将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的制作方法

专利名称：：将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的制作方法
技术领域：
：本发明涉及翻译生物化学和重组蛋白表达领域。本发明涉及细菌宿主细胞，以及用于产生含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的蛋白质的方法。本发明也涉及使用正交氨基酰基-tRNA合成酶、正交tRNA、非天然编码氨基酸、选择密码子和相关组合物在假单胞菌种和其菌株的细菌重组宿主细胞中产生蛋白质的方法。
背景技术：
：近来，已报导蛋白质科学中的一种全新技术，其有希望克服众多与蛋白质的位点特异性修饰相关的限制。特定来说，新组分已添加到原核细胞大肠杆菌(&c/zm'C;'aco//;￡.co//)(例如，L.Wang等人，(2001)，Science292:498-500)和真核细胞酿酒酵母(Sacc/iTO/^cescewv/w'ae;S.cweWw'ae)(例如，J.Chin等人，Science301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机构中，使得能在活体内向蛋白质中并入非遗传编码氨基酸。使用这种方法，已经回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的众多新氨基酸(包含光亲和性标记和可光异构化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中。例如参看J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin禾卩P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem11:1135-1137;J.W.Chin等人，(2002)，PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002)，Chem.Comm.,1-10。这些研究已证实有可能选择性且常规地引入诸如酮基、炔基和叠氮基部分的化学官能团，所述化学官能团在蛋白质中不存在，对20种常见遗传编码氨基酸中发现的所有官能团呈化学惰性且可用于有效且选择性地反应以形成稳定共价键。将非遗传编码氨基酸并入蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在官能团(诸如赖氨酸的e-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代物的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见遗传编码氨基酸中所发现的官能团呈惰性，但可完全且有效地反应以形成稳定键。已知存在在大肠杆菌重组宿主细胞中不能充分表达的重组蛋白。已开发出除大肠杆菌之外用于表达重组蛋白的替代性细菌宿主细胞。这些大肠杆菌重组宿主细胞的替代物包含假单胞菌种、革兰氏阴性细菌(gramnegativebacterium)和自其获得的各种菌株。因此存在对于用于将非天然编码氨基酸并入重组蛋白中的除大肠杆菌之外的替代性重组宿主细胞的需求。
发明内容本发明提供用于产生且使用可将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的假单胞菌翻译系统的多种方法。本发明包含多种假单胞菌种和自其获得的菌株，以及相关组合物。包括在假单胞菌种和自其获得的菌株中通过假单胞菌翻译系统产生的非天然编码氨基酸的蛋白质也是本发明的特征。可使用本发明的假单胞菌翻译系统将已知且新颖的非天然编码氨基酸并入蛋白质中。因此，在一方面中，本发明提供包括由假单胞菌种和菌株产生或用于其中的假单胞菌翻译系统的组合物。假单胞菌翻译系统包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先在假单胞菌翻译系统中使具有至少一个非天然编码氨基酸的O-tRNA氨基酰基化且O-tRNA识别至少一个选择密码子。假单胞菌翻译系统因此回应选择密码子而将非天然编码氨基酸插入蛋白质中。假单胞菌翻译系统能够如本文中所述在假单胞菌宿主细胞中起作用或用假单胞菌细胞的翻译组分起作用以提供包括非天然编码氨基酸的多肽。本发明的典型假单胞菌翻译系统包含多种假单胞菌种的细胞，诸如(但不限于)荧光假单胞菌(P.fluorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)等以及欲鉴别的新假单胞菌种。或者，假单胞菌翻译系统包括活体外假单胞菌翻译系统，例如，包含来自假单胞菌宿主细胞的细胞翻译组分的提取物。0-tRNA的实例包含但不限于SEQIDN0:1、2及3中所述的聚核苷酸序列和/或其互补聚核苷酸序列。类似地，0-RS的实例包含但不限于包括SEQIDNO:35-66中所述氨基酸序列的多肽，以及由SEQIDNO:4-34中所述核酸序列和其互补聚核苷酸序列编码的多肽。可用于本发明的假单胞菌翻译系统中的非天然编码氨基酸的实例包含但不限于酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；经垸基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤基、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸酯、硼(III)酸酯、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸或其任何组合；具有可光活化交联剂的氨基酸；自旋标记氨基酸；荧光氨基酸；具有新颖官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；结合金属的氨基酸；含金属氨基酸；放射性氨基酸；光笼蔽和/或可光异构化氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮基氨基酸；包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸；经重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基酸；具有延长侧链的氨基酸；含有有毒基团的氨基酸；经糖取代的氨基酸，例如，经糖取代的丝氨酸等等；碳键联含糖氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含a-羟基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；a,a二取代氨基酸；P-氨基酸；以及除脯氨酸之外的环状氨基酸。举例来说，非天然编码氨基酸可为O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcP-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸和异丙基-L-苯丙氨酸。在一个实施例中，至少一个非天然编码氨基酸为O-甲基-L-酪氨酸。在一个实施例中，非天然编码氨基酸为L-3-(2-萘基)丙氨酸。在另一组特定实例中，非天然编码氨基酸为含氨基、异丙基或0-烯丙基的苯丙氨酸类似物。多种选择密码子中的任一者可用于本发明中，其包含但不限于无义密码子、终止密码子(包含但不限于琥珀、赭石和蛋白石终止密码子)、稀有密码子、四个(或四个以上)碱基密码子、非天然核苷基密码子等等。举例来说，在一个实施例中，选择密码子为琥珀密码子。本发明的假单胞菌翻译系统提供在假单胞菌种细胞中或在假单胞菌翻译系统中合成包括有用足够量的非天然编码氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，在本发明的假单胞菌宿主细胞或翻译系统中，可产生至少约1毫克/升、5毫克/升、10毫克/升、50毫克/升、100毫克/升、500毫克/升、1000毫克/升或更大浓度的包括至少一个非天然编码氨基酸的蛋白质。另外，在本发明的假单胞菌宿主细胞或翻译系统中，可产生至少约l克/升、2克/升、3克/升、4克/升、5克/升、10克/升、20克/升、30克/升、40克/升、50克/升、100克/升或更大浓度的包括至少一个非天然编码氨基酸的蛋白质。本发明的另一方面提供与所关注的任何蛋白质同源、但包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的蛋白质的制备。举例来说，可制备包括一个或一个以上非天然编码氨基酸，但与一种或一种以上其它蛋白质同源的治疗性蛋白质。举例来说，在一方面中，包括非天然编码氨基酸的蛋白质与诸如以下各物的治疗性或其它蛋白质同源细胞因子、生长因子、生长因子受体、干扰素、白细胞介素、炎性分子、致癌基因产物、肽激素、信号转导分子、类固醇激素受体、转录活化因子、转录抑制因子、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、人类生长激素、上皮中性粒细胞活化肽-78、GROa/MGSA、GRO卩、GRO、MIP-la、MIP-ip、MCP-1、肝细胞生长因子、类胰岛素生长因子、白血病抑制因子、抑瘤素M、PD-ECSF、PDGF、多效生长因子、SCF、c-kit配体、VEGF、G-CSF、IL-1、IL-2、IL-8、IGF-I、IGF-II、FGF(成纤维细胞生长因子)、PDGF、TNF、TGF-a、TGF-卩、EGF(表皮生长因子)、KGF(角质化细胞生长因子)、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明质素/CD44、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体和/或皮质酮。在另一组实施例中，蛋白质是与诸如以下各物的治疗性或其它蛋白质同源ct-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白(Apolipoprotein)、载脂蛋白(Apoprotein)、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C化学趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF陽1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC化学趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1a、单核细胞炎性蛋白-1卩、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、C-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体l、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、GROa/MGSA、GROp、GRO、MIP-la、MIP-lp、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素、因子IX、因子VII、因子Vin、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、刺猬蛋白(Hedgehogprotein)、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素、IFN-a、IFN-p、IFN-y、白细胞介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL隱9、IL-10、IL-ll、IL-12、角质化细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、骨形成蛋白、致癌基因产物、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人类生长激素、多效生长因子、蛋白A、蛋白G、致热外毒素A、B或C、松弛素、肾素、SCF、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素al、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、TGF-cuTGF-p、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子a、肿瘤坏死因子P、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体和/或皮质酮。在一方面中，本文中的组合物包括包含非天然编码氨基酸的蛋白质和医药学上可接受的赋形剂，例如，所述组合物包括上述蛋白质中的任一种和医药学上可接受的赋形剂。通过(例如)使用(例如)设定为默认参数的BLASTN或BLASTP进行序列比对可推断与多肽的同源性。举例来说，在一个实施例中，蛋白与已知治疗性蛋白(例如，存在于Genebank或其它可用数据库中的蛋白)至少约50%、至少约75%、至少约80%、至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%—致。所关注蛋白可含有1、2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15或15个以上非天然编码氨基酸。非天然编码氨基酸可相同或不同，例如，在蛋白中的l、2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15或15个以上不同位点可包括1、2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15或15个以上不同非天然编码氨基酸。举例来说，在一个实施例中，蛋白为DHFR，且至少一个非天然编码氮基酸选自由O-甲基-L-酪氨酸和L-3-(2-萘基)丙氨酸组成的群组。本发明也提供用于在假单胞菌翻译系统中产生至少一种蛋白以使得所述蛋白包括至少一个非天然编码氨基酸的方法。在本发明的方法的实施例中，假单胞菌翻译系统具有至少一种包括至少一个选择密码子的核酸，其中所述核酸编码所述蛋白。也提供假单胞菌翻译系统，其包括识别至少一个选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，以及在假单胞菌翻译系统中优先使具有非天然编码氨基酸的O-tRNA氨基酰基化的正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)。在一方面中，在本发明的假单胞菌翻译系统中产生的一种或一种以上包括非天然编码氨基酸的蛋白是以细胞依赖性方式经处理且修饰。此提供经稳定折叠或以其它方式由细胞修饰的蛋白的产生。非天然编码氨基酸可视情况外源性提供给假单胞菌翻译系统。或者，例如，如果假单胞菌翻译系统为活细胞，那么非天然编码氨基酸可由假单胞菌细胞进行生物合成。举例来说，假单胞菌细胞可包括用于自细胞内的一种或一种以上碳源来产生非天然编码氨基酸(例如，对氨基苯丙氨酸)的生物合成路径。在一些实施例中，生物合成路径可产生生理学量的非天然编码氨基酸，例如，细胞产生足以用于蛋白生物合成的量的非天然编码氨基酸，此量可能不能实质上改变天然氨基酸的浓度或不能实质上耗尽在产生非天然编码氨基酸的过程中的细胞资源。可视情况由本发明的细胞产生的其它非天然编码氨基酸包含但不限于多巴、O-甲基-L-酪氨酸、糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、本文中所述的其它非天然编码氨基酸等等。试剂盒为本发明的另一特征。举例来说，试剂盒可包含一种或一种以上如上所述的假单胞菌翻译系统(例如，细胞、21或21个以上氨基酸细胞、细胞提取物等)、一个或一个以上非天然编码氨基酸，例如，所述试剂盒具有适当包装材料、用于容纳试剂盒组分的容器、用于实施本文中方法的说明性材料等等。类似地，假单胞菌翻译系统的产物(例如，诸如包括非天然编码氨基酸的EPO类似物的蛋白)可以试剂盒形式提供，例如，所述试剂盒具有用于容纳试剂盒组分的容器、用于实施本文中方法的说明性材料等等。定义应了解本发明并不限于在本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂且因此可改变。也应了解本文中所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且并不打算限制本发明的范围，本发明的范围仅由随附申请专利范围来限定。如本文中和随附申请专利范围中所用，除非在上下文中另外明确指出，否则单数形式"一"和"所述"包含复数个指示物。因此，例如，提及一"hGH"为提及一种或一种以上这些蛋白质且包含所属领域的技术人员已知的其等价物等等。除非另外定义，否则在本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文中所述类似或等效的任何方法、装置和材料可用于本发明的实施或测试中，但现在将描述优选方法、装置和材料。在本文中提及的所有公开案和专利都是出于描述且揭示(例如)在所述公开案中描述的构筑体和方法的目的而以引用的方式并入本文中，所述构筑体和方法可结合本发明一起使用。仅提供本文所讨论的公开案在本发明申请日期之前的揭示内容。本文中没有内容将被解释为承认发明者因先前发明或任何其他原因而无权提前公开本发明。术语"实质上经纯化"指的是可实质上或基本上不含通常伴随在多肽天然存在环境(即天然细胞，或者在重组产生多肽的情况下为宿主细胞)中发现的蛋白或与在多肽天然存在环境中发现的蛋白相互作用的组分的多肽。可实质上不含细胞物质的多肽包含具有小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%(以干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当多肽或其变体是由假单胞菌宿主细胞重组产生时，蛋白可以细胞干重的约30%或更大、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或更小存在。当多肽或其变体是由假单胞菌宿主细胞重组产生时，蛋白可以细胞干重计约100g/L或更大、约50g/L、约10g/L、约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更小存在于培养基中。因此，如由本发明的方法所产生的"实质上经纯化"多肽可具有如由适当方法(诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和/或毛细管电泳)所测定至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度级别，特定来说至少约75%、80%、85%的纯度级别，且更特定来说至少约90%的纯度级别、至少约95%的纯度级别、至少约99%或更大的纯度级别。"重组假单胞菌宿主细胞"或"假单胞菌宿主细胞"指的是不管何种方法用于插入(例如，直接吸收、转导、f配对(f-mating)或所属
