固定化双酶法制备n-乙酰神经氨酸的制作方法

专利名称：：固定化双酶法制备n-乙酰神经氨酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用利用酶促反应制备N-乙酰神经氨酸的方法，尤其涉及利用固定化酶的方法制备N-乙酰神经氨酸。
背景技术：
：在生物体神经氨酸生物代谢途径中，N-乙酰葡萄糖胺异构化产生N-乙酰甘露糖胺，由N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸通过N-乙酰神经氨酸醛缩酶的催化反应就可以生成神经氨酸。神经氨酸及其衍生物通过转糖基反应结合到生物体表面发挥其生物学效力。唾液酸(N-乙酰神经氨酸及其衍生物)在细胞信号传导和相互识别过程之中起着十分重要的作用，例如在流感病毒感染宿主细胞的过程之中，流感病毒的唾液酸酶可以识别N-乙酰神经氨酸及其衍生物，并通过与唾液酸结合感染细胞并释放出复制好的病毒。如果将其唾液酸酶进行抑制，那么就可以治疗病毒导致的疾病。根据唾液酸的结构，设计其类似物，利用这种类似物结合病毒的唾液酸酶，使之失去与宿主细胞表面唾液酸结合的机会，那么病毒就可以被有效地抑制。如葛兰素公司推出的抗病毒新药zanamavir就是N-乙酰神经氨酸的类似物，它具有良好的抗病毒活性。工业上生产N-乙酰神经氨酸主要分为化学合成法、天然产物水解法、微生物发酵法和酶法合成，其中酶法合成相对于前几种方法，具有高效、专一、快速的优点，因此受到人们的重视。N-乙酰神经氨酸的酶法合成主要以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物，在N-乙酰神经氨酸醛縮酶的催化下生成N-乙酰神经氨酸。使用酶法生产N-乙酰神经氨酸始于上世纪60年代，Comb等人首次使用N-乙酰神经氨酸醛縮酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸。1卵5年，Ohta，Y等人从Acoh'中克隆出N-乙酰神经氨酸醛縮酶，揭开了借助基因工程手段生产N-乙酰神经氨酸的序幕。由于N-乙酰甘露糖胺价格昂贵，人们一直在探索利用较为廉价的N-乙酰葡萄糖胺来生产N-乙酰神经氨酸。1964年Ghost从猪肾脏中提取出了N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶，由于该酶提取困难，所以不能用于工业化大规模生产。1991年，Kragl等人使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和丙酮酸通过连续反应生产N-乙酰神经氨酸，但是N-乙酰葡萄糖胺的转化率仅为18%，而且从猪肾中直接提取的异构酶量十分少，不能满足大规模生产的要求。1996年，IMaru等人从猪肾中成功克隆出了N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶，并且发现他与肾素结合蛋白有很高的同源性(99%)，由于该酶的成功克隆，使得酶法生产N-乙酰神经氨酸的工业化应用成为可能。1997年，IMaru等人利用克隆表达的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和神经氨酸醛縮酶大规模反应生产N-乙酰神经氨酸，他们通过补加丙酮酸的方法，将84%的N-乙酰葡萄糖胺转化为77%的N-乙酰神经氨酸和7%的N-乙酰甘露糖胺。之后，人们相继发现人，鼠的肾素结合蛋白具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶活力，2003年，Jeong-0hLee等人利用人肾素结合蛋白和神经氨酸醛縮酶在同一反应器中转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生产N-乙酰神经氨酸，他们采用先高温异构反应，再低温转化为N-乙酰神经氨酸的方法，转化率可达到60%左右。人们通过碱性条件或使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶使廉价的N-乙酰葡萄糖胺转化为N-乙酰甘露糖胺。使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶两酶在同一反应器中共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸可以克服碱性条件异构反应引起的底物丙酮酸或其盐降解，N-乙酰神经氨酸醛縮酶酶活力下降等问题。但两酶共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸的生产中，使用的酶均为游离态的酶，其缺点在于酶不能重复使用，且反应的时间较长(约240小时)。因此，本领域迫切需要提供一种新的使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶在同一反应器中共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸的方法，该方法不仅转化率高，同时N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶可以重复使用，而且所用的反应时间短:，
