫、编码巨噬细胞来源的趋化因子，组织因子和人抗肿瘤坏死因子alpha等的mRNA。因此，NASBA作为一项检测技术是十分成熟的，并且已经在国际上受到基础科学研究和应用研究领域的一致认可。目前NASBA等温扩增子常采用电泳、探针杂交、点杂交等方法来完成定性检测。
1997年，Gen-Probe公司也开发了与基于核酸序列扩增原理类似的转录介导的扩增技术(Transcription Mediated Amplification，简称TMA)(Journal ofClinical Microbiology，35(3)，676-678，1997)，其与NASBA的核酸扩增方法原理相同，而TMA的扩增结果是通过杂交保护测定(Hybridization ProtectionAssay，简称HPA)技术进行定性检测，目前Gen-Probe公司利用此技术开发了沙眼衣原体和结核杆菌检测试剂盒。
2000年，NotomiT等发明了一种体外恒温核酸扩增方法，即所谓的环介导的等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)(Nucleic.Acids.Res.，2000，2863)。其特点是针对靶基因(DNA、cDNA)的6个区域，设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)在恒温(65℃左右)中1h，即可完成核酸扩增反应，反应结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，而不需模板热变性、长时间温度循环、凝胶电泳、紫外观察等过程。目前该技术已应用于动物胚胎性别鉴定、细菌和病毒检测。
无论是NASBA技术、TMA技术还是LAMP技术，都在方法上采用等温扩增，改善了PCR技术中的非特异性扩增的难题，提高了反应速率，而且反应该过程保持等温，无需依赖PCR热循环仪，仅用普通加热器或水浴即可，这样能降低检测成本。但就目前的发展趋势来看，NASBA、TMA以及LAMP技术操作较为繁琐或需要昂贵检测仪器，同时尚无法达到定量检测程度。此外，TMA方法中所需的实验材料，尤其是反应中的混合酶需特殊处理，属非开放型专用试剂，检测成本相对较高。此外，NASBA技术中所使用的鸟成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶必须是特定生产商生产，而且须在-70℃储存，使用有效期较短，因此操作条件较为苛刻，技术推广亦受到限制。
目前，实验室研究及临床检测中常用的RNA定量检测方法主要是以实时荧光定量RT-PCR为主，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线进行定量分析。其荧光检测模式分为TaqMan荧光探针、TaqMan MGB荧光探针(在荧光探针分子3’端连接非荧光淬灭剂及MGB基因——Minor Groove Binder，也称为MGB探针)、SYBR Green荧光染料、分子信标(Molecular Beacon)探针和荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，简称FRET)探针等。实时荧光定量RT-PCR方法虽然灵敏度和准确度较高，但也存在操作繁琐、需要昂贵的荧光PCR仪设备等局限性，不能满足快速分子诊断、家庭床边检测或者野外现场检测等发展的需要。
发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种RNA等温转录扩增和纳米金探针检测方法(Nucleic Acid Isothermal and Transcriptional Amplification with GoldNano-particle Probes，简称NITAG)及其试剂盒，以克服NASBA、TMA以及LAMP等方法操作较为繁琐或需要昂贵检测仪器，同时尚无法达到定量检测程度的不足，并且检测方便。TMA方法中所需的实验材料，尤其是反应中的混合酶需特殊处理，属非开放型专用试剂，检测成本相对较高；NASBA技术中所使用的鸟成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶必须是特定生产商生产，而且须在-70℃储存，使用有效期较短，操作条件较为苛刻，技术推广受到限制；实时荧光定量PCR方法检测成本相对昂贵，检测过程需依赖特殊设备，在操作方法和检测成本上都存在局限性，不适于作为快速分子诊断技术推广的缺陷。