技术领域：
中用于产生重组宿主细胞的其它方法)，假单胞菌种或自其获得的菌株的包含外源聚核苷酸的细胞。外源聚核苷酸可保持为非整合载体(例如，质粒)或者可整合入宿主基因组中。如本文中所用，术语"培养基"包含可支撑或容纳任何假单胞菌宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物。因此，所述术语可涵盖假单胞菌宿主细胞已生长于其中的培养基，例如，多肽已分泌入其中的培养基，其包含在增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语亦可涵盖含有假单胞菌宿主细胞溶菌液的缓冲液或试剂，诸如在多肽于细胞内产生且宿主细胞溶解或破裂以释放多肽的情况下。如本文中关于蛋白质再折叠所用的"还原剂"经定义为将巯基保持在还原状态且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。适合还原剂包含但不限于二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原谷胱甘肽。所属领域的一般技术人员易于了解多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。如本文中关于蛋白质再折叠所用的"氧化剂"经定义为能够自所氧化化合物移除电子的任何化合物或物质。适合氧化剂包含但不限于氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化二硫苏糖醇、氧化赤藓糖醇和氧。所属领域的一般技术人员易于了解多种氧化剂适用于本发明的方法中。如本文中所用的"变性剂"经定义为会造成蛋白质可逆展开的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的性质和浓度决定。适合变性剂可为离液剂(chaotrope)、清洁剂、有机溶剂、水可混溶溶剂、磷脂或两种或两种以上这些试剂的组合。适合离液剂包含但不限于尿素、胍和硫氰酸钠。有用清洁剂可包含但不限于强清洁剂，诸如十二垸基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清洁剂)、Sarkosyl;温和非离子型清洁剂(例如，毛地黄皂苷(digitonin));温和阳离子型清洁剂，诸如N》2,3-(二油烯基氧基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；温和离子型清洁剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子型清洁剂，其包含但不限于硫代甜菜碱(Zwittergent)、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-l-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-2-羟基-l-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。诸如乙腈、低碳烷醇(尤其C2-C4烷醇，诸如乙醇或异丙醇)或低碳烷二醇(尤其C2-Q垸二醇，诸如乙二醇)的有机、水可混溶溶剂可用作变性剂。适用于本发明中的磷脂可为天然存在磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变体，诸如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。如本文中所用的"再折叠"描述将含有二硫键的多肽自不当折叠或展开状态转化为二硫键的天然或适当折叠构象的任何过程、反应或方法。如本文中所用的"共折叠"特定指的是使用至少两种彼此相互作用的多肽且使得展开或不当折叠多肽转化为天然、适当折叠多肽的再折叠过程、反应或方法。"非天然编码氨基酸"指的是并非20种常见氨基酸或焦赖氨酸或晒半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语"非天然编码氨基酸"同义使用的其它术语为"非天然氨基酸"、"非天然编码氨基酸"、"非天然存在氨基酸"和其各种带连字符和不带连字符形式。术语"非天然编码氨基酸"也包含但不限于通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码氨基酸(包含但不限于20种常见氨基酸或焦赖氨酸和硒半胱氨酸)产生，但其自身并非通过翻译复合物天然并入生长多肽链中的氨基酸。这些非天然存在氨基酸的实例包含但不限于A^乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、A^乙酷基葡糖胺基-L-苏氨酸和0-磷酸酪氨酸。"氨基末端修饰基"指的是可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，"羧基末端修饰基"指的是可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基包含但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(诸如血清白蛋白)，或增加肽的血清半衰期的其它部分。术语"官能团"、"活性部分"、"活化基团"、"离去基"、"反应活性位点"、"化学反应性基团"和"化学反应部分"用于所属
技术领域：
中和本文中是指分子的独特的可定义部分或单位。这些术语在化学技术中有些同义且用在本文中来指示实施一些功能或活性且可与其它分子反应的分子部分。术语"键"或"键联剂"用在本文中是指通常由于化学反应形成且通常为共价键的基团或键。水解稳定键意谓键在水中实质上稳定且在有用pH值下(其包含但不限于在生理条件下)长时期地、或许甚至无限期地不与水反应。水解不稳定或可降解键意谓键可在水或水溶液(包含例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解键意谓键可由一种或一种以上酶降解。如在所属
技术领域：
中所理解，PEG和相关聚合物在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中可包含可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键在生理条件下通常水解以释放药剂。其它可水解降解键包含但不限于碳酸酯键；由胺与醛反应所产生的亚胺键；由醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的縮醛键；作为甲酸酯与醇的反应产物的原酸酯键；由胺基(包含但不限于在诸如PEG的聚合物末端处的胺基)与肽的羧基形成的肽键；和由亚磷酰胺基(包含但不限于在聚合物末端处的亚磷酰胺基)与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。术语"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性剂"在用于本文中时意谓可影响生物有机体(包含但不限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人类)的任何物理或生物化学性质的任何物质。特定来说，如本文中所用，生物活性分子包含但不限于打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或用于以其它方式增强人类或动物的身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包含但不限于肽、蛋白质、酶、小分子药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶团。适用于本发明的生物活性剂的种类包含但不限于抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、抗炎药、抗肿瘤药、心血管类药物、抗焦虑药、激素、生长因子、类固醇类药物等等。"双官能聚合物"指的是包括两个能够与其它部分(包含但不限于氨基酸侧基)特异性反应以形成共价键或非共价键的不连续官能团的聚合物。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能键联剂可用于形成包含第一生物活性组分、双官能键联剂和第二生物活性组分的接合物。已知用于将各种化合物与肽连接的众多程序和键联剂分子。例如参看欧洲专利申请案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4，680，338号、第4,569,789号和第4,589,071号，其是以引用的方式并入本文中。"多官能聚合物"指的是包括两个或两个以上能够与其它部分(包含但不限于氨基酸侧基)特异性反应以形成共价键或非共价键的不连续官能团的聚合物。如果取代基是由从左向右书写的其常规化学式指定，那么其同样涵盖从右向左书写结构所得到的化学上相同的取代基，例如，结构-CH20-等同于结构-OCH2-。术语"取代基"包含但不限于"无干扰取代基"。"无干扰取代基"为产生稳定化合物的那些基团。适合的无干扰取代基或基团包含但不限于卤基、Crdo烷基、C2-C10稀基、C2-C10'块基、C广Cio院氧基、Ci-C!2芳院基、Ci-Ci2院芳基、C3-C12环院基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-d2烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、CVd2芳氧基垸基、C7-d2氧基芳基、d-C6垸基亚磺酰基、d-do垸基磺酰基、-(<:!12)1-0-((:1-(:1()烷基)(其中m为i至s)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟垸基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-N02、-CN、-NRC(O)-(d-Cn)垸基)、-C(OHd-do烷基)、C2-do烷基硫烷基、-C(O)O-(d-do垸基)、-OH、-S02、=S、-COOH、-NR2、羰基、-C(0)-(d-do烷基)-CF3、-C(0)-CF3、-C(0)NR2、-(C广d。芳基)-S-(C6-do芳基)、-C(O)-(Ci-Cn)芳基)、-(CH2)m-0-(-(CH2)nrO-(d陽Cn)烷基)(其中各m为l至8)、-C(0)NR2、-C(S)NR2、-S02NR2、-NRC(0)NR2、-NRC(S)NR2、其盐等等。如本文中所用的R各自为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。术语"卤素"包含氟、氯、碘和溴。除非另外说明，否则自身或作为另一取代基的部分的术语"烷基"意谓直链或支链或环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和且可包含具有指定数目碳原子(即d-Cu)意谓1至10个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包含但不限于诸如以下各基的基团甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和垸基为具有一个或一个以上双键或三键的垸基。不饱和垸基的实例包含但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(l,4-戊二烯基)、乙炔基、l-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基和更高同系物和异构体。除非另外说明，否则术语"烷基"也打算包含在下文中更详细定义的那些烷基衍生物，诸如"杂垸基"。限于烃基的烷基被称作"均垸基"。自身或作为另一取代基的部分的术语"亚烷基"意谓由烷烃衍生的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，且进一步包含下文描述为"亚杂烷基"的那些基团。通常，垸基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子，其中在本发明中优选具有10个或更少碳原子的那些基团。"低碳烷基"或"低碳亚烷基"为通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。术语"烷氧基"、"烷基氨基"和"烷基硫基"(或硫烷氧基)是以其常规意义使用，且指的是分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的那些烷基。除非另外说明，否则自身或与另一术语组合的术语"杂烷基"意谓由指定数目的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成的稳定直链或支链或环状烃基或其组合，且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。一个或一个以上杂原子0、N和S和Si可位于杂垸基的任何内部位置或垸基与分子的其余部分连接的位置。实例包含但不限于-CH2-CH2-0-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(0)-CH3、-CH2-CH2-S(0)2-CH3、-CH=CH-0-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH-CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可为连续的，诸如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-0-Si(CH3)3。类似地，自身或作为另一取代基的部分的术语"亚杂烷基"意谓由杂垸基衍生的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基来说，相同或不同杂原子也可占据链末端的一端或两端(包含但不限于亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚垸基氨基、亚垸基二氨基、氨氧基亚烷基等等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基键联基团来说，由键联基团的化学式书写的方向来暗示键联基团的无方向性。举例来说，式《(0)211'-表示-C(0)2R'-与-R'C(0)2-。除非另外说明，否则自身或与其它术语组合的术语"环烷基"和"杂环烷基"分别表示"垸基"和"杂烷基"的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包含饱和与不饱和环键。另外，对于杂环垸基来说，杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包含但不限于环戊基、环己基、l-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环垸基的实例包含但不限于l-(l,2，5,6-四氢吡啶基)、l-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、l-哌嗪基、2-哌嗪基等等。另外，所述术语涵盖双环和三环环结构。类似地，自身或作为另一取代基的部分的术语"亚杂环烷基"意谓自杂环垸基衍生的二价基团，且自身或作为另一取代基的部分的术语"亚环烷基"意谓自环烷基衍生的二价基团。如本文中所用，术语"水溶性聚合物"指的是可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与hGH多肽的键联可产生以下改变，其包含但不限于相对于未经修饰形式增加或经调节的血清半衰期或增加或经调节的治疗半衰期、经调节的免疫原性、经调节的物理缔合特性(诸如聚集和多聚体形成)、改变的受体结合和改变的受体二聚或多聚。