专利名称：一种北冬虫夏草菌种的选育制作方法
技术领域：
本发明涉及北冬虫夏草人工栽培技术领域，具体地说是一种选育和制作北冬虫夏草高产优质菌种的方法。
背景技术：
北冬虫夏草(Cordyceps militaris)，又名蛹虫草，在真菌分类学上属子囊菌亚门，核菌纲，麦角菌目，麦角菌科，虫草属，与冬虫夏草(Cordycepssinensis)同为虫草属真菌的一种。虫草属真菌是寄生于昆虫、蜘蛛或大团囊属植物的地下子实体上形成的一类虫菌复合物的统称。北冬虫夏草是虫草属真菌的模式种，在野外主要寄主于鳞翅目、鞘翅目和双翅目的一些昆虫的幼虫和蛹上，中医典籍记载它的功效为“味甘、性平，有益肺肾，补精髓，止血化痰”，与冬虫夏草的功能一致。近年来，大量的研究也表明其所含的虫草素是一种具有较强抗肿瘤活性的物质。因此北冬虫夏草是一种极具开发前景的药食两用真菌。过去，由于北冬虫夏草在野外产量稀少，其开发利用并没有被人们所重视。但自上世纪九十年代末，其大规模人工培养获得成功以来，其开发利用价值便越来越被人们认识，所开发的产品越来越多，市场需求也越来越大。北冬虫夏草子实体人工高产栽培正日益成为具有重要经济价值的新兴产业。目前，北冬虫夏草子实体人工高产栽培的相关技术，仍处于发展创新阶段，国家还没有统一的技术标准和规范，对于该领域的生产单位来说，技术的进步将直接影响到其经济效益和市场竞争能力。所以，北冬虫夏草子实体人工高产栽培的相关技术的创新，具有重要的理论和实践意义。
北冬虫夏草子实体人工高产栽培所涉及的技术领域的创新，目前主要包括种质资源的创新，菌种选育、菌种保存和菌种制作方法的创新，栽培容器和栽培模式的创新，工厂化栽培和自动化栽培的设备创新等。其中，由于北冬虫夏草属于子囊菌，与大多数食用菌属于担子菌不同，它的能够形成子实体的异核体菌丝具有更容易分解为同核体，从而不产子实体的特性，因此，北冬虫夏草的菌种具有更容易退化的特点，有些菌种数代以后退化不能产子实体，而有些菌种甚至一代以后就退化不能产子实体了，而且这种退化，常常是从外观上难以预测的，往往等到栽培以后才发现，给规模化生产带来极大的损失。目前，多数的生产企业只能凭有限的经验，尽量减少损失。在北冬虫夏草人工高产栽培的菌种技术方面，目前还没有最有效解决问题的方法。
针对以上所述北冬虫夏草人工高产栽培中的菌种技术难题，现有的技术主要分为三种第一种，菌种复壮法。其原理主要是将菌种回接到寄主上(如蚕蛹上)培养或在培养基中添加与寄主营养相类似的成分以尽量模拟野外培养条件培养北冬虫夏草，然后再从中分离菌种，以期达到复壮菌种性状的目的。这是最通常想到的方法，但这种方法对北冬虫夏草菌种性状的恢复实际上是很有限的，因为到目前为止，还未见报道有一种培养基或靠回接寄主就能有效阻止北冬虫夏草菌种退化。
第二种，菌种保藏法。目前公认最可靠的长久保存微生物菌种使之优良性状得以维持的方法是低温液氮保存法，但这面临的问题是，一方面一般生产单位并没有液氮保存的条件和设备，另一方面液氮保存的菌种，以及液体石蜡等方法保藏的菌种，经长期保藏后，在用于生产前，心须要有一个转接活化、复壮的过程，该操作过程对于双孢菇、平菇等大多数食用菌菌种而言，只是个时间问题，但对北虫草而言，就是一个严肃的“转接代数”问题，这本身也容易带来菌种的退化。
第三种，野外不断分离筛选新的菌种。大量的野外分离菌种的实践表明，真正性状优良的菌种常常是可遇而不可求的，野外分离菌种只是不断探求以获得更好的菌种资源的途径，而不是真正保持已得到的菌株的优良性状并将之稳定而有效地运用于生产的方法。
因此，现有技术虽能在一定程度上帮助减少生产过程中因菌种退化问题而带来的生产损失，但对于北冬虫夏草菌种退化的根本原因，即异核体分解，同核体积累的问题，并没有找到有效的解决办法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术不能有效解决北冬虫夏草菌种中异核体分解，同核体积累而导致菌种退化不长子实体及菌种在培养过程中优良性状变异与丢失的问题而提供的一种有效筛选并优化菌种优良性状、以及将之用于生产实践，制作出稳定可靠的高产优质北冬虫夏草菌种的方法。