技术方案发明构思本发明所提供的NITAG检测方法是一种特异性等温扩增和检测核酸的方法，它的原理是利用一种多酶复合体所具有的反逆转录酶、核糖核酸酶H(RNase H)和依赖DNA的RNA聚合酶活性，在体外等温扩增获得大量RNA拷贝，然后纳米金标记的寡核苷酸探针和这些RNA扩增子中的靶序列杂交形成伸展的金纳米颗粒-多核苷酸的多聚网络结构，由此引发纳米金粒子光学性质的变化，产生杂交信号以杂交液/微孔板/试纸颜色变化显示，存在相互作用的杂交液/板/试纸显示为蓝色，没有作用的显示为红色。
本发明的技术方案之一是提供一种RNA等温转录扩增检测方法，步骤依次包括(1)RNA模板在60～70℃下解链后降温；(2)加入逆转录酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶和核糖核酸酶，在引物的引导下37～42℃于进行等温扩增，获得RNA扩增子；(3)利用寡核苷酸标记的纳米金探针检测RNA扩增子，通过显色反应获得检测结果。
上述的RNA等温转录扩增检测方法的优选方案之一为，所说的步骤(2)中的引物为I)与步骤(1)所说的RNA模板特异性配对的5’端带有启动子的负链引物I；和II)与上述负链引物I引导合成的DNA负链3’端特异性配对的正链引物II。
上述的RNA等温转录扩增检测方法的优选方案之二为，所说的步骤(2)中的反应过程为(a)以RNA为模板，在逆转录酶催化下，通过负链引物I的引导制备RNA-DNA杂链分子I；(b)在核糖核酸酶H催化下水解RNA-DNA杂链分子I，制备单链的DNA负链；(c)以负链DNA为模板，在正链引物II引导下和逆转录酶催化下制备双链DNA；(d)以双链DNA为模板，在启动子引导下和RNA聚合酶催化下转录制备RNA扩增子；(e)以RNA扩增子为模板，在正链引物II引导下和逆转录酶催化下制备RNA-DNA杂链分子II；(f)在核糖核酸酶H催化下水解RNA-DNA杂链分子II，制备单链的DNA正链；(g)以正链DNA为模板，在负链引物I引导下和DNA聚合酶催化下制备双链DNA；(h)循环重复步骤(d)～步骤(g)使RNA获得扩增。
上述的RNA等温转录扩增检测方法的优选方案之三为，所说的步骤(1)的解链温度为65℃，降温到37～42℃；所说的步骤(2)的扩增温度为40～41℃。
上述的RNA等温转录扩增检测方法的优选方案之四为，所说的逆转录酶为鸟成髓细胞瘤病毒逆转录酶或鼠白血病病毒逆转录酶；所说的RNA聚合酶为T3 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶。更优选地，所说的T3 RNA聚合酶所识别的特异性启动子序列为5’AAT TCA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G 3’；所说的T7RNA聚合酶所识别的特异性启动子序列为5’AAT TCT AAT ACGACT CAC TAT AGG G 3’。
上述的RNA等温转录扩增检测方法的优选方案之五为，所用的纳米金的粒径为1～100nm。
上述的RNA等温转录扩增检测方法的优选方案之六为，纳米金颗粒上的寡核苷酸探针长度为10～100bp，且连接前经过巯基化或烷巯基化处理。
上述的RNA等温转录扩增检测方法的优选方案之七为，所说的显色反应为溶液杂交显色、纸基斑点显色或微孔板比色。
本发明的技术方案之二是提供一种利用上述检测方法进行RNA等温转录扩增的检测试剂盒，其组成包括反应缓冲液、引物I和引物II、逆转录酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、核糖核酸酶和寡核苷酸标记的纳米金探针。组装形成的试剂盒在-20℃下保存。
具体而言，本发明是通过以下方式实现的本发明的RNA等温转录扩增和纳米金探针检测技术包括样本处理、RNA等温扩增以及纳米金探针检测三个步骤。样本处理步骤是从组织、细胞或微生物病原体等待检样品中提取RNA模板的过程，扩增检测对象是从样本中提取获得的RNA模板，样本包括组织、细胞或者微生物。利用提取获得的RNA模板经过逆转录酶、核糖核酸酶H(RNase H)、RNA聚合酶(RNA Pol)等温扩增出的大量RNA扩增子，并结合烷巯基化寡核苷酸标记的纳米金探针检测，通过显色反应实现对RNA模板的检测。