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身生物活性。适合聚合物包含但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单Q-do烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中,其是以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、AK2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包含硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包含但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷撑二醇和其衍生物、聚垸撑二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚和a-p-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。这些水溶性聚合物的实例包含但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。如本文中所用，术语"聚垸撑二醇"或"聚(烯烃二醇)"指的是聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语"聚垸撑二醇"涵盖线性和分枝聚合物且平均分子量介于O.lkDa与100kDa之间。其它例示性实施例列于(例如)商业供应商目录中，诸如ShearwaterCorporation的目录"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications"(2001)。除非另外说明，否则术语"芳基"意谓可为单环或稠合在一起或共价键联的多环(优选1至3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语"杂芳基"指的是含有1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子视情况经氧化，且一个或一个以上氮原子视情况经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包含苯基、l-萘基、2-萘基、4-联苯基、l-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、l-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一者的取代基选自下文所述的可接受取代基的群组。为了简便起见，当与其它术语(包含但不限于芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)组合使用时，术语"芳基"包含如上所定义的芳基与杂芳基环。因此，术语"芳基烷基"打算包含其中芳基与垸基连接的那些基团(包含但不限于苄基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，垸基包含其中碳原子(包含但不限于亚甲基)已经(例如)氧原子置换的那些烷基(包含但不限于苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(l-萘基氧基)丙基等等)。以上术语(包含但不限于"垸基"、"杂烷基"、"芳基"和"杂芳基")各自打算包含指定基团的经取代与未经取代形式。每一类型基团的例示性取代基提供于下文。烷基和杂垸基(包含通常被称作亚烷基、烯基、亚杂垸基、杂烯基、炔基、环垸基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可为选自(但不限于)以下各基的多种基团中的一种或一种以上-OR',O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-c02R'、-CONR'R"、-OC(O)置R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(0)2R，、祖-C(NR'R"R'""NR""、-NR-C(NR'R")=NR"，、-S(O)R'、S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-nrs02R'、-CN和-n02，其数目在0至(2m'+l)的范围内，其中m'为此基团中碳原子的总数。R'、R"、R'"和R""各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂垸基、经取代或未经取代芳基(其包含但不限于经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基垸基。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R'"和R""基团一样独立地选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包含但不限于l-吡咯垸基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语"烷基"打算包含包括与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤烷基(包含但不限于-CF3和-CHbCF3)和酰基(包含但不限于-C(0)CH3、-c(o)cf3、-<:(0)<:820(:113等等)。与对于烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基经改变且选自(但不限于)卣素、-OR'、=0、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、C(O)R'、-c02R'、-CONR'R"、國OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(0)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR"'、-S(O)R'、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-nrs02R'、-CN和-N02、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(CrC4)烷氧基和氟(d-C4)烷基，其数目在O至芳香族环系统上开放价态的总数的范围内；且其中R'、R"、R'"和R""独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R'"和R""基团一样独立地选择。如本文中所用，术语"经调节的血清半衰期"意谓经修饰生物活性分子相对于其未经修饰形式的循环半衰期的阳性或阴性变化。通过在投与生物活性分子后各个时间点取血样且测定每一样品中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相互关系允许计算血清半衰期。希望增加的血清半衰期具有至少约两倍的增加，但较小增加也可为有用的，例如当其能够促成令人满意的给药方案或避免毒性作用的情况。在一些实施例中，增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。如在本文中所用的术语"经调节的治疗半衰期"意谓治疗有效量的经修饰生物活性分子相对于其未经修饰形式的半衰期的阳性或阴性变化。通过在投与后各个时间点测量分子的药物动力学和/或药效性质来测量治疗半衰期。希望增加的治疗半衰期能够促成特定有益给药方案、特定有益总剂量或避免不需的效应。在一些实施例中，增加的治疗半衰期是由增加的效力、经修饰分子与其标靶的增加或降低的结合或未经修饰分子的另一参数或作用机制的增加或降低而产生。当应用于核酸或蛋白质时，术语"经分离"表示核酸或蛋白质实质上不含在天然状态下与其有关的其它细胞组分。其可为均质状态。经分离物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液(其包含但不限于水溶液)形式。通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质上经纯化。特定来说，经分离基因是自侧接基因且编码除所关注基因之外的蛋白质的开放阅读框分离。术语"经纯化"表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上一个条带。其尤其意谓核酸或蛋白质为至少85%纯、至少90%纯、至少95%纯、至少99%纯或更纯。术语"核酸"指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合性质且是以类似于天然存在核苷酸的方式代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫逐磷酸酯、氨基磷酸酯等等)。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变体(包含但不限于简并密码子取代)和互补序列和明确指示的序列。特定来说，通过产生其中一种或一种以上经选定(或所有)密码子的第三位置是经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，7Vwc/"c爿"W及仏19:5081(1991);Ohtsuka等人，乂5/o/.C/zew.260:2605-2608(1985);和Cassol等人，(1992);Rossolini等人，Mo/.Ce〃.Pra6es8:91-98(1994))。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"可在本文中互换使用来指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，且反之亦然。所述术语适用于天然存在氨基酸聚合物和其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如在本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白质(即，抗原)，其中氨基酸残基是通过共价肽键键联。术语"氨基酸"指的是天然存在和非天然存在氨基酸，和以类似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构的化合物，S卩，与氢、羧基、氨基和R基团结合的a碳，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰R基团(诸如，正亮氨酸)或经修饰肽主链，但保持与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。在本文中可由氨基酸的通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号来指代氨基酸。同样，可由核苷酸的通常接受的单字母编码来指代核苷酸。"保守性修饰变体"适用于氨基酸与核酸序列。对于特定核酸序列来说，"保守性修饰变体"指的是编码一致或基本上一致氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不将氨基酸序列编码成基本上一致序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子表示丙氨酸的每一位置处，密码子可改变为所述相应密码子中的任一个而不会改变所编码多肽。这些核酸变异为"沉默变异"，其为保守性修饰变化的一种。编码多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一可能沉默变异。所属领域的技术人员应认识到核酸中的每一密码子(除AUG和TGG之外，AUG通常为甲硫氨酸的唯一密码子，且TGG通常为色氨酸的唯一密码子)可经修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一沉默变异在每一所述序列中为隐含的。至于氨基酸序列，所属领域的技术人员应认识到改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为"保守性修饰变体"，其中所述改变使得氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。所属
技术领域：
中众所周知提供功能类似氨基酸的保守性取代列表。这些保守性修饰变体是在本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的范围之外且不将其排除在外。以下八组各自含有作为彼此的保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(例如参看Creighton，iVo^>w:S^w"wmsam/Mo/ecw/wiVqpeW^(WHFreeman&Co.;第2版(1993年12月))在两个或两个以上核酸或多肽序列的上下文中，术语"一致"或"一致性"百分比指的是相同的两个或两个以上序列或子序列。当经比较视窗比较且比对最大符合或如使用以下序列比较算法中的一种或通过手工比对且目测检査所测量指定区域时，如果其具有相同(即，在指定区域上约60%—致性，视情况约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%—致性)的氨基酸残基或核苷酸百分比，那么序列为"实质上一致"。此定义也指测试序列的补体。一致性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或(在未指定时)在整个序列或聚核苷酸或多肽上。对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。在使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。如本文中所用，"比较视窗"包含参考选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的群组的连续位置数中的任一者的区段，其中在两个序列经最佳比对之后，序列可与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。所属
技术领域：
中众所周知用于比较的序列比对方法。可通过以下方法进行用于比较的最佳序列比对，这些方法包含但不限于Smith和Waterman(1970)Jdv.Ma仇2:482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)/i^o/.所o/.48:443的同源比对算法；Pearson和Lipman(1988)Ato7.JcW.Scz'.85:2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或手工比对和目测检査(例如参看Ausubel等人，Cw"eWPrafoco/sMo/ecw/ar5z'o/ogy(1995年增刊))。适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1977)iVwc.乂c/A及"25:3389-3402和Altschul等人，(1990)/.Mo/.别o/.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开获得。BLAST算法参数W、T和X测定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列来说)使用字长(W)11、期望值(E)10、M=5、！^=-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10作为默认值，且BLOSUM62得分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1989)/Voc.A^/.爿c^/.Sci.89:10915)使用比对数(B)50、期望值(E)10、M=5、\=-4和两条链的比较作为默认值。通常在"低复杂性"过滤器关闭的情况下进行BLAST算法。BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)Prac.Ato/.爿cad90:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(smallestsumprobability,P(N)),其提供关于两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指标。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2、更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，那么认为核酸类似于参考序列。短语"与......选择性(或特异性)杂交"指的是当复杂混合物(包含但不限于总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、二联或杂交。短语"严格杂交条件"指的是如所属
技术领域：
