专利名称：血铅浓度的测定方法及血铅诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、食品、环境等领域内对血铅浓度的检测，尤其涉及利用酶比色法及Ehrlich化学反应技术测定血铅浓度的方法，以及由此制得的血铅诊断试剂盒，属于血铅浓度分析检测技术领域。
背景技术：
四乙铅[Pb(C2H5)4]是一种有机铅化合物，为无色油状液体，有芳香气味，易挥发，性极毒，且易为皮肤吸收。常与有机卤化物(溴化乙和油溶性染料)配成汽油抗震添加剂(乙基液或铅水)，它是城市环境的重要污染源。
血铅和尿铅的测定方法主要有双硫腙络合比色法、原子吸收光谱法和溶出伏安法三类。
双硫腙络合比色法是早期广泛使用的一种测铅方法，该法繁杂、费时，需要大量洁净玻璃器皿，且易受锡、铋和铊的干扰，所用试剂氰化钾和氯仿毒性大，对人体健康有影响。
原子吸收光谱法包括溶剂萃取-火焰原子吸收光谱法，石墨炉无焰原子吸收光谱法、Delve杯原子吸收光谱法和氢化物发生-原子吸收光谱法。其中，溶剂萃取-火焰原子吸收光谱法是经典的原子吸收法，灵敏度不理想；Delve杯原子吸收光谱法(DC-AAS)测定，样品不需作灰化处理，该法的优点是样品用量小，且由于减少了样品前处理步骤，分析速度加快，此外测试费用相对较低。石墨炉无焰原子吸收光谱法突出优点是灵敏度高，样品不需消化，只需用基体改进剂作适当稀释后即可直接上仪器测定。GFAAS应用最广，并被推荐为B-pb的参考方法。氢化物发生-原子吸收光谱法是先将样品加混合消化液，用电热板或微波炉消化后，采用氢化发生装置与WFX-ID型原子吸收光谱仪联用测定尿铅。
溶出伏安法阳极溶出伏安法ASV是预先将被测物血铅或尿铅在恒定负电位下电解富集在工作电极上，即将离子铅还原为元素铅在预先设定的电积时间后，将电极电位向反方向快速扫描，电位变化由负到正。该法的灵敏度较差。微分电位溶出法是一种新电化学技术，用于测定生物样品中铅时，与阳极溶出伏安法一样，需要富集和溶出，只是所用方法不同。生物体液中铅测定法，除上述几种外，还有稳定性同位素稀释气相色谱-质谱等，但所用仪器价格昂贵，且需要配备训练有素的专业人员。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定血铅浓度的方法，以及应用该方法配制而成的血铅诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种酶比色法及Ehrlich化学反应技术测定血铅浓度的方法，采用以下步骤进行首先，将测定的样品与含有氨基酮戊酸、Ehrlich试剂混匀，使之发生以下反应，
卟吩胆色素原+Ehrlich试剂————→卟吩胆色素然后，将最终反应物置于可见光分析仪下，检测555nm处直接反应卟吩胆色素含量高低的光吸收程度；通过比较受铅抑制血浆中的5-氨基酮戊酸脱水酶活性和再激活的受铅抑制的5-氨基酮戊酸脱水酶活性，测出血铅浓度的大小。
实现本发明血铅诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液 40～200mmol/L，稳定剂 5～100g/ml，
氨基酮戊酸 1～50mmol/L，还原型谷胱甘肽 1～50mmol/L，Ehrlich试剂。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分还原型谷胱甘肽，可以放在试剂II；试剂II中的氨基酮戊酸也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范围之内。
Ehrlich试剂是由1g的对-2甲胺基苯甲醛溶于42ml的冰醋酸配制而成，使用前加入8ml的浓度为700g/ml的过氯酸。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案(1)激活5-氨基酮戊酸脱水酶试剂缓冲液100mmol/L，稳定剂2mol/L，氨基酮戊酸5mmol/L，还原型谷胱甘肽50mmol/L，Ehrlich试剂。
(2)不激活5-氨基酮戊酸脱水酶活试剂缓冲液100mmol/L，稳定剂2mol/L，氨基酮戊酸5mmol/L，Ehrlich试剂。
本发明利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及Ehrlich化学反应技术，计量通过酶促反应生成卟吩胆色素所导致在555nm波长处吸光度的上升，得以测定血铅浓度的方法。同时，本发明还给出用以实现该方法的血铅诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行血铅浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶比色法及Ehrlich化学反应技术测定血铅浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中血铅浓度的大小；(6)本发明提供的液态血铅诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种血铅浓度的测定方法及血铅诊断试剂盒，铅会抑制血浆中5-氨基酮戊酸脱水酶(aminolevulinate dehydratase；EC4.2.1.24)的活性；还原型谷胱甘肽能移走和5-氨基酮戊酸脱水酶结合的铅，从而重新激活5-氨基酮戊酸脱水酶的活性；因此比较血浆中受激活及不受激活(试剂中含还原型谷胱甘肽及不含还原型谷胱甘肽)5-氨基酮戊酸脱水酶的活性可以测算出血浆中铅的含量。