本发明的目的是这样实现的一种北冬虫夏草菌种的选育制作方法，它包括以下步骤i选育从北冬虫夏草子实体中分离子囊孢子单孢，进行纯培养，得子囊孢子单孢菌株，然后对得到的子囊孢子单孢菌株培养后对其结构类型进行标记编号、配对混合并培养使之产子实体，对不同配对培养的结果进行产子实体产量与质量的考察，从中选出最佳配对组合，即为所选育的菌株组合。
ii制作将上述选出的菌株组合分别扩繁，然后按比例混合，即得菌种。
所述子囊孢子单孢菌株进行配对时，必须选择其无性型产孢结构分别为头孢霉型和拟青霉型的菌株进行配对。
在菌种制作过程中，混合时拟青霉型菌株的比例占30～90％。
本发明首先从北冬虫夏草子实体中分离子囊孢子单孢，在适宜的培养基上进行纯培养并扩繁多管备用，此处所用的北冬虫夏草子实体应选用已知性状优良的子实体，从而从源头上保证优良性状得以被采用，所用的菌株必须是子囊孢子单孢，即经历了有性生殖过程中的减数分裂而形成的单倍体孢子萌发形成的菌株；由于在减数分裂过程中，配对染色体上的基因要经过重组，该过程也是生物物种性状修复的一种途径。
其次，在显微镜下观察所得到的子囊孢子单孢菌株的无性型产孢结构，将无性型产孢结构分别为头孢霉型的和拟青霉型的进行标记并编号，将所标记的菌株分别取样，配对混合后接种于米饭培养基或其它用来培养北冬虫夏草子实体的培养基上，进行北冬虫夏草子实体的人工培养；配对的原则是头孢霉型的子囊孢子单孢菌株必须与拟青霉型的子囊孢子单孢菌株配对；经过40～60天的培养后，对不同配对培养的结果进行产子实体的产量和质量的考察，从中选出具有最佳子实体产量和质量的配对组合，即为所选育得到的子囊孢子单孢菌株组合。
然后，将所得到的最佳配对的菌株组合分别扩繁及保存，作为制作生产菌种的母种；每次制作生产菌种时，先将子囊孢子单孢菌株分别扩繁(根据需要，在固体或液体培养基上扩繁)，在接种到米饭培养基或其它培植子实体的培养基上之前，按适当比例混合后运用；两种菌株的混合比例具有其个性，总体的规律是其中拟青霉型菌株所占的比例应在30～90％。
本发明将代表不同核的两种子囊孢子单孢菌株单独培养，避免了培养过程带来的同核体积累的问题，在制作生产菌种时，再将两种子囊孢子单孢菌株混合，有效控制两者的比例与平衡，从而保证生产菌种的高产优质和稳定。
具体实施例方式
实施例1将野外采集或人工培养的具有成熟子囊壳的北冬虫夏草子实体进行表面消毒后，置于无菌的PDA培养平板的上方，放到温度为20～25℃左右的培养室中培养，待子囊孢子弹射到PDA培养基表面并萌发长成肉眼可见的微小菌落时，分别挑取单孢菌落转接到新的PDA培养平板或试管中培养备用；此过程可通过显微镜辅助观察，以观察子囊孢子萌发的过程，并确保所挑取的为子囊孢子单孢菌落。
将所得到的子囊孢子单孢菌株，分别在PDA培养基上进行纯培养并扩繁后，取样在显微镜下观察各菌株的无性型产孢结构特征，将无性型产孢结构分别为头孢霉型的和拟青霉型的进行标记并编号，再将所标记的菌株分别取样，配对混合后接种于米饭培养基上，米饭培养基的配方为25克大米，35克水，高温灭菌后备用。米饭培养基接种北冬虫夏草菌种后，置于温度为20～25℃的培养室中先避光培养3-5天，待菌丝初步长起来后，置于温度为20～25℃的培养室中见光培养。培养40～60天后，对不同配对培养的结果进行产子实体的产量和质量的考察，从中选出具有最佳子实体产量和质量配对组合，即为所选育得到的菌种的菌株组合。