中已知的低离子强度和高温条件。通常，在严格条件下，探针会与核酸的复杂混合物(包含但不限于总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA)中的其靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件具序列依赖性且在不同环境下会不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen，7fec/zm々,/"5/oc/ze附旨yMo/"w/a/"~砂6〃W/zWonw"/zM/c/e/c/Vo6es,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中。对于在指定离子强度pH值下的特异性序列来说，严格条件通常经选定为低于热熔点(Tm)约5°C-10°C。Tm为与标靶互补的探针的50%与靶序列杂交处于平衡(因为靶序列过量存在，在Tm下，在平衡时占据50%的探针)时的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)。严格条件可为在pH值7.0至8.3下盐浓度小于约l.OM钠离子、通常约0.01M至1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包含伹不限于10至50个核苷酸)来说为至少约3(TC且对于长探针(包含但不限于大于50个核苷酸)来说为至少约6(TC的那些条件。也可通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交来说，正信号可为至少两倍背景、视情况10倍背景杂交。例示性严格杂交条件可为如下50%甲酰胺、5xSSC和1%SDS，在42。C下培育；或5xSSC、1%SDS，在65。C下培育，其中在65。C下在0.2xSSC和0.P/。SDS中洗涤。这些洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。如本文中所用，术语"假单胞菌种"或"假单胞菌宿主细胞"或"假单胞菌种和自其获得的菌株"指的是假单胞菌属的已知或待鉴别物种中的任一种，其包含但不限于荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌等以及其后代和其化学或遗传修饰形式和其后代。如本文中所用，术语"个体"指的是动物，优选哺乳动物，最优选人类，其为治疗、观察或实验的对象。如本文中所用的术语"有效量"指的是所投与的(经修饰)非天然氨基酸多肽的量，所述量会在一定程度上减轻欲治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。可投与含有本文中所述的(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以进行预防性、增强性和/或治疗性治疗。术语"增强"意谓所需效应的效力或持续时间增加或延长。因此，对于增强治疗剂的效应来说，术语"增强"指的是增加或延长其它治疗剂对系统的效应的效力或持续时间的能力。如本文中所用，"增强有效量"指的是足以增强另一治疗剂在所需系统中的效应的量。当用于患者中时，对于此用途有效的量将视以下因素而定疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应和主治医师的判断。如本文中所用，术语"经修饰"指的是在多肽上存在翻译后修饰。形式"(经修饰)"术语意谓多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论多肽可经修饰或未经修饰。术语"经翻译后修饰"和"经修饰"指的是在天然或非天然氨基酸已并入多肽链中之后，对所述氨基酸发生的天然或非天然氨基酸的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译活体内修饰、翻译后活体内修饰和翻译后活体外修饰。在预防应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与易患上特定疾病、病症或病状或以其它方式处于特定疾病、病症或病状的风险下的患者。所述量经定义为"预防有效量"。在此使用中，精确量也视患者的健康状况、体重等等而定。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述预防有效量是在所属领域的技能范围内。术语"经保护"指的是存在防止化学反应性官能团在特定反应条件下发生反应的"保护基"或部分。保护基将视欲保护的化学反应性基团的类型而定。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-B0C)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苄基或诸如甲基、乙基或叔丁基的垸基。所属
技术领域：
中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与其一起使用。仅举例来说，阻断/保护基团可选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>三苯甲基h3ct乙酰基其它保护基描述于Greene和Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork,NY,1999中，其是以引用的方式全部并入本文中。在治疗应用中，将足以治愈或至少部分抑制疾病、病症或病状的症状的量的含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与已罹患疾病、病状或病症的患者。所述量经定义为"治疗有效量"，且将视以下因素而定疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应和主治医师的判断。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量是在所属领域的技能范围内。术语"治疗"是用于指预防性和/或治疗性治疗。如本文中所用，术语"正交"指的是所关注系统(例如，翻译系统，例如细胞)以降低效率使用的分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS))。正交指的是无能或效率降低，例如小于20%有效、小于10%有效、小于5%有效或例如小于1%有效的正交tRNA和/或正交RS在所关注翻译系统中起作用。举例来说，当与由内源RS使内源tRNA氨基酰基化相比时，所关注翻译系统中的正交tRNA以降低的效率或甚至零效率使所关注翻译系统的任何内源RS氨基酰基化。在另一实例中，与由内源RS使内源tRNA氨基酰基化相比，正交RS以降低的效率或甚至零效率使所关注翻译系统中的任何内源tRNA氨基酰基化。优先氨基酰基化:术语"优先氨基酰基化"指的是与用于产生O-tRNA的天然存在tRNA或起始物质相比，O-RS使具有非天然氨基酸的O-tRNA氨基酰基化时例如约70%有效、约71%有效、约72%有效、约73%有效、约74%有效、约75%有效、约76%有效、约77%有效、约78%有效、约79%有效、约80%有效、约85%有效、约90%有效、约95%有效或约99%有效或更为有效的效率。非天然氨基酸随后在(例如)对于给定选择密码子来说大于约70%有效、约71%有效、约72%有效、约73%有效、约74%有效、大于约75%效率，对于给定选择密码子来说大于约80%效率，对于给定选择密码子来说大于约85%效率，对于给定选择密码子来说大于约90%效率，对于给定选择密码子来说大于约95%效率，或对于给定选择密码子来说大于约99%或更大效率的高保真度下并入生长多肽链中。选择密码子:术语"选择密码子"指的是在翻译过程中由O-tRNA识别且并不由内源tRNA优先识别的密码子。O-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择密码子且在此位点处将其氨基酸(例如，非天然氨基酸)并入多肽中。选择密码子可包含但不限于例如无义密码子，诸如，终止密码子，例如，琥珀、赭石和蛋白石密码子；四个或四个以上碱基密码子；由天然或非天然碱基对衍生的密码子等等。对于给定系统来说，选择密码子也可包含天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用所述天然三碱基密码子，例如，缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统或其中天然三碱基密码子为稀有密码子的系统。抑制tRNA:抑制tRNA为改变给定翻译系统中信使RNA(mRNA)的读取的tRNA。抑制tRNA可通过(例如)终止密码子、四碱基密码子或稀有密码子进行读取。翻译系统:术语"翻译系统"指的是将天然存在氨基酸并入生长多肽链(蛋白质)中所必需的组分。翻译系统的组分可包含(例如)核糖体、tRNA、合成酶、mRNA等等。本发明的组分可在活体内或活体外添加到翻译系统中。翻译系统可为原核细胞(例如，大肠杆菌细胞)或真核细胞(例如，酵母、哺乳动物、植物或昆虫细胞)。除非另外说明，否则使用在所属
技术领域：
的技能范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。无具体实施方式I.引言在本发明中提供在假单胞菌宿主细胞中产生的包括至少一个非天然编码氨基酸的多肽分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然编码氨基酸的多肽包含至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包括利用适用于特定反应性基团的所属领域的一般技术人员已知的化学方法，使包括第二反应性基团的分子与至少一个包括第一反应性基团的非天然编码氨基酸连接，所述包括第二反应性基团的分子包含但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳键联的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包含但不限于在非天然编码氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也被称作乙炔部分)，且第二反应性基团为叠氮基部分，且利用[3+2]环加成化学方法。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包含但不限于在非天然编码氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰hGH多肽的某些实施例中，使用至少一个包括至少一个翻译后修饰的非天然编码氨基酸(包含但不限于含有酮基官能团的非天然编码氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包括糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中在活体内进行。在某些实施例中，蛋白质包含至少一个由一种宿主细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包含至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包含但不限于乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成(palmitateaddition)、磷酸化、糖脂键联修饰等等。在一个实施例中，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖与天冬酰胺连接(包含但不限于其中寡糖包括(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等等)。在另一个实施例中，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖(包含但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包括分泌或定位序列、附加表位、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等等。所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然编码氨基酸。非天然编码氨基酸可相同或不同，例如，在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或IO个以上不同位点可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同非天然编码氨基酸。在某些实施例中，蛋白质的天然存在形式中所存在的特定氨基酸中的至少一个但少于全部经非天然编码氨基酸取代。本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的接合物，所述其它物质包含但不限于标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反义聚核苷酸；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。本发明也包含具有叠氮基或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮基部分的PEG聚合物衍生物的接合物。举例来说，含有叠氮基部分的PEG聚合物可在蛋白质中含有带有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的位置处与生物活性分子偶合。偶合PEG与生物活性分子的键包含但不限于Huisgen[3+2]环加成产物。在所属
技术领域：
中已确定PEG可用于修饰生物材料的表面(例如参看美国专利第6,610,281号；Mehvar,R.，J.Pharmaceut.Sci.，3(1):125-136(2000)，其是以引用的方式并入本文中)。更特定来说，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以产生其上具有反应性更强部分(诸如甲磺酸根、三氟乙基磺酸根、甲苯磺酸根或卤素离去基)的经取代聚合物。熟练技术人员众所周知含有磺酰基卤、卤素原子和其它离去基的PEG衍生物的制备和使用。所得经取代聚合物随后经历反应以在聚合物末端处取代反应性更强部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物经历与键联剂的反应以使得在PEG聚合物与键联剂之间形成共价键且反应性基团位于聚合物的末端。熟练技术人员众所周知亲核和亲电子部分，其包含胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等等。本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示用于本发明中的通用方法的基础文章包含Sambrook等人,Mo/ecw/arC7ow'"g,^丄a6omfo7M聰a/(第3版，2001);Kriegler,Gewe7yYms/eram/5bc/re肌'ow..爿Za6ora^yMawwa/(1990);和Cwrrew/"iVotoco/s/wMo/ecw/ar5!o/ogy(Ausubel等人编，1994)。描述分子生物技术的一般文章包含Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzvmology第152巻AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA(Berger);Sambrook等人，MolecularCloning-ALaboratoryManual(第2版)，第1-3巻,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989("Sambrook")和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人编，CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.与JohnWiley&Sons,Inc.的合资，(于1999年增补)("Ausubel"))。这些文章描述突变诱发、载体和启动子的使用和许多其它相关主题，其涉及(包含但不限于)包含用于制备包含非天然编码氨基酸、正交tRNA、正交合成酶以及其对的蛋白质的选择密码子的基因的产生。各种类型的突变诱发是出于多种目的用于本发明中，其包含但不限于为产生tRNA文库、为产生合成酶文库、为产生选择密码子、为在所关注蛋白质或多肽中插入编码非天然编码氨基酸的选择密码子。所述突变诱发包含但不限于定点突变诱发、随机点突变诱发、同源重组、DNA改组或其它递归突变诱发方法、嵌合建构、使用含尿嘧啶模板的突变诱发、寡核苷酸定向突变诱发、硫逐磷酸酯修饰DNA突变诱发、使用缺口双链DNA的突变诱发等等，或其任何组合。其它适合方法包含点错配修复、使用修复缺陷宿主菌株的突变诱发、限制选择和限制纯化、缺失突变诱发、通过总基因合成进行的突变诱发、双链断裂修复等等。(包含但不限于)涉及嵌合构筑体的突变诱发也包含在本发明中。在一个实施例中，可由天然存在分子或改变或突变的天然存在分子的已知信息(包含但不限于序列、序列比较、物理性质、晶体结构等等)来指导突变诱发。在本文中出现的文章和实例描述这些程序。