发明内容本发明旨在提供一种使用固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶制备N-乙酰神经氨酸的方法。在本发明的第一方面，提供了一种制备N-乙酰神经氨酸的方法，它包括步骤(a)将N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸或其盐与0.6-10U/ml固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和1.2-10U/ml固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶混合得到反应混合物；(b)从反应混合物中分离得到N-乙酰神经氨酸。在另一优选例中，所述的步骤(a)前还包括步骤将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶与载体结合形成固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶；及将N-乙酰神经氨酸醛縮酶与载体结合形成固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶。在另一优选例中，所述的丙酮酸或其盐包括但不限于丙酮酸，丙酮酸钠。优选丙酮酸钠。在另一优选例中，所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶是重组的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶。在另一优选例中，所述的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶是E.C.5.1.3.8，所述的固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶是E.C.4.1.3.3。在另一优选例中，所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶N末端都有6个组氨酸残基。在另一优选例中，所述的固定化酶所用载体为陶瓷、玻璃、高分子合成材料、木炭、或纤维素。在另一优选例中，所述的载体为Amberzyrae在另一优选例中，步骤(a)中固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的用量为1.2-2.5U/ml。在另一优选例中，步骤(a)中固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶用量为2.5-5U/ml。在另一优选例中，步骤(a)中固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶的用量配比为0.1-10:1。在另一优选例中，所述的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶的用量配比为0.1-4:1，更佳地为0.5:1。在另一优选例中，步骤(a)中还包括添加丙酮酸或其盐，从而维持反应体系中丙酮酸或其盐的浓度为0.2-0.6M。在另一优选例中，所述的丙酮酸或其盐的浓度保持在O.3-0.5M，更佳地为0.4M。在另一优选例中，在反应中补加1-4次丙酮酸或其盐。在另一优选例中，需补加2次丙酮酸或其盐。在另一优选例中，步骤(a)的反应体系中pH为7-9，温度为22-32°C。在另一优选例中，所述的反应体系中pH为7.5，温度为28t:。在本发明的第二方面，提供了一种由上述的方法得到的N-乙酰神经氨酸。据此，本发明提供了一种新的使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶在同一反应器中共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸而生成N-乙酰神经氨酸的方法，所述方法不仅转化率高，同时N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶可以重复使用，而且所用的反应时间短。图1显示了本发明方法的一个实例的转化率。图2显示了本发明方法的一个实例中制得的N-乙酰神经氨酸的HPLC图谱。图3显示了本发明方法的一个实例中制得的N-乙酰神经氨酸的全波长扫描图谱。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，发现将固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶按一定的酶量和配比在同一反应器中共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸，可以具有较高的转化率，而且使反应时间大大縮短。此外，通过在反应平台期添加丙酮酸或其盐，使其维持在一定浓度，从而获得较高的转化率和较快的反应速度。N-乙截葡萄糖胺-2-差向异构籌和N-乙酰神经贫酸醛缩酶本发明可使用本领域常用的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶，包括分离的天然的酶或重组的酶。可用于本发明的酶包括不含额外序列的酶以及含有额外序列(如带有标签序列)的融合蛋白，例如N末端有6个组氨酸残基的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶。一种优选的酶是编号为E.C.5.1.3.8的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶。本发明所用的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶可用本领域熟知的方法获得，一种优选的方法是将来自(但不限于)猪肾、鼠肾、人肾细胞的基因或使用集胞蓝藻(Synechocystissp)基因导入宿主细胞获得具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶活力的转化微生物。本发明可使用本领域常用的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，包括分离的天然的酶或重组的酶。可用于本发明的酶包括不含额外序列的酶以及含有额外序列(如带有标签序列)的融合蛋白，例如N末端有6个组氨酸残基的N-乙酰神经氨酸醛縮酶。