本发明的等温扩增体系包括RNA模板、引物及缓冲液等组成，其具体操作为将待测标本提取的RNA置入反应缓冲液，在60～70(最优选65)℃和37～42(最优选41)℃下先后处理5分钟，加入混合酶，在37～42(最优选41)℃下反应120分钟，再将扩增产物与纳米金-寡核苷酸检测探针缓冲液混合，在65℃处理5min后冷却显色。
本发明的等温扩增反应缓冲液各组分的终浓度为20～60mM Tris-HCl(pH8.0～9.0)、30～90mM KCl、10～20mM MgCl2、0.5～5mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、1～10mM核糖核苷三磷酸(NTPs)、4～20mM二硫苏糖醇(DTT)、10～20％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)；所说的两种引物(包括带有RNA聚合酶启动子识别序列的引物I和第二链cDNA合成引物II)终浓度各为O.1～1μM；所说的混合酶液各组分在20μL反应体系中的量为4～75U逆转录酶、8～3000U RNA聚合酶(识别特异启动子序列的T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶)、1～10U DNA聚合酶(可以采用Taq DNA聚合酶)、0.05～0.3U RNase H酶、10～50U RNA酶抑制剂(RNasin Inhibitor)和0.05～5μg小牛血清白蛋白(BSA)。所说的检测反应缓冲液各组分的终浓度为0.01～1.0％氯金酸(HAuCl4·4H2O)、0.3mol/L NaCl，10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，纳米金探针终浓度为10pmol/μL。
本发明所用的纳米金颗粒大小为1～100nm，按照粒径不同可以采用柠檬酸三钠还原法、白磷还原法或者抗坏血酸还原法。
本发明所述纳米金-寡核苷酸检测探针的制备过程为
(1)纳米金颗粒的制备在煮沸搅拌HAuCl4溶液(1mM，500mL)回流的情况下，迅速加入50mL 38.8mM柠檬酸三钠溶液，溶液的颜色将由灰黄变为探红，继续回流15min，然后冷却至室温，最后用0.45μM的膜进行过滤，即得到约13nm粒径的金颗粒。这种胶态金具有518～520nm处的特征表面等离子体吸收带。纳米金颗粒上的寡核苷酸探针长度为10～100bp，连接前需要先经过巯基化或烷巯基化处理并纯化。
(2)烷巯基化寡核苷酸探针的合成与纯化3’端烷琉基化寡核苷酸探针采用1一巯基丙烷修饰的C3 S-S CPG固相合成柱，用标准的亚磷酰胺化学合成方法在DNA合成仪上进行合成，合成规模为1μmol，为进行纯化，不必脱去合成后的DMT(4，4-双甲氧基三苯基甲烷)保护基团，合成结束后，将反应柱置于1mL浓氨水中在55℃孵育16h，将寡核苷酸探针从反应柱上切割下来，同时也除去了碱基上的保护基团。通过琥珀酰乙酯的作用可得到修饰有巯基丙烷的寡核苷酸探针和巯基丙烷连接臂的混合物，蒸发除去氨水，然后用反向HPLC对被修饰的寡核苷酸探针进行纯化，最后通过将纯化的探针在80％的乙酸中溶解30min除去DMT(4，4-双甲氧基三苯基甲烷)。5’末端烷巯基化修饰寡核苷酸探针是先合成碱基序列，然后用手工方法进行标记，其制备过程包括如下几步①CPG固相支持柱在DNA合成仪上合成设计序列的寡核苷酸；②取下反应柱并将一注射器固定在反应柱的一端；③将一定浓度的5’巯基修饰磷酸亚酰胺的无水乙氰溶液和一定量标准“四唑激活剂”溶液相混合，并用注射器将混合溶液从寡核苷酸一CPG反应柱的另一端注人，将反应液来回推压约10min，最后用无水乙氰清洗出反应柱；④脱去所有的保护基团并用反向HPLC对5’修饰有烷琉基的寡核苷酸探针进行纯化。
(3)3’或5’烷巯基标记的在Au纳米颗粒上的修饰取纳米金溶液5mL(约17nm)2.5OD和烷基寡核苷酸探针(终浓度3.61μm)混合并孵育16小时左右，然后将混合溶液置于0.1mol/L NaCl，10mm磷酸盐缓冲液中并保持40小时，接下来在1400r/min至少离心25min以除去未反应的试剂。除去上清液，剩余的红色油状沉淀再用缓冲液清洗，离心后保存在0.3mol/L NaCl，10mm磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，探针终浓度为10pmol/μL。通过红外光谱的测定证明，每个金颗粒表面被修饰了许多探针，因此才有可能在多核苷酸检测过程中形成聚合网络结构。