其它信息见于以下公开案和其中引用的参考文献中Ling等人,却/raacAe51ZW/4ww^3ge/^/5voverv/ew,AnalBiochem.254(2):157-178(1997);Dale等人，(9//gowwc/eo^ie-^e"e<iram/o附腦啤ewe^ws/wg;/o一oto餘她w"/kk/，MethodsMol,Biol,57:369-374(1996);Smith，v/的wwtogew^/51，Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985);Botstein禾卩Shortle，Sfrafeg/^am/appZ/ca^oAw0/Wfro歸啤ewes/s，Science229:1193-1201(1985);Carter,S7^-^e"ed/wwfagewe^51，Biochem.,237:1-7(1986);Kunkel，7Tzee^"'ewc少o/0//gowwc/eo"V/e附wmge"es/51,在NucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein,F.和Lilley，D.M.J编，SpringerVerlag，Berlin)(1987)中；Kunkel,朋de^deWs"e-s/e"yc/ww〖age"ew^-■vWAowf一"o妙fc油crio",Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985);Kunkel等人，ia/zWgj^cz'eWs"e邵ec诉c/n由gewe^w"AoW//zewo妙/cse/ec"ow,MethodsinEnzvmol.154，367-382(1987);Bass等人，Afw&"f7>pw;wmo〃w"/z"ewDA^4-6/"^"g印e"y""es，Science242:240-245(1988);MethodsinEnzvmol.100:468-500(1983);MethodsinEnzvmol.154:329-350(1987);Zoller和Smith,0//go"wc/eo"V/e-A>e"ec/"cm"/o"o/;o/"f腦加/ow/"，ZWJ/ragwe""NucleicAcidsRes.10:6487-6500(1982);Zoller和Smith,O"go聰c/eo/We-^e"edw由gewe^c/o"ed/"foM73ve"o",MethodsinEnzvmol.100:468-500(1983);Zoller和Smith,aw'"g/e-Wm"cfec/DA^4few;/a&，MethodsinEnzvmol.154:329-350(1987);Taylor等人，ZM^4,Nucl.AcidsRes.13:8749-8764(1985);Taylor等人，7Tzeo/o"go聰c/eo"fife-力re"ed腦她ow加/z妙加,，肌'"gpAo一ora^z'oo^-膨鄉edNucl.AcidsRes.13:8765-8787(1985);Nakamaye和Eckstein,/w/n.6"/ow0/w"Wc"0wo//gowwc/eo"Uz>e"ec/腦啤ewes7、Nucl.AcidsRes.14:9679-9698(1986);Sayers等人，y-rfico肌c/eosesz'wj^o印AorW/n'o她-6o^e(io/z'gowwc/eo"We-i/z>ecfe<i附由gewe我Nucl.AcidsRes.16:791-802(1988);Sayers等人，5pec折cc/eavage0//^o^/ior。/"/nWw附Z^o脂We,(1988)Nucl.AcidsRes.16:803-814;Kramer等人，7Tzega/peddwp/e;cD假a//raafc/io"go""c/eo"Uz>e"ei/腦她'o"cow欲t/c"'ow,Nucl.AcidsRes.12:9441-9456(1984);Kramer和Fritz(9"gowwc/eo"'c/e-f/z>e"edcow欲wc"o"0/腦fa"owsv/agappeddi(p/e;cZW」，MethodsinEnzvmol.154:350-367(1987);Kramer等人，/mpraveoe"z戸加'c/"vz'加reac"o"51ga;7pedIW乂a//raac/jto0//go聰c/eo"We-Wre"edco"Wr"c"o"o/wwfa"ora，Nucl.AcidsRes.16:7207(1988);Fritz等人，e"，fl"cmi"z'o/wv"ra,Nucl.AcidsRes.16:6987-6999(1988);Kramer等人，PointMismatchRepair,￡^138:879-887(1984);Carter等人，/w/77"ovedo//go"wc/eo"We*-(/z>e"ed加由gewe57jve"ors,Nucl.AcidsRes.13:4431-4443(1985);Carter,/附/ravet/o/z'go"Mc/eo"<ie-<iz'rg"e(iwwtoggwew'sww'MgMZ3vg"o",MethodsinEnzvmol.154:382-403(1987);Eghtedarzadeh和Henikoff，C/seo/0/fgo肌c/eo"Vfesto/argede/"/ows，Nucl.AcidsRes.14:5115(1986》Wells等人，7w/w咖ceo/A>^,ogew-6om//onwflriowz'w5ffl6z7/z/"g//ze^ww/"'owW她o/^"7/57'w，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317:415-423(1986);Nambiar等人，7bfa/wwAe57'51andc/owz'wg0/ageweco力"g/orW6owwc/e<xye51jwoWw，Science223:1299-1301(1984);Sakamar和Khorana，7b/a/""/Zie^肌c/eo"We-6zW/wg/rofe/M〃rfl/^Mc/w),Nucl.AcidsRes.14:6361-6372(1988);Wells等人,s7to，34:315-323(1985);Grundstrom等人,(9"gowwc/eoOWe-dz>e"ed腦啤ene^/w/trasca/e's/io,層gww'，Ae我Nucl.AcidsRes.13:3305-3316(1985);Mandecki,zw"Aoc/or57'fe-spe,cww啤ewe我Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986);iVoW"/orw"tww"/e"Wra腦e船，CurrentOpinioninBiotechnology4:450-455(1993);Sieber等人，NatureBiotechnology,19:456-460(2001);W.P.C.Stemmer，Nature370,389-91(1994);和I.A.Lorimer,I.Pastan，NucleicAcidsRes.23，3067-8(1995)。关于众多上述方法的其它细节可见于MethodsinEnzvmologv第154巻中,其也描述对于各种突变诱发方法带来的故障检修问题的有用控制。本发明涉及通过正交tRNA/RS对用于活体内并入非天然编码氨基酸的假单胞菌宿主细胞。假单胞菌宿主细胞经基因工程改造(包含但不限于转化、转导或转染)具有本发明的聚核苷酸或包含本发明的聚核苷酸的构筑体(其包含但不限于本发明的载体，其可为(例如)克隆载体或表达载体)。载体可为(例如)质粒、细菌、病毒、裸聚核苷酸或接合聚核苷酸的形式。载体可通过标准方法引入细胞和/或微生物中，所述方法包含电穿孔(From等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82.5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上由具有核酸的小粒子高速弹道渗透(Klein等人，Nature327,70-73(1987))。经改造假单胞菌宿主细胞可于经调节适用于诸如筛检步骤、活化启动子或选择转化株的活动的常规营养培养基中培养。包含但不限于关于细胞分离和培养(例如，关于随后的核酸分离)的其它有用参考文献包含Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版，Wiley-Liss，NewYork禾口其中引用的参考文献；Payne等人,(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY;Gamborg和Phillips(编)(1995)PlantCell.TissueandOrganCulture:FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)和Atlas和Parks(编)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL。可使用将靶核酸引入细胞中的若干种众所周知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包含受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法以及经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长至对数生长期且可通过所属
技术领域：
中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参看Sambrook)。另外，在市场上购得多种试剂盒以自细菌中纯化质粒(例如参看都来自PharmaciaBiotech的EasyPrepTM、FlexiPrep;来自Stratagene的StrataClean;和来自Qiagen的QIAprep)。随后进一步操作经分离且经纯化的质粒以产生其它质粒，所述质粒用于转染细胞或并入相关载体中以感染有机体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调节特定靶核酸的表达的启动子。载体视情况包括通用表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者(包含但不限于穿梭载体)中复制的序列以及用于原核系统与真核系统的选择标记。载体适用于在原核细胞、真核细胞或优选两者中复制且整合。参看Giliman和Smith,Gene8:81(1979);Roberts等人，Nature.328:731(1987);Schneider,B.等人，ProteinExpr.Purif.6435:10(1995);Ausubel,Sambrook,Berger(都同上文)。适用于克隆的细菌和噬菌体的目录由(例如)ATCC提供，例如，由ATCC出版的TheATCCCatalogueofBacteriaandBacteriophage(1992)Gherna等人(编)。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑也见于Watson等人(1992)RecombinantDNA第2版ScientificAmericanBooks,NY中。另外，基本上任何核酸(以及实际上任何标记核酸，无论标准或非标准)都可自多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源诸如MidlandCertifiedReagentCompany(Midland,TX，可通过万维网在mcrc.com上获得)、TheGreatAmericanGeneCompany(Ramona,CA，可通过万维网在genco.com上获得)、ExpressGenInc.(Chicago,IL，可通过万维网在expressgen.com上获得)、OperonTechnologiesInc.(Alameda,CA)和许多其它来源。选择密码子本发明的选择密码子扩展蛋白质生物合成机构的'遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包含但不限于唯一三碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，其包含但不限于琥珀密码子(UAG)或蛋白石密码子(UGA)或赭石密码子(UAA))、含非天然核苷的密码子、四个或四个以上碱基密码子、稀有密码子等等。所属领域的一般技术人员易于了解可引入所需基因中的选择密码子的数目范围很广，其包含但不限于在编码至少一部分多肽的单一聚核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上。在一个实施例中，所述方法涉及使用作为在活体内将非天然编码氨基酸并入真核细胞中的终止密码子的选择密码子。举例来说，产生识别终止密码子(包含但不限于UAG)的O-tRNA，且通过具有所需非天然编码氨基酸的O-RS使其氨基酰基化。此O-tRNA并不由天然存在宿主的氨基酰基-tRNA合成酶识别。常规定点突变诱发可用于在所关注多肽中的所关注位点处引入终止密码子(包含但不限于TAG)。例如参看Sayers,J.R.等人，(1988),5',3'五xowwdeayez'w/^o印/jora^i/od^e-6oyeco//gowwc/eo"We-J/rec/edm由geweiNucleicAcidsRes,791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注多肽的核酸在活体内组合时，回应UAG密码子而并入非天然编码氨基酸以得到在指定位置处含有非天然编码氨基酸的多肽。可在假单胞菌宿主细胞无显著扰动的情况下在活体内进行非天然编码氨基酸的并入。举例来说，因为对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包含但不限于琥珀抑制tRNA)与释放因子(其与终止密码子结合且启动核糖体释放生长肽)之间的竞争，所以可通过(包含但不限于)增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表达水平来调节抑制效率。选择密码子也包括延长密码子，其包含但不限于四个或四个以上碱基密码子，诸如，四个、五个、六个或六个以上碱基密码子。四碱基密码子的实例包含(包含但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等等。五碱基密码子的实例包含但不限于AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等等。本发明的特征包含使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基密码子可将(包含但不限于)一个或一个以上非天然编码氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在突变O-tRNA(包含但不限于具有反密码子环(例如，具有至少8-10个核苷酸反密码子环)的特定移码抑制tRNA)存在的情况下，四个或四个以上碱基密码子被读成单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码(包含但不限于)至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基密码子。因为存在256种可能的四碱基密码子，所以可使用四个或四个以上碱基密码子在同一细胞中编码多种非天然编码氨基酸。参看Anderson等人，(2002)Exp/oWwgf/ie丄/附/"o/Coc/o"or"d爿"rico^fo"Sfee,ChemistryandBiology,9:237-244;Magliery,(2001)五x戸w力'"gf/ieCocte:5Wec"》wo/^7"'eWSwppmworsJ//7nac/iZ五sc/ie/"z'c/n'orco/z',J.Mol.Biol.307:755-769。举例来说，使用活体外生物合成方法，已经用四碱基密码子将非天然编码氨基酸并入蛋白质中。例如参看Ma等人，(1993)Biochemistry,32:7939;和Hohsaka等人，(1999)LAm.Chem.Soc.121:34。CGGG和AGGU用于在活体外通过两种化学酰化的移码抑制tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生蛋白链菌素中。例如参看Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121:12194。在活体内研究中，Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13%至26%的效率解码，其中在0或-l框架中几乎无解码。参看Moore等人,(2000)J.Mol.Biol.,298:195。在一个实施例中，以稀有密码子或无义密码子为基础的延长密码子可用于本发明中，其可降低在其它不需位点处的错义通读和移码抑制。对于给定系统来说，选择密码子也可包含天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，此包含缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或其中三碱基密码子为稀有密码子的系统。选择密码子视情况包含非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现有遗传代码。