一种优选的酶是编号为E.C.4.1.3.3的N-乙酰神经氨酸醛缩酶。本发明所用的N-乙酰神经氨酸醛縮酶，包括但不限于来源于^sc力en'c力is,等细菌的N-乙酰神经氨酸醛縮酶。此外，还可将N-乙酰神经氨酸醛縮酶基因导入宿主细胞，从而获得具有N-乙酰神经氨酸醛縮酶活力的转化微生物。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。外源基因载体导入目标菌株后可以通过两种方式存在..一是重组遗传载体以质粒形式存在于宿主染色体外。另一种使重组遗传载体以整合形式整合于宿主染色体上。本发明优选重组载体以质粒形式存在于宿主染色体外。适用于本发明的外源重组载体必须首先具有复制起始点，其次表达蛋白必须具有较强的启动子，这样就可以使所要表达的目标蛋白专一大量的富集在宿主细胞内。另外载体还需具有在宿主菌中进行筛选的遗传标记以及具有若干限制性内切酶位点等。本发明中优选表达载体PET28(b)。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。一种优选的方法是在培养基中培养能产生N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶或N-乙酰神经氨酸醛縮酶的重组微生物，在培养物中生成并蓄积N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶或N-乙酰神经氨酸醛縮酶，从该培养物中收集该酶，经压榨破细菌细胞壁后，通过重组菌产生的带6个组氨酸标记的酶进行亲和纯化，获得纯酶(N-乙酰葡萄糖胺_2-差向异构酶或N-乙酰神经氨酸醛缩酶)。固定化雜本发明将获得的纯酶(N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶或N-乙酰神经氨酸醛縮酶)固定化于载体上得到固定化酶。可以用本领域熟知的方法得到固定化酶，一种优选的方法是将纯酶N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶或N-乙酰神经氨酸醛縮酶)与载体按1:l-5(重量比)混合，加入缓冲液使pH7.2-9.5，在10-25"C结合12-48小时。所述的载体是本领域熟知或市售的，包括(但不限于)可购自RohmandHaasCompany的Amberzyme0xirane，AmberliteIRC50，AmberliteFPA58，AmberliteXAD7HP，AmberliteXAD761，DuoliteA7，其中优选Amberzyme0xirane。本发明的固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶的酶活为10-20U/g。本发明的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的酶活为70-100U/g。双酶圃定化制备N-乙雕神经氣酸本发明将固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶混合后在同一反应器中催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸或其盐钠生成N-乙酰神经氨酸。在固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的存在下，在反应器中催化N-乙酰葡萄糖胺异构化为N-乙酰甘露糖胺。同一反应器中，在固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶的存在下，催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸或其盐生成N-乙酰神经氨酸。优选两步反应同时进行。在本发明的固定化双酶反应体系中，将0.6-10U/ml的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和1.2-10U/ml的固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶混合，进行双酶共转化N-乙酰葡萄糖胺及丙酮酸或其盐生成N-乙酰神经氨酸。固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶的配比为o.1-10:i。反应进行中可以补加丙酮酸或其盐，优选在反应进入平台期时补加丙酮酸或其盐，使其浓度维持在0.2—0.6M，更优选在O.3—0.5M。本发明的主要优点在于本发明提供的制备方法可以达到相对于N-乙酰葡萄糖胺77y。的转化率并能在20小时完成转化反应，显著少于报道的使用游离酶转化所需的240小时。而且所使用的酶源可以反复使用多次(连续反应5批催化效率未见降低)，在工业生产上的意义较大。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarbourLabotatoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。酶活力测定方法N-乙酰神经氨酸醛缩籌菌液酶活的測定方法(1)取0.5ral菌液4000rpm离心10分钟，生理盐水洗l一2次。(2)菌体经一2(TC过夜处理后，加入0.5ml50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)，悬浮后取0.25ml，预热10分钟，加入0.25ml预热的Neu5Ac溶液37。C反应10分钟。(3)用10%三氯乙酸0.3ml终止反应，加入0.2ml水，加入0.2。/。2,4—二硝基苯肼0.4ml，摇匀，静置10分钟。(4)加入3N的氢氧化钠1.5ml，摇匀，静置15分钟，12000rpm离心5分钟取上清液在550nm比色测定光吸收值。