应用5-氨基酮戊酸脱水酶联合Ehrlich反应终点比色法。5-氨基酮戊酸脱水酶酶解氨基酮戊酸反应产生卟吩胆色素原，再通过联合Ehrlich试剂的作用，最后生成卟吩胆色素，从而可以通过可见光分析仪器，在555nm波长处，测定卟吩胆色素含量高低的光吸收大小；通过测量555nm处吸光度上升的程度，比较血浆中受激活及不受激活(试剂中含还原型谷胱甘肽及不含还原型谷胱甘肽)5-氨基酮戊酸脱水酶的活性可以测算出血浆中铅的浓度大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一按以下成分和用量配制血铅诊断试剂盒磷酸盐缓冲液100mmol/L，硫酸铵 80g/ml，氨基酮戊酸 5mmol/L，还原型谷胱甘肽 50mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，设定全程反应时间10分钟；样品加入上述试剂反应5分钟后，加入Ehrlich试剂再反应5分钟，测试主波长555nm，测试副波长700nm，被测血铅样品与试剂的体积比为1∶25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点法，检测时间5分钟左右。
加入样品和激活试剂(含还原型谷胱甘肽)及不激活试剂(不含还原型谷胱甘肽)后，分别使之混合并发生反应，最终分别将反应物置于生化分析仪下，比较二种试剂在检测主波长555nm吸光度上升的程度差异，可以测算出血铅的浓度大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制血铅诊断试剂盒试剂I——磷酸盐缓冲液100mmol/L，甘油2mol/L，还原型谷胱甘肽 2mol/L；试剂II——磷酸盐缓冲液100mmol/L，
丙二醇 50％v/v，氨基酮戊酸 5mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，设定全程反应时间10分钟；样品加入上述试剂I反应1分钟左右，加入上述试剂II再反应4分钟左右，然后加入Ehrlich试剂再反应5分钟，测试主波长555nm，测试副波长700nm，被测血铅样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点法，检测时间5分钟左右。
加入样品和激活试剂(试剂I含还原型谷胱甘肽)及不激活试剂(试剂I不含还原型谷胱甘肽)后，分别使之混合并发生反应，最终分别将反应物置于生化分析仪下，比较二种试剂在检测主波长555nm吸光度上升的程度差异，可以测算出血铅的浓度大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.血铅浓度的测定方法，包括以下步骤①将测定的样品与含有氨基酮戊酸、Ehrlich试剂混匀，使之发生以下反应，②将最终反应物置于可见光分析仪下，检测555nm处直接反应卟吩胆色素含量高低的光吸收程度；通过比较受铅抑制血浆中的5-氨基酮戊酸脱水酶活性和再激活的受铅抑制的5-氨基酮戊酸脱水酶活性，测出血铅浓度的大小。
2.血铅诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液40～200mmol/L，稳定剂0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，氨基酮戊酸1～50mmol/L，还原型谷胱甘肽1～50mmol/L，Ehrlich试剂。
3.根据权利要求2所述的血铅诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
4.权利要求2～3中任意一种血铅诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂或者双剂。
5.权利要求2～3中任意一种血铅诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种血铅浓度的测定方法及血铅诊断试剂盒，应用5－氨基酮戊酸脱水酶联合Ehrlich反应终点比色法，5－氨基酮戊酸脱水酶酶解氨基酮戊酸反应产生卟吩胆色素原，再通过联合Ehrlich试剂的作用，最后生成卟吩胆色素，通过可见光分析仪器，在555nm波长处，测定卟吩胆色素含量高低的光吸收大小；通过测量555nm处吸光度上升的程度，比较血浆中受激活及不受激活5－氨基酮戊酸脱水酶的活性测算出血浆中铅的浓度大小。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。
文档编号C12Q1/00GK1987471SQ200610161228
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司