一个额外碱基对将三联密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包含稳定和选择性的碱基配对、通过聚合酶在高保真度下有效地酶促并入DNA中以及在合成初生非天然碱基对之后有效持续的引物延伸。可用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包含(例如)Hirao等人，(2002)爿ww朋a^a/6ase/a!>*/orf"co770ra""ga/m力oawa/ogwes/"fo/rafe/",NatureBiotechnology,20:177-182。其它相关公开案列于下文中。对于活体内使用来说，非天然核苷可透过膜且经磷酸化以形成相应三磷酸盐。另外，增加的遗传信息为稳定的且不受细胞酶破坏。Benner等人的先前努力利用不同于规范Watson-Crick对中的氢键合模式，其最值得注意的实例为iso-C:iso-G对。例如参看Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc111:8322;和Piccirilli等人，(1990)Nature,343:33;Kool，(2000)Gurr.Opin.Chem.Biol.,4:602.。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水填充相互作用可替代氢键合来驱动碱基对的形成。参看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602;和Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl"36，2825。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成且研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对比天然碱基对更稳定，且可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如参看McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11586;和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc.122:3274。可通过KF在对于生物功能来说足够的效率和选择性下合成3MN:3MN自身对。例如参看Ogawa等人，(2000)LAm.Chem.Soc.122:8803。然而，两种碱基都充当进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身对。另外，可复制7AI自身对。例如参看Tae等人，(2001).Am.Chem.Soc,123:7439。也已开发新颖金属碱基对Dipic:Py,其在结合Cu(II)后形成稳定对。参看Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc,122:10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用此性质来产生它们的正交tRNA。翻译旁路系统(translationalbypassingsystem)也可用于将非天然编码氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，大序列并入基因中，但并不翻译入蛋白质中。所述序列含有充当诱发核糖体跃过序列的线索且继续插入下游的翻译的结构。在某些实施例中，在本发明的方法和/或组合物中的所关注蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包括至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。可使用所属领域的技术人员众所周知且在本文中所述的方法诱变编码所关注蛋白质或多肽的基因以包含(例如)一个或一个以上选择密码子以并入非天然编码氨基酸。举例来说，针对所关注蛋白质的核酸经诱变以包含一个或一个以上选择密码子，以提供一个或一个以上非天然编码氨基酸的并入。本发明包含(例如)包含至少一个非天然编码氨基酸的任何蛋白的任何此种变异(包含但不限于突变)形式。类似地，本发明也包含相应核酸，即，具有编码一个或一个以上非天然编码氨基酸的一个或一个以上选择密码子的任何核酸。编码所关注蛋白质的核酸分子可容易地突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注蛋白质上。所属
技术领域：
中众所周知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置处的方法，诸如在美国专利第6,608,183号(其是以引用的方式并入本文中)中所述的那些方法，以及标准突变诱发技术。非天然編码薪基酸多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。任何数目的非天然编码氨基酸可引入多肽中。一般来说，经引入的非天然编码氨基酸实质上对20种常见遗传编码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)呈化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含可与20种常见氨基酸中未发现的官能团(包含但不限于叠氮基、酮、醛和氨氧基)有效且选择性地反应以形成稳定接合物的侧链官能团。举例来说，包含含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与聚合物(包含但不限于聚乙二醇)或者含有炔部分的第二多肽反应以形成稳定接合物，所述稳定接合物是由叠氮基与炔官能团的形成Huisgen[3+2]环加成产物的选择性反应形成。a-氨基酸的一般结构说明如下(式I):H2N'COOH非天然编码氨基酸通常为具有上述式(其中R基团为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)的任何结构，且可适用于本发明中。因为本发明的非天然编码氨基酸通常仅在侧链结构上不同于天然氨基酸，所以非天然编码氨基酸以其形成于天然存在多肽中的相同方式与其它氨基酸(包含但不限于天然或非天然编码氨基酸)形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有将其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说，R视情况包括垸基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基、硼(in)酸酯基、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等等或其任何组合。可适用于本发明中的其它所关注非天然存在氨基酸包含但不限于包括可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、结合金属的氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼蔽和/或可光异构化氨基酸、包括生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(诸如经糖取代的丝氨酸)、其它碳水化合物修饰氨基酸、含酮基氨基酸、包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解或可光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链(包含但不限于聚醚或长链烃，包含但不限于大于约5个或大于约IO个碳)的氨基酸、碳键联含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包括一个或一个以上毒性部分的氨基酸。可适用于本发明中且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包含但不限于具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物和炔反应性基团的那些非天然编码氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括糖部分。这些氨基酸的实例包含N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例也包含其中氨基酸与糖之间的天然存在N或O键是由在自然界中不常见的共价键(包含但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等等)置换的实例。这些氨基酸的实例也包含在天然存在蛋白质中不常见的糖，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等等。本文中提供的众多非天然编码氨基酸可购自(例如)Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(EMDBiosciences,Darmstadt,Germany的分公司)或Peptech(Burlington,MA,USA)。不可购得的那些非天然编码氨基酸是视情况如本文中所提供进行合成或使用所属领域的技术人员己知的标准方法进行合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon禾口Fessendon的OrganicChemistry,(1982，第2版，WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,WileyandSons,NewYork);和Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，A及B部分，1990,PlenumPress,NewYork)。也参看美国专利申请公开案第2003/0082575号和第2003/0108885号，其是以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然编码氨基酸之外，可适用于本发明中的非天然编码氨基酸也视情况包括(包含但不限于)如由式II和III的结构说明的经修饰主链结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>其中Z通常包括OH、NH2、SH、NH-R'或S-R';X和Y(其可相同或不同)通常包括S或O，且R和R'(其视情况相同或不同)通常选自上文对于具有式I的非天然编码氨基酸所述的R基团的相同组分列表以及氢。举例来说，本发明的非天然编码氨基酸视情况包括在如式II和III所示的氨基或羧基中的取代。此类型的非天然编码氨基酸包含但不限于a-羟基酸、ct-硫代酸、a-氨基硫代羧酸酯，包含但不限于具有对应于20种常见天然氨基酸的侧链或非天然侧链。另外，在ct-碳上的取代视情况包含但不限于L、D或a-a-二取代氨基酸，诸如D-谷氨酸盐、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等等。其它结构替代物包含环状氨基酸，诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；P和Y氨基酸，诸如经取代卩-丙氨酸和Y-氨基丁酸。许多非天然编码氨基酸是以诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸为基础且适用于本发明中。酪氨酸类似物包含但不限于对位取代酪氨酸、邻位取代酪氨酸和间位取代酪氨酸，其中经取代酪氨酸包括(包含但不限于)酮基(包含但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、Cs-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等等。另外，也涵盖多取代芳基环。可适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包含但不限于a-羟基衍生物、"Y-取代衍生物、环状衍生物和酰胺取代谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明中的苯丙氨酸类似物的实例包含但不限于对位取代苯丙氨酸、邻位取代苯丙氨酸和间位取代苯丙氨酸，其中取代基包括(包含但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包含但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等等。可适用于本发明中的非天然编码氨基酸的特定实例包含但不限于对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcP-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙基氧基-苯丙氨酸等等。可适用于本发明中的多种非天然编码氨基酸的结构的实例提供于(例如)名称为"Invivoincorporationofnon-naturallyencodedaminoacids"的WO2002/085923中。关于其它甲硫氨酸类似物也参看Kiick等人，(2002)/ncorpora"ono/azirfesreconW"aW_profez>w/orc/iewtwe/e"/ve7Moczyc加'ow&awWwger/z'ga"'cm,PNAS99:19-24。在一个实施例中，提供包含非天然编码氨基酸(诸如对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的多肽的组合物。也提供包括对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和(包含但不限于)蛋白质和/或细胞的各种组合物。在一方面中，包含对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然编码氨基酸的组合物进一步包含正交tRNA。非天然编码氨基酸可与正交tRNA键结(包含但不限于共价键结)，其包含但不限于通过氨基-酰基键与正交tRNA共价键结、与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共价键结等。经由非天然编码氨基酸可并入蛋白质中的化学部分提供多种优点以及对蛋白质的操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许蛋白质在活体外和活体内由众多含肼或含羟胺试剂中的任一种进行选择性修饰。重原子非天然编码氨基酸(例如)可用于定相X射线结构数据。使用非天然编码氨基酸进行重原子的位点特异性引入在选择重原子的位置时也提供选择性和灵活性。光反应性非天然编码氨基酸(包含但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包含但不限于叠氮基苯)侧链的氨基酸)(例如)允许蛋白质的有效活体内和活体外光交联。光反应性非天然编码氨基酸的实例包含但不限于对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后可通过激发提供光反应性基团的时间控制使具有光反应性非天然编码氨基酸的蛋白质随意交联。在一实例中，非天然氨基的甲基可通过使用(包含但不限于)核磁共振和振动光谱经作为局部结构和动力学的探针的同位素标记(包含但不限于)甲基取代。炔基或叠氮基官能团(例如)允许通过[3+2]环加成反应由分子对蛋白质进行选择性修饰。在氨基末端处并入多肽中的非天然氨基酸可由R基团(其为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)和不同于ct-氨基酸(参看式I)中通常存在的NH2基团的第2反应性基团组成。具有不同于a-氨基酸(参看式I)中通常存在的COOH基团的第2反应性基团的类似非天然氨基酸可在羧基末端处并入。非天然编码氨基酸的化学合成许多不可购得的适用于本发明中的非天然编码氨基酸是视情况如本文中所提供进行合成或如各种公开案中所提供进行合成或使用所属领域的技术人员已知的标准方法进行合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon的OrganicChemistry,(1982,第2版，WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985，WileyandSons,NewYork);和Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，A及B部分，19卯，PlenumPress,NewYork)。描述非天然编码氨基酸合成的其它公开案包含(例如)名称为"InvivoincorporationofNon-naturallyencodedaminoacids"的WO2002/085923;Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.,38，4660-4669;King,F.E.和Kidd,D.A.A.(1949)爿JVew一Ae^o/G7w^脂'"ecmdo/y-ZW/一(ieyo/G/由/m'c爿c/d加/wP/j鄉/她c/"fmwe^to,J.Chem.Soc,3315-3319;Friedman,O.M.