本发明检测过程中的显色反应为溶液杂交显色、纸基斑点显色或微孔板比色。溶液杂交显色法即将等温扩增产物10μL(约10pmol)加入至含有20μL纳米金-烷巯基化寡核苷酸探针的1.5mL离心管中，室温孵育15min，然后将混合溶液置于恒温水浴槽中并将其加热到65℃，将混合物平衡5min，杂交后形成纳米金探针/核酸复合液，颜色变为红紫色或紫色；纸基斑点显色法为将杂交液(纳米金探针/核酸复合液)滴至C18薄层层析片或玻片上进行观察，开始斑点呈现液态杂交时的红紫色或紫色，当斑点干了以后，如果纳米金探针与靶序列杂交，会形成蓝色的斑点，如果检测体系中无靶序列存在或在热变性的条件下点滴，干后斑点呈现的是粉红色；微孔板比色除了将等温扩增产物和纳米金-烷巯基化寡核苷酸探针溶液置于微孔板，并通过读板机进行比色读数之外，其余同溶液杂交显色方法。
有益效果本发明采用以RNA为模板，基于转录反应的等温扩增技术在体外扩增获得RNA扩增子，采用特异性的纳米金探针层析杂交检测，结果以杂交反应液/微孔板/试纸条的颜色反应来表征。其特点在于1.检测限本发明所提供的检测方法和试剂盒的检测下限经RNA标准品测试，可达10个拷贝RNA分子。
2.特异性本发明的纳米金探针检测方法同TMA技术的检测结果比较其特异性达到100％。
3.等温除RNA分子变性需要高温处理外，扩增反应在同一温度保温即可，保温范围较宽，无需特殊仪器。
4.试剂盒保存条件无需超低温冷冻，可在-20℃条件下保存运输。
5.简单快速检测过程经过核酸样品处理、加入反应液加温、降温加入混合酶保温、显色反应获得结果，仅需2-3小时，且操作简捷。
6.技术成本与实时荧光RT-PCR检测相比，无需特别的荧光检测仪或荧光PCR仪，检测成本大大降低，易于推广。
本发明的上述有益效果是等温扩增和纳米金探针的组合应用所直接带来的。从原理上说，等温扩增和纳米金探针均能放大检测信号，等温扩增放大的是RNA分子的拷贝数，纳米金探针放大的是显色信号，所以比NASBA技术、TMA技术和LAMP技术更灵敏，使实际应用于微量RNA检测成为可能；由于扩增过程中没有大量性质稳定的双链DNA产生，因此比PCR检测能更好地排除扩增片断的污染所带来的假阳性对检测结果的影响；作为核酸快速检测的手段，本发明的技术方案设计合理，在分子水平上证明临床样品或食品安全中病原微生物的存在，可应用于临床诊断、卫生检疫、环境监测等领域，具有广泛的应用前景与开发价值。
图1为NITAG检测技术原理示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中所涉及的主要试剂说明AMV(鸟成髓细胞病毒)逆转录酶(美国Promega公司)RNase H(核糖核酸酶H)(日本TAKARA公司)T3/T7 RNA聚合酶(美国Promega公司)Taq DNA聚合酶(日本TAKARA公司)Tris-HCl缓冲液(实验室配制)DTT(二硫苏糖醇)(美国Promega公司)DMSO(二甲基亚砜)(美国Sigma公司)BSA(小牛血清白蛋白)(美国Sigma公司)dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸混合液)(美国Promega公司)
NTPs(核糖核苷三磷酸混合液)(美国Promega公司)RNasin Inhibitor(RNA酶抑制剂)(日本TAKARA公司)柠檬酸三钠(上海生工)HAuCl4·4H2O(氯金酸)(上海国药)Trizol试剂(美国Invitrogen公司生产)引物(包括RNA聚合酶启动子识别序列)以及烷巯基化寡核苷酸探针(均由上海生工合成)实施例1RNA样本的NITAG检测以下通过介绍丙型肝炎病毒(HCV)RNA样本的检测来举例说明本发明的实施。
取100μL HCV临床血清阳性样本，按Trizol(美国Invitrogen公司)试剂说明书提取HCV RNA样品。
引物探针的设计根据文献报道以及HCV核苷酸序列比对，以保守性比较高的5′-UTR区域设计等温扩增引物以及烷巯基化寡核苷酸探针，上游引物5’-GAG TGT CGT GCA GCC TCC A-3’，下游引物5’-AAT TCT AAT ACGACT CAC TAT AGG GCAC TCG CAA GCA CCC TAT CA-3’，其中下划线为能被T7 RNA聚合酶识别的启动子序列；5’端己烷巯基化寡核苷酸探针5’-HS-(CH2)6-[TAC ACC GGA ATT GCC AGG ACG AC]-3’；3’端己烷巯基化寡核苷酸探针5’-[TGG GTC GCG AAA GGC CTT GTG G]-(CH2)6-SH-3’。引物和烷巯基化寡核苷酸探针均由上海生工合成。