酶活力(U)=kX0.D.550X稀释倍数(倍)/(tXD)k:标准曲线的斜率t:反应时间10minD:反应加入的酶液体积0.25mlNeu5Ac溶液40mMN-乙酰神经氨酸溶液溶于50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，6NNaOH调pH至7.5(0—5i:保存，一周内使用)酶活力的定义lu酶活定义为每分钟产生lixmol丙酮酸钠所需酶量。N-乙酰神经氨酸醛绾籌固定化,活性的測定方法(1)取20mg固定化酶，加入0,23ml50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)，37°C预热10分钟，加入0.25ml预热的Neu5Ac溶液37'C反应10分钟。(2)用10%三氯乙酸0.3ml终止反应，加入O.2ml水。用水稀释io倍，取lml，加入O.2。/。的2,4—二硝基苯肼0.4ml，摇匀，静置10分钟，(3)加入3N的氢氧化钠1.5ml，摇匀，静置15分钟，12000rpm离心5分钟，取上清液在550nra比色测定光吸收值。酶活力(U)=kX0.D.55。X稀释倍数(倍)/(tXD)k:标准曲线的斜率t:反应时间10minD:反应加入的酶液体积0.25mlNeu5Ac溶液40mMN-乙酰神经氨酸溶液溶于50mM磷酸钠缓冲液(PH7.5)中，用6NNaOH调pH至7.5(0—5。C保存，一周内使用)酶活力的定义在上述条件下，lu酶活定义为每分钟产生lymol丙酮酸钠所需酶量。N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶酶活測定N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶可以将N-乙酰葡萄糖胺的2位差向异构化从而产生N-乙酰甘露糖胺，该酶活力只能通过HPLC来检测。酶反应系统200raM的N-乙酰葡萄糖胺，20mM的MgCl2,10mM的ATP溶于pH7.50.1M的Tris—HC1缓冲液中，以6N的NaOH调pH至7.5。发酵菌液酶活測定方法(1)将发酵液取出0.5ml，10000rpm离心5分钟，弃去上清，于一20。C冻存3小时以上。(2)取出冻存的发酵菌体，加入O.5mlpH7.5，0.1M的Tris—HCl缓冲液重悬菌体。(3)取250ul悬浮的菌体，在37'C水浴10分钟，同时将底物缓冲液置于37t:水浴摇床上IO分钟。(4)在250ul悬浮的菌体中加入250ul底物缓冲液，振荡均匀，于37°C水浴精确反应15分钟。(5)反应结束后，迅速用300ul10%的三氯乙酸终止反应，再补加200ul蒸馏水混匀，于10000rpm离心5分钟。(6)取300ul用HPLC测定。固定化瞎活力測定方法(1)、称取10毫克固定化酶，加入990ulpH7,5，0.1M的Tris—HCl缓冲液，在37'C水浴10分钟，同时将底物缓冲液置于37t:水浴摇床上预热10分钟。(2)在上述反应体系中加入lml底物缓冲液，振荡均匀，于37。C水浴精确反应15分钟。(3)反应结束后，取500ul反应液，迅速用300ul10%的三氯乙酸终止反应，再补加200ul蒸馏水混匀，于10000rpra离心5分钟。(4)取300ul用HPLC测定。单位酶活的定义为上述条件下，每分钟反应产生luraolN-乙酰甘露糖胺所需的酶量实施例l来源于猪肾的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶(E.C.5.1.3.8)生成基因的获得及重组质粒pRY印i的构建以下列引物1:5'catatggagaaggagcgcgaa3'(Seq.ID.No.1)2:5'gaattctaggcgaggcggctcagca3'(Seq.ID,No.2)为引物，以猪肾总RNA为模板，进行反转录PCR扩增，PCR结束后参照分子克隆进行0.9%的琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，利用胶回收试剂盒进行1.2Kb大小片段的回收。将获得的DNA片断经过亚克隆至pKS载体后，经过NdeI和EcoRI双酶切，凝胶电泳后胶回收，载体pET28(b)经过同样处理与前者通过T4连接酶16。C连接过夜。将连接过夜的DNA转化Aco"DH5a感受态细胞。在含有卡那霉素的LB平板上选出重组子。重组子DNA经测序验证与猪肾N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶基因吻合。重组质粒命名为pRY印i。提取重组质粒转化入常规的￡co7./BL21(DE3)感受态细胞，得到表达型工程菌BL21(DE3)/pRY印i。实施例2来源于Ecoh'TGl总DM的N-乙酰神经氨酸醛缩酶(E.C.4.1.3.3)生成基因的获得及重组质粒pNAl的构建以下列引物1:5'gacgctaccatggcaacgaatttacgt3'(Seq.ID.No,3)2:5'gatccagtcgactcgcccgcgctcttg3'(Seq.ID.No.4)为引物，以EcoJiTGl总DNA为模板，进行PCR扩增，PCR结束之后将回收的0.9kb的片断经NcoI和HindIII双酶切，克隆进pUC118质粒，命名为pNA，转化进EcoWDH5a感受态细胞。之后，以下列引物1:5'ggaattccatatggcaacgaatttacgtggcg3'(Seq.ID-No.5)2:5'cgggatcctcacccgcgctcttgcatc3'(Seq.ID.No.6)为引物，以质粒pNA为模板，进行PCR扩增，PCR结束之后将回收的O.9kb的片断经NdeI和BamHI双酶切，克隆进pET28b载体质粒，转化￡DH5a感受态细胞。在含有卡那霉素的LB平板上选出重组子。重组子DNA经测序验证与猪肾N-乙酰神经氨酸醛縮酶基因吻合。