和Chatterrji,R.(1959)5ywAe5^o/Dm.vWveso/G7wf簡/weMode//orJ.Am.Chem.Soc.81，3750-3752;Craig，J.C.等人(1988)爿^o/wfeqw."o/z'"e(Oj/ora《"z'we」.J.Org.Chem.53,1167-1170;Azoulay,M.，Vilmont，M.和Frappier,F.(1991)G7wto/w/wea"a/ogwes尸o&wria/J"".wja/an'aAs,.Eur.J.Med.Chem.26，201-5;Koskinen，A.M.P.禾卩Rapoport,H.(1989)5>"Aes&o/4-Sw6幼Yw&diVoZ/wesasCo"/o/"附a"'owa/(yCowWAV2/"ef/爿/m'"o乂c/c爿mJf/ogMes.J.Org.Chem.54,1859-1866;Christie,B.D.禾口Rapoport，H.(1985)S声/ie^o/Qp"W/yPwre尸/peco/a^s如附Z^，rag/we.am//mz"/ww/owCK"za"o".J.Org.Chem.1989:1859-1866;Barton等人，(1987)^w/Ziewso/iVove/"w/wo-fcfeawdZ)mVfl"vesf/w'"g及a力ca/C7/e/m'sfr乂.S声/2e57'so/丄-朋di)-or-yiw/wo-^(却z'c爿c/叔￡-a-a/m>opz>we//c爿czW々，0/7"'她C/"sa^aredZ)m'v加'ves.TetrahedronLett.43:4297-4308;和Subasinghe等人，(1992)(gwz、Ma//caddcma/ogww"w/Tjei^o/6"a-A"erac_yc//c2-07m'wopro戸wo/cdm'varivesawcif/iez>ac/iv//yWawove/q由Ma/c^e-s麵fee""e.J.Med.Chem.35:4602-7。也参看2003年12月22日申请的第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号名称为"ProteinArrays"的专利申请案。A.羰基反应性基团具有羰基反应性基团的氨基酸允许多种反应以通过亲核加成或醇醛縮合反应与分子(包含但不限于PEG或其它水溶性分子)键联。例示性含羰基氨基酸可如下表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代垸基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为l，R!为苯基且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为l，R!为苯基且R2为简单垸基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分位于烷基侧链的间位。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人，Biochemistry42:6735-6746(2003)中，其是以引用的方式并入本文中。其它含羰基氨基酸可由所属领域的技术人员类似地制备。在一些实施例中，包括非天然编码氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说，可用于接合反应的醛官能团可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生。如果生物活性分子为多肽，那么(例如)W末端丝氨酸或苏氨酸(其可通常存在或可通过化学或酶促消化暴露)可用于在温和氧化性裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参看Gaertner等人，B/ocwywg.CAew.3:262-268(1992);Geoghegan,K.和Stroh，J.，5zoco"j.Mg.CZew.3:138-146(1992);Gaertner等人，C/zew.269:7224-7230(1994)。然而，在所属
技术领域：
中已知的方法局限于在肽或蛋白质的N末端的氨基酸。在本发明中，带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为"掩蔽"醛官能团并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸带有与e胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其它位点处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号，其是以引用的方式并入本文中。羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性反应以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲键。例如参看Jencks,W.P.，J.爿附.C/zew.Soc.81,475-481(1959);Shao，J.和Tarn,J.P.,/Jm.C/zew.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在其它氨基酸侧链存在的情况下的选择性修饰。例如参看Cornish,V.W.等人，/爿m.C/ze/w.Soc.118:8150-8151(1996);Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G"别occm/wg.CAe附.3:138-146(1992);Mahal,L.K.等人，276:1125-1128(1997)。B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团含有亲核基团(诸如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成接合物(包含但不限于与PEG或其它水溶性聚合物反应)。例示性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>其中n为0-10;R!为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N或S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为4，Ri不存在且X为N。在一些实施例中，n为2，&不存在且X不存在。在一些实施例中，n为l，R!为苯基，X为O，且氧原子位于芳基环上的脂肪族基团的对位。含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸是获自商业来源。举例来说，L-谷氨酸-酰肼是获自SigmaChemical(St.Louis,MO)。不可购得的其它氨基酸可由所属领域的技术人员制备。例如参看美国专利第6，281，211号，其是以引用的方式并入本文中。含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的多种分子有效且选择性地反应。例如参看Shao,J.和Tam，J.，CAe附.Soc.117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包含但不限于丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基以及N末端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团的反应性显著更强。C.含氨氧基的氨基酸含有氨氧基(也被称作羟胺)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物(包含但不限于与PEG或其它水溶性聚合物反应)。如同肼、酰肼和氨基脲一样，氨氧基的增强亲核性允许其与含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的多种分子有效且选择性地反应。例如参看Shao，J.和Tam，J.,/.X附.C/iew.Soc.117:3893-3899(1995);H.Hang和C.Bertozzi，爿cc.Oew.34:727-736(2001)。尽管与肼基团反应的结果为相应腙，但氨氧基与含羰基的基团(诸如酮)的反应通常产生肟。例示性含氨氧基的氨基酸可如下表示其中n为0-10;R!为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为0、N、S或不存在；m为0-10;Y-C(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为l,R!为苯基，X为O，m为1，且Y存在。在一些实施例中，n为2，R!和X不存在，m为0,且Y不存在。含氨氧基的氨基酸可由易于获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)来制备。例如参看M.Carrasco和R.Brown，乂Og.C/zew.68:8853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸(诸如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸)己自天然来源分离(Rosenthal,G.等人，LifeSci.60:1635-1641(1997))。其它含氨氧基的氨基酸可由所属领域的技术人员来制备。D.叠氮化物和炔反应性基团叠氮化物和炔官能团的独特反应性使其尤其适用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物(尤其是脂肪族叠氮化物)和炔通常对常用反应性化学条件稳定。特定来说，叠氮化物与炔官能团对在天然存在多肽中发现的20种常见氨基酸的侧链(即，R基团)呈惰性。然而，当达到紧密接近时，显示出叠氮化物和炔基团的"弹簧负载(spring-loaded)"本质且其通过Huisgen[3+2]环加成反应选择性且有效地反应以产生相应三唑。例如参看ChinJ.等人，Scie"ce301:964-7(2003);Wang，Q.等人，/j附.Soc.125,3192-3193(2003);Chin,J.W.等人，丄4m.Soc.124:9026-9027(2002)。因为Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参看Padwa,A.,在ComprehensiveOrganicSYNTHESIS,第4巻，(Trost,B.M.编，1991),第1069-1109页中；Huisgen，R.在1，3-DipolarCycloadditionChemistry,(Padwa,A.编，1984)，第1-176页中)而非亲核取代，所以并入带有含叠氮基和炔侧链的非天然编码氨基酸允许所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。涉及含叠氮基或炔的hGH多肽的环加成反应可在催化量的用于将Cu(II)原位还原为Cu(I)的还原剂存在的情况下通过添加Cu(II)(包含但不限于催化量的CuS04的形式)在室温下在水性条件下进行。例如参看Wang,Q.等人，/Xm.CAe附.Soc.125,3192-3193(2003);Tornoe，C.W.等人，/C^g.CAe附.67:3057-3064(2002);Rostovtsev等人，CAe/n./w.五A41:2596-2599(2002)。例示性还原剂包含(包含但不限于)抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co"和所施加电势。在需要叠氮化物与炔之间的Huisgen[3+2]环加成反应的一些情况下，多肽包括包含炔部分的非天然编码氨基酸且欲与氨基酸连接的水溶性聚合物包括叠氮基部分。或者，逆向反应(即，在氨基酸上具有叠氮基部分且在水溶性聚合物上存在炔部分)也可进行。叠氮基官能团也可与含有芳基酯的水溶性聚合物选择性地反应且经芳基膦部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮基且所得胺随后与最接近的酯键有效反应以产生相应酰胺。例如参看E.Saxon和C.Bertozzi,287,2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可为垸基叠氮化物(包含但不限于2-氨基-6-叠氮基-l-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。例示性含有芳基酯和膦部分的水溶性聚合物可如下表示:其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包含但不限于-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-CN和-N02。R'、R"、R"'和R""各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包含但不限于经l-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代垸基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R"'和R""基团一样独立地选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包含但不限于1-吡咯垸基和4-吗啉基。根据关于取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语"烷基"打算包含包括与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤烷基(包含但不限于-CF3和-CH2CF3)和酰基(包含但不限于-C(0)CH3、-C(0)CF3、-C(0)CH2OCH3等等)。叠氮基官能团也可与含有硫酯的水溶性聚合物选择性反应且经芳基膦部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮基且所得胺随后与硫酯键有效反应以产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示Ph2P(H2C)nZSYX、wo其中n为l-10;X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。例示性含炔氨基酸可如下表示R2HN(9H2)nR，X(CH2)mCCH■COR3其中n为0-10;R!为垸基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10，R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，Ri为苯基，X不存在，m为O且乙炔部分位于垸基侧链的对位。在一些实施例中，n为l,R!为苯基，X为O，m为1且炔丙基氧基位于烷基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为l，R4和X不存在且m为0(即，炔丙基甘氨酸)。含炔氨基酸在市面上有售。举例来说，炔丙基甘氨酸是购自Peptech(Burlington,MA)。或者，可根据标准方法来制备含炔氨基酸。举例来说，可如(例如)Deiters,A.等人，J.Soc.125:11782-11783(2003)中所述来合成对炔丙基氧基苯丙氨酸，且可如Kayser,B.等人，7fe"a/ze^wj53(7):2475-2484(1997)中所述来合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域的技术人员可制备其它含炔氨基酸。例示性含叠氮基的氨基酸可如下表示((jJH2)nR,X(CH2)mN3R2HN^""^COR3其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R!为苯基，X不存在，m为O且叠氮基部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4且Ri和X不存在，且m-0。在一些实施例中，n为l,Ri为苯基，X为O，m为2且对叠氮基乙氧基部分位于烷基侧链的对位。含叠氮基的氨基酸可获自商业来源。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可获自Chem-ImpexInternational,Inc.(WoodDale,IL)。对于那些不可购得的含叠氮基的氨基酸来说，可相对容易地使用所属领域的技术人员已知的标准方法来制备叠氮基，所述方法包含但不限于通过适合离去基(包含但不限于卣离子、甲磺酸根、甲苯磺酸根)置换或通过打开经适当保护的内酯。例如参看March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,WileyandSons,NewYork)。E.氨基硫醇反应性基团(3取代氨基硫醇官能团的独特反应性使其极其适用于通过形成噻唑垸来对含有醛基的多肽和其它生物分子进行选择性修饰。