将所得到的菌株组合分别在PDA培养基上扩繁及保存，作为制作高产优质生产菌种的母种。每次制作生产菌种时，先将菌株组合分别扩繁(可根据需要，在固体或液体培养基上扩繁)，在接种到米饭培养基或其它培植子实体的培养基上之前，将两者按照拟青霉型菌株占30％的比例混合后，即为所需要的菌种了。
实施例2将野外采集或人工培养的具有成熟子囊壳的北冬虫夏草子实体进行表面消毒后，置于无菌的倒有PDA改良培养基的培养平板的上方，放到温度为20～25℃左右的培养室中培养，待子囊孢子弹射到PDA改良培养基表面并萌发长成肉眼可见的微小菌落时，分别挑取单孢菌落转接到新的PDA改良培养基的培养平板或试管中培养备用；此过程可通过显微镜辅助观察，以观察子囊孢子萌发的过程，并确保所挑取的为子囊孢子单孢菌落。所用的PDA改良培养基配方为200克马铃薯，20克蔗糖，3克蛋白胨，3克磷酸二氢钾，1.5克硫酸镁，10毫克维生素B1，1000毫升水。固体培养基另加20克琼脂。
将得到的子囊孢子单孢菌株，分别在PDA改良培养基上进行纯培养并扩繁后，取样在显微镜下观察各菌株的无性型产孢结构特征，将无性型产孢结构分别为头孢霉型的和拟青霉型的进行标记并编号。再将所标记的菌株分别取样，配对混合后接种于米饭改良培养基上，米饭改良培养基的配方为25克大米，1克蚕蛹粉，0.5克酵母粉，1克土豆粉，38克水，高温灭菌后备用。米饭改良培养基接种北冬虫夏草菌种后，置于温度为20～25℃的培养室中先避光培养3-5天，待菌丝初步长起来后，置于温度为20～25℃的培养室中见光培养。培养40～60天后，对不同配对培养的结果进行产子实体的产量和质量的考察，从中选出具有最佳子实体产量和质量的配对组合，即为所选育得到的菌种的菌株组合。
将所得到的菌株组合分别在PDA改良培养基上扩繁及保存，作为制作生产菌种的母种；每次制作生产菌种时，先将菌株组合分别扩繁(可根据需要，在固体或液体培养基上扩繁)，在接种到米饭改良培养基或其它培植子实体的培养基上之前，将两者按照拟青霉型菌株占90％的比例混合后，即为所需要的菌种了。
权利要求
1.一种北冬虫夏草菌种的选育制作方法，其特征在于它包括以下步骤i选育从北冬虫夏草子实体中分离子囊孢子单孢，进行纯培养，得子囊孢子单孢菌株，然后对得到的子囊孢子单孢菌株培养后对其结构类型进行标记编号、配对混合并培养使之产子实体，对不同配对培养的结果进行产子实体产量与质量的考察，从中选出最佳配对组合，即为所选育的菌株组合；ii制作将上述选出的菌株组合分别扩繁，然后按比例混合，即得菌种。
2.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌种的选育制作方法，其特征在于所述子囊孢子单孢菌株进行配对时，必须选择其无性型产孢结构分别为头孢霉型和拟青霉型的菌株进行配对。
3.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌种的选育制作方法，其特征在于菌种制作过程中，混合时拟青霉型菌株的比例占30～90％。
全文摘要
本发明公开了一种北冬虫夏草菌种的选育制作方法，它首先从北冬虫夏草子实体中分离子囊孢子单孢，进行纯培养，得子囊孢子单孢菌株，然后对得到的子囊孢子单孢菌株培养后对其结构类型进行标记编号、配对混合并培养北冬虫夏草子实体，对不同配对培养的结果进行产子实体产量与质量的考察，从中选出最佳配对菌株组合；再将菌株组合分别扩繁，按比例混合，即得菌种。本发明将代表不同核的两种子囊孢子单孢菌株单独培养，避免了培养过程带来的同核体积累的问题，在制作生产菌种时，再将两种子囊孢子单孢菌株混合，有效控制两者的比例与平衡，从而保证生产菌种的高产优质和稳定。
文档编号C12N1/14GK1995321SQ20061014833
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者高新华, 吴畏, 沈明, 陈伟, 张红霞 申请人:上海市农业科学院