重组质粒命名为pNAl。提取重组质粒转化进常规的￡co"BL21(DE3)感受态细胞，得到表达型工程菌BL21(DE3)/pNAl。实施例3工程苗BL21(DE3)/pRY印i的发酵及固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构的制备使用3LTB培养基(配制每升高浓度肉汤，在900ml去离子水中加入细菌培养用蛋白胨12g;细菌培养用酵母提取物24g;甘油4ml。高压灭菌20分钟，然后使该溶液降温至6(TC或6(TC以下，再加入100ml经灭菌得0.17mol/LKH具、0.72mol/LK2HP04溶液)在5L发酵罐中发酵工程菌BL21(DE3)/pRY印i，37'C培养约lh后，加入终浓度为1%的乳糖诱导，同时降温至22"C，诱导后2h再补加终浓度为0.5%的乳糖诱导，发酵约26小时左右收罐，8000rpm离心10分钟收集菌体。将BL21(DE3)/pRY印i发酵26h收得的菌体称取30g，加入45ml0.5MpH7.5的磷酸钠缓冲液，重悬后压榨，压力为1500psi，共压榨两次，压榨后12000rpm离心40rain，得到60mlN-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶粗酶液。粗酶液经亲和载体FP-IDA纯化，获得纯化的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶。纯酶经测定蛋白含量后，以300rag蛋白加入lg干载体的比例投入Amberzyuieoxirane载体，并加入相对于纯酶液两倍体积的1MpH8.0的磷酸钾缓冲液，于18r结合24小时。结合完毕后，取出固定化酶，使用0.5MpH7.5的磷酸钾缓冲液缓冲液冲洗，抽干，得到固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶颗粒。测定得酶活力为78.18U/g。实施例4工程菌BL21(DE3)/pNAl的发酵及固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶的制备使用3LTB培养基(配制每升高浓度肉汤，在900ral去离子水中加入细菌培养用蛋白胨12g;细菌培养用酵母提取物24g;甘油4ml。高压灭菌20分钟，然后使该溶液降温至6(TC或6(rC以下，再加入lOOral经灭菌得O.17mol/LKH2P04、0.72mol/LK2HP04溶液)在5L发酵罐中发酵工程菌BL21(DE3)/pNAl，37"培养约lh后，加入终浓度为1%的乳糖诱导，同时降温至22°C，诱导后2h再补加终浓度为0.5%的乳糖诱导，发酵约20小时左右收罐，8000rpm离心10分钟收集菌体。将BL21(DE3)/pNAl发酵20h收得的菌体称取15g，加入20ml0.5MpH7.5的磷酸钠缓冲液，重悬后压榨，压力为1500psi，共压榨两次，压榨后12000rpm离心40min，得到33mlN-乙酰神经氨酸醛縮酶粗酶液。粗酶液经亲和载体FP-IDA纯化，获得纯化的N-乙酰神经氨酸醛縮酶。纯酶经测定蛋白含量后，以300mg蛋白加入lg干载体的比例投入Amberzymeoxirane载体，并加入相7寸于纯酶液两倍体积的1MpH8.0的磷酸钾缓冲液，于18"C结合24小时。结合完毕后，取出固定化酶，使用0.5MpH7.5的磷酸钾缓冲液缓冲液冲洗，抽干，得到固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶颗粒。测定得酶活力为15.12U/g。实施例5-12两种固定化酶共转化实施例5实施例6实施例7实施例8实施例9实施例10实施例11实施例12醛缩酶(U/ml)55552.552.51.2差向异构酶(U/ml)1052.51.21.20.60.610按上表称取一定量的N-乙酰神经氨酸醛縮酶固定化酶和一定量的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶固定化酶，将两者混合，加入到3ml反应液中(N-乙酰-D-葡萄糖胺0.6M;丙酮酸钠0.4M;ATP7.5mM;MgCl27.5mM;pH7.5)，混匀后28。C、150rpm反应，每隔lh取样一次。每次取样取20ul，加20ul10%的乙酸终止，再加入960ul蒸馏水，混匀后12000rpm离心5分钟，取出300ulHPLC测定。在转化反应进入第一平台期时，产物增速缓慢，所以补加0.132g丙酮酸钠，使体系中的丙酮酸钠达到O.4M。在转化反应进入第二平台期时，补加0.132g丙酮酸钠，使体系中的丙酮酸钠达到0.4M。结果见表l表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结果表明，当N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶减少到1.2U/ml以下时，共转化的效率才开始有显著的降低。而N-乙酰-D-神经氨酸醛縮酶在酶量小于2.5U/ml时，共转化效率就开始有显著的降低。经过实验，得到较为合适的两酶之间的配比N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶0.6-5U/ml、N-乙酰神经氨酸醛縮酶1.2-5U/ml之间。此时转化效率较高，反应时间短(比游离酶约縮短时间90%以上)，且固定化酶得到充分的利用。实施例13按以上条件将实施例5各连续进行3批双酶共转化反应，转化效率未见明显下降。见图1。结果表明，该方法在应用上具有较大的潜力。实施例14-17按实施例13的方式将实施例6-9各连续进行3批双酶共转化反应，转化效率未见明显下降，与实施例13的结果类似。实施例18-22结晶在上述固定化酶反应(实施例5-9)终止后，抽滤反应液，滤液12000rpm离心5min，去除颗粒杂质，加入7倍体积冰醋酸，加入稍许晶种，4。