HCV-纳米金烷巯基化寡核苷酸探针制备①纳米金的制备在煮沸搅拌HAuCl4溶液(1mM，500mL)并回流的情况下，迅速加入50mL，38.8mM的柠檬酸三钠，溶液的颜色将由灰黄变为探红，继续回流15min，然后冷却至室温，最后用0 45μM的膜进行过滤，即得到约13nm粒径的纳米金颗粒。②烷巯基化寡核苷酸探针的合成与纯化(均由上海生工合成)。③3’或5’端烷巯基在纳米金颗粒上的标记取纳米金溶液5mL(约17nm)2.5OD和烷基寡核苷酸探针(终浓度3.61μm)混合并孵育16小时左右，然后将混合溶液置于0.1mol/L NaCl，10mm磷酸盐缓冲液中并保持40小时，接下来在1400r/min至少离心25min以除去未反应的试剂。除去上清液，剩余的红色油状沉淀再用缓冲液清洗，离心后保存在0.3mol/L NaCl，10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，探针终浓度为10pmol/μL。
配制10μL等温扩增反应体系缓冲液[80mM Tris-HCl(pH8.3)、70mMKCl、24mM MgCl2、2mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、4mM核糖核苷三磷酸(NTPs)、10mM二硫苏糖醇(DTT)、30％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)、两种引物浓度各为0.8μM]；配制5μL混合酶液[6.4U AMV逆转录酶、32U T7RNA聚合酶、0.08U RNase H酶、20U RNA酶抑制剂(RNasin Inhibitor)和2.1μg小牛血清白蛋白(BSA)。
核酸等温转录扩增和纳米金探针检测取5μL的HCV RNA样本置入10μL等温扩增反应体系缓冲液，在65℃和41℃下先后处理5分钟，加入5μL混合酶液，在41℃下反应120分钟；取10μL等温扩增产物加入至含有20μL纳米金-烷巯基化寡核苷酸探针的1.5mL离心管中，室温孵育15min，然后将混合溶液置于恒温水浴槽中并将其加热到65℃，将混合物平衡5min，杂交液颜色变为红紫色或紫色，即可说明有HCV靶核苷酸的存在。或者取3μL杂交液滴至C18薄层层析片或玻片上进行观察，当斑点干了以后，如果形成蓝色的斑点，也可说明有HCV靶核苷酸的存在。
实施例2采用按照本发明进行组装的HCV检测试剂盒(A)，对临床中20份HCV阳性血清样本和20份阴性血清样本进行检测，同时以Gen-Probe公司基于TMA技术的HCV检测试剂盒(B)检测作比较，本发明试剂盒操作方法按照实施例1，Gen-Probe公司试剂盒保存在-70℃、操作按照说明书进行并用化学发光检测仪器检测，结果如表1。
40例样本检测本发明方法和TMA技术结果总体符合率达到97.5％，结果基本一致。其中20例HCV阴性血清样本两者检测结果完全相同；对于20例HCV阳性血清样本，19例两者结果符合、1例为本发明试剂阳性，TMA技术试剂阴性，说明虽然本发明和TMA技术均采用等温扩增技术进行模板扩增，但由于扩增子检测方法不同，导致了两种方法在检测HCV血清样本中的细微差异。进一步将本发明测得疑似阳性的血清样本进行荧光PCR检测，结果显示与患者的综合诊断一致，即此份样本应为阳性。
表1本发明试剂盒与TMA技术对照试剂的HCV检测比较结果
阳性符合率＝a/(a+c)×100％＝95％阴性符合率＝d/(b+d)×100％＝100％总符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100％＝97.5％实施例3采用按照本发明进行组装的HCV检测试剂盒(A)，对临床中20份HCV阳性血清样本和20份阴性血清样本进行检测，同时以国内获得药证的荧光RT-PCR HCV检测试剂盒(C)的检测作比较，本发明试剂盒操作方法按照实施例1，对照试剂盒(C)按照说明书进行操作，最后在实时荧光PCR仪器上检测，结果如表2，基于扩增和检测原理均不同的本发明技术和实时荧光RT-PCR技术，检测40例HCV血清样本的总体符合率为92.5％，结果基本一致。
表2本发明试剂盒与荧光RT-PCR对照技术的HCV检测比较结果
阳性符合率＝a/(a+c)×100％＝94.7％阴性符合率＝d/(b+d)×100％＝90.5％总符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100％＝92.5％。
权利要求
1.一种RNA等温转录扩增检测方法，步骤依次包括(1)RNA模板在60～70℃下解链后降温；(2)加入逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶，在引物的引导下37～42℃于进行等温扩增，获得RNA扩增子；(3)利用寡核苷酸标记的纳米金探针检测RNA扩增子，通过显色反应获得检测结果。
2.根据权利要求1所说的RNA等温转录扩增检测方法，其特征在于，所说的步骤(2)中的引物为I)与步骤(1)所说的RNA模板特异性配对的5’端带有启动子的负链引物I；和II)与上述负链引物I引导合成的DNA负链3’端特异性配对的正链引物II。
3.根据权利要求1所说的RNA等温转录扩增检测方法，其特征在于，所说的步骤(2)中的反应过程为(a)以RNA为模板，在逆转录酶催化下，通过负链引物I的引导制备RNA-DNA杂链分子I；(b)在核糖核酸酶H催化下水解RNA-DNA杂链分子I，制备单链的DNA负链；(c)以负链DNA为模板，在正链引物II引导下和逆转录酶催化下制备双链DNA；(d)以双链DNA为模板，在启动子引导下和RNA聚合酶催化下转录制备RNA扩增子；(e)以RNA扩增子为模板，在正链引物II引导下和逆转录酶催化下制备RNA-DNA杂链分子II；(f)在核糖核酸酶H催化下水解RNA-DNA杂链分子II，制备单链的DNA正链；(g)以正链DNA为模板，在负链引物I引导下和逆转录酶催化下制备双链DNA；(h)循环重复步骤(d)～步骤(g)使RNA获得扩增。
4.根据权利要求1所说的RNA等温转录扩增检测方法，其特征在于，所说的步骤(1)的解链温度为65℃，降温到37～42℃；所说的步骤(2)的扩增温度为40～41℃。
5.根据权利要求1所说的RNA等温转录扩增检测方法，其特征在于，所说的逆转录酶为鸟成髓细胞瘤病毒逆转录酶或鼠白血病病毒逆转录酶；所说的RNA聚合酶为T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶。
6.根据权利要求5所说的RNA等温转录扩增检测方法，其特征在于，所说的T3RNA聚合酶所识别的特异性启动子序列为5’AAT TCA ATT AACCCT CAC TAA AGG G 3’；所说的T7RNA聚合酶所识别的特异性启动子序列为5’AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G 3’。
7.根据权利要求1所说的RNA等温转录扩增检测方法，其特征在于，所用的纳米金的粒径为1～100nm。
8.根据权利要求1或7所说的RNA等温转录扩增检测方法，其特征在于，纳米金颗粒上的寡核苷酸探针长度为10～100bp，且连接前经过巯基化或烷巯基化处理。
9.根据权利要求1所说的RNA等温转录扩增检测方法，其特征在于，所说的显色反应为溶液杂交显色、纸基斑点显色或微孔板比色。
10.一种利用权利要求1所述检测方法进行RNA等温转录扩增的检测试剂盒，其组成包括反应缓冲液、引物I和引物II、逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶和寡核苷酸标记的纳米金探针。
全文摘要
本发明涉及一种RNA等温转录扩增检测方法及其试剂盒，检测步骤依次包括RNA模板在60～70℃下解链后降温；加入逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶，在引物的引导下37～42℃于进行等温扩增，获得RNA扩增子；利用寡核苷酸标记的纳米金探针检测RNA扩增子，通过显色反应获得检测结果。杂交液/微孔板/试纸显示蓝色为阳性，显示红色为阴性。采用本方法的试剂盒具有简便、快速、灵敏、易于保存等优点，能克服已有技术成本高、操作费时费力、特异性低等不足，适用于实验研究、临床检测、食品安全检测、药物筛选等领域中的RNA检测。
文档编号C12Q1/68GK1944680SQ20061011708
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者吴大治, 夏懿, 沈维祥 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司, 上海复星医学科技发展有限公司