C放置4天。过滤收集结晶，丙酮淋洗，4CTC干燥恒重得到N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)晶体。实施例23酶法合成Neu5Ac的HPLC分析将实施例18得到的Neu5Ac晶体恒重后，与Sigma公司的同类商品(纯度95%)，作HPLC图谱比较，结果表明两者的出峰时间一致(7.77分)。但在实施例18制得的Neu5Ac结晶图谱中，除了Neu5Ac吸收峰外，7.24分处未发现存在有Sigma产品的杂质小峰(图2)。通过全波长扫描分析，表明Sigma产品和实验室结晶品的全波长扫描图谱有相同的特征(图3)。实施例24-27用实施例23的方法对实施例19-22制得的Neu5Ac晶体进行HPLC分析，结果与实施例23的类似。本发明所涉及的多个方面已经作如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明之精神与范围的前提下，对上述描述的任何修饰都是允许的。同样，类似的情况也包括在权利要求中。序列表<110〉中国科学院上海生命科学研究院<120>固定化双酶法制备N-乙酰神经氨酸<130〉064450<160〉6〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉1catatggagaaggagcgcgaa21<210〉2<211〉25〈212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature〈223>引物<400>2gaattctaggcgaggcggctcagca25<210>3<211>27<212〉DNA<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400〉3gacgctaccatggcaacgaatttacgt27<210>4<211>27<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>4gatccagtcgactcgcccgcgctcttg27<210〉5<211〉32<212>腿<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400>5ggaattccatatggcaacgaatttacgtggcg32<210>6〈211〉27〈212〉腿<213〉人工序列<220><221〉tnisc一feature<223〉引物<400>6cgggatcctcacccgcgctcttgcatc2权利要求1.一种制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，它包括步骤(a)将N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸或其盐与0.6-10U/ml固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和1.2-10U/ml固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶混合得到反应混合物；(b)从反应混合物中分离得到N-乙酰神经氨酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶是重组的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶N末端都有6个组氨酸残基。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的固定化酶所用载体为陶瓷、玻璃、高分子合成材料、木炭、或纤维素。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的用量为1.2-2.5U/ml。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶用量为2.5-5U/ml。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛縮酶的用量配比为0.1-10:1。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中还包括添加丙酮酸或其盐，从而维持反应体系中丙酮酸或其盐的浓度为0.2-0.6M。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在反应中补加1-4次丙酮酸或盐°10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)的反应体系中pH为7-9，温度为22-32°C。全文摘要本发明公开了一种利用两种固定化酶混合来生产N-乙酰神经氨酸的工艺。该工艺使用固定化的0.6-10U/mlN-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶(E.C.5.1.3.8)和1.2-10U/mlN-乙酰神经氨酸醛缩酶(E.C.4.1.3.3)在同一反应器中转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸或其盐获得N-乙酰神经氨酸。本发明方法可以达到相对于N-乙酰葡萄糖胺77％的转化率并能在20小时完成转化反应，所使用的酶源可以反复使用多次，在工业生产上意义较大。文档编号C12P19/00GK101165190SQ20061011719公开日2008年4月23日申请日期2006年10月17日优先权日2006年10月17日发明者姜卫红,晟杨,杨仲毅,杨蕴刘,骅白,罗家立,胡世元,邵丽君,军陈,娆饶申请人:中国科学院上海生命科学研究院;浙江海正药业股份有限公司