例如参看J.Shao和J.Tam，Xw.C&肌Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中，|3取代氨基硫醇氨基酸可并入多肽中且随后与包括醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物接合物或其它有效负载可通过形成噻唑烷而与包括p取代氨基硫醇氨基酸的多肽偶合。非天然编码氨基酸的细胞吸收细胞对非天然编码氨基酸的吸收为设计且选择(包含但不限于)用于并入蛋白质中的非天然编码氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说，a-氨基酸的高电荷密度表明这些化合物未必可透过细胞。通过以蛋白质为基础的输送系统的集合将天然氨基酸吸收入细胞中。可进行迅速筛检，其评估哪种非天然编码氨基酸(如果存在)是由细胞吸收。例如参看2003年12月22日申请的第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号名称为"ProteinArrays"的申请案；和Liu，D.R.和Schultz,P.G.(1999)iVogre^fowanievo/Wowo/cmorgaw/swwzY/iawejc戸wcfe(igen"/ccode.PNASUnitedStates96:4780-4785中的毒性检定。尽管通过各种检定可容易地分析吸收，但设计适合于细胞吸收路径的非天然编码氨基酸的替代方案为提供在活体内产生氨基酸的生物合成路径。非天然编码氨基酸的生物合成许多生物合成路径己存在于细胞中以用于产生氨基酸和其它化合物。尽管用于特定非天然编码氨基酸的生物合成方法在自然界中(包含但不限于在真核细胞中)可能不存在，但本发明提供这些方法。举例来说，非天然编码氨基酸的生物合成路径是通过添加新酶或改变现有宿主细胞路径视情况在宿主细胞中产生。其它新酶视情况为天然存在的酶或人工发展的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如在名称为"Invivoincorporationofnon-naturallyencodedaminoacids"的WO2002/085923中的实例中所呈现)依赖于添加来自其它有机体的已知酶的组合。针对这些酶的基因可通过用包括所述基因的质粒转化细胞而引入真核细胞中。当表达于细胞中时，基因提供合成所需化合物的酶促路径。视情况添加的酶的类型的实例提供于下文实例中。其它酶序列见于(例如)Genbank中。人工发展的酶也以相同方式视情况添加到细胞中。以此方式操纵细胞的细胞机构和资源以产生非天然编码氨基酸。多种方法可用于产生用于生物合成路径中或用于发展现有路径的新颖酶。举例来说，如由(包含但不限于)Maxygen，Inc.(可通过万维网在maxygen.com上获得)开发的递归重组视情况用于开发新颖酶和路径。例如参看Stemmer(1994),evo/^'o"o/fl戸Wwv"raZWJ由,"g，Nature370(4):389-391;和Stemmer，(1994)，房js/m,"g6少m"do/w^)fg膨/7加/owreawew6(y:/"v/的rec歸WwWo"ybr歸/ecw/orevo/t^cm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA..91:10747-10751。类似地，由Genencor(可通过万维网在genencor.com上获得)开发的DesignPathTM视情况用于代谢路径改造，其包含但不限于改造在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的路径。此技术使用(包含但不限于)经由功能基因组学以及分子发展和设计鉴别的新基因的组合在宿主有机体中重建现有路径。DiversaCorporation(可通过万维网在diversa.com上获得)也提供用于迅速筛检基因文库和基因路径的技术(包含但不限于)以产生新路径。通常，由本发明的经改造生物合成路径产生的非天然编码氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成(包含但不限于天然细胞量)，但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度产生。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10mM至约0.05mM。一旦细胞经包括用于产生特定路径所需的酶的基因的质粒转化且产生非天然编码氨基酸，那么活体内选择视情况用于进一步最优化用于核糖体蛋白质合成与细胞生长的非天然编码氨基酸的产生。具有非天然编码氨基酸的多肽可出于多种目的进行非天然编码氨基酸的并入，所述目的包含但不限于定制蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键合、疏水性、蛋白酶靶位点的可接近性；靶向部分(包含但不限于，对于蛋白质阵列来说)等。包含非天然编码氨基酸的蛋白质可具有增强或甚至全新的催化或生物物理性质。举例来说，视情况通过将非天然编码氨基酸包含于蛋白质中来改变以下性质毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(包含但不限于血清半衰期)、与其它分子反应的能力(包含但不限于共价或非共价)等等。包含包括至少一个非天然编码氨基酸的蛋白质的组合物适用于(包含但不限于)新颖疗法、诊断学、催化酶、工业酶、结合蛋白(包含但不限于抗体)以及(包含但不限于)蛋白质结构和功能的研究。例如参看Dougherty,(2000)7Vbw-wart/ra//_yewcocfedaw/woaczWscwiVo6esiVofe/wa/idF節c"o"，CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645-652。在本发明的一个方面中，组合物包含至少一种具有至少一个(包含但不限于至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上)非天然编码氨基酸的蛋白质。非天然编码氨基酸可相同或不同，包含但不限于在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同位点可包括l、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同非天然编码氨基酸。在另一方面中，组合物包含其中蛋白质中存在的特定氨基酸中的至少一个(但少于全部)经非天然编码氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然编码氨基酸的给定蛋白质来说，非天然编码氨基酸可相同或不同(包含但不限于所述蛋白质可包含两个或两个以上不同类型的非天然编码氨基酸，或可包含两个相同的非天然编码氨基酸)。对于具有两个以上非天然编码氨基酸的给定蛋白质来说，非天然编码氨基酸可相同、不同或为相同种类的多个非天然编码氨基酸与至少一个不同的非天然编码氨基酸的组合。具有至少一个非天然编码氨基酸的所关注蛋白质或多肽为本发明的特征。本发明也包含使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然编码氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包含但不限于医药学上可接受的赋形剂)也可与蛋白质一起存在。在某些实施例中，蛋白质包含至少一个非天然编码氨基酸和至少一个翻译后修饰。举例来说，翻译后修饰包含但不限于乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键联修饰、糖基化等等。在一方面中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖(包含但不限于(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)与天冬酰胺连接。参看表l，其列出真核蛋白的N键联寡糖的一些实例(也可存在其它残基，其未显示)。在另一方面中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键联或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖(包含但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。表l:通过GlcNAc键联的寡糖的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在另一方面中，翻译后修饰包含前体(包含但不限于降钙素前体、降钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原、阿黑皮素原等等)的蛋白水解处理、组装成多亚单位蛋白或大分子组装、翻译至细胞中的另一位点中(包含但不限于翻译至诸如内质网、高尔基体(Golgiapparatus)、核、溶酶体、过氧物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等细胞器中，或通过分泌路径)。在某些实施例中，蛋白质包括分泌或定位序列、附加表位、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等等。以引用的方式并入本文中的美国专利第4，963，495号和第6,436,674号详述经设计以改良多肽分泌的构筑体。非天然编码氨基酸的一个优点在于其呈现可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在活体内在真核或非真核细胞中或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然编码氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数反应涉及亲核与亲电子反应搭配物之间的共价键形成，其包含但不限于a-卤酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下通过蛋白质中亲核残基的数目和可接近性来测定选择性。在本发明的蛋白质中，可使用其它选择性更大的反应，诸如在活体外和活体内非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如参看Cornish等人，(1996)Am.Chem.Soc.118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science,276:1125-1128;Wang等人，(2001)Science292:498-500;Chin等人，(2002)ASLChem.Soc.124:9026-9027;Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99:11020-11024;Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry,42:6735-6746;和Chin等人，(2003)Science.出版中。此允许用包含荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子的大量试剂选择性标记几乎任何蛋白质。也参看2003年1月16日申请的名称为"Glycoproteinsynthesis"的美国专利申请案第10/686,944号，其是以引用的方式并入本文中。翻译后修饰(包含但不限于通过叠氮基氨基酸进行)也可通过施陶丁格连接(Staudingerligation)(包含但不限于用三芳基膦试剂)进行。例如参看Kiick等人,(2002)/"co"pom"'owo/azzWes/wforeco/nWwaW/raW/w/orcAe则se/e"/ve歸di(/c加'ow5towW"ger//ga".o"，PNAS99:19-24。本发明提供用于选择性修饰蛋白质的另一高效方法，其涉及回应选择密码子而将非天然编码氨基酸(包含但不限于含有叠氮基或炔基部分)遗传并入蛋白质中。这些氨基酸侧链随后可通过(包含但不限于)分别与(包含但不限于)炔基或叠氮基衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应(例如参看Padwa,A.ComprehensiveOrganicSynthesis.第4巻,(1991)Trost,B.M.编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页；和Huisgen,R.1.3-DipolarCvcloadditionChemistry.(1984)Padwa,A.编，Wiley,NewYork,第1-176页)而经修饰。因为此方法涉及环加成而非亲核取代，所以可在极高选择性下对蛋白质进行修饰。通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐，可在室温下在水性条件下进行此反应，其具有出色的区域选择性(1,4>1，5)。例如参看Tornoe等人.(2002)Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。可使用的另一方法为在双砷化合物上用四半胱氨酸基元进行配体交换，例如参看Griffin等人，(1998)Science281:269-272。可加成到本发明的蛋白质中的分子包含但不限于染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包含但不限于聚乙二醇的衍生物)、光交联剂、化学毒性化合物、亲和性标记、生物素的衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、一种或一种以上聚核苷酸(包含但不限于DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等等。这些分子可分别加成到具有炔基的非天然编码氨基酸(包含但不限于对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然编码氨基酸(包含但不限于对叠氮基-苯丙氨酸)中。可使用经修饰tRNA和tRNA合成酶在活体内通过假单胞菌宿主细胞产生本发明的多肽以加成到在天然存在系统中未编码的氨基酸上或将其取代。使用在天然存在系统中未编码的氨基酸来产生tRNA和氨基酰基tRNA合成酶的方法描述于(例如)美国专利申请公开案第2003/0082575号(第10/126,927号)和第2003/0108885号(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于假单胞菌翻译系统(且因此有时被称作"正交")的内源性合成酶和tRNA起作用的翻译机构。通常，假单胞菌翻译系统包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先在假单胞菌翻译系统中使具有至少一个非天然编码氨基酸的O-tRNA氨基酰基化且O-tRNA识别至少一个未由系统中的其它tRNA识别的选择密码子。因此假单胞菌翻译系统回应经编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入在系统中产生的蛋白质中，从而将氨基酸"取代"入所编码多肽中的位置中。在所属
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中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨基酰基tRNA合成酶，且其通常适用于本发明中。举例来说，酮基特异性0-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶描述于Wang,L.等人，Prac.A^/.Jow/.Sd.y&4100:56-61(2003)和Zhang,Z.等人，42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由聚核苷酸序列编码且包含美国专利申请公开案第2003/0082575号和第2003/0108885号中所揭示的氨基酸序列，这些文献各自以引用的方式并入本文中。与O-RS—起使用的相应0-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案第2003/0082575号(第10/126,927号)和第2003/0108885号(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。叠氮基特异性0-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin，J.W.等人,乂爿w.CAe附.Soc.124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包含但不限于如美国专利申请公开案第2003/0108885号(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:14-16和29-32和氨基酸序列SEQIDNO:46-48和61-64,所述文献是以引用的方式并入本文中。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包含但不限于如美国专利申请公开案第2003/0108885号(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:1-3，所述文献是以引用的方式并入本文中。对特定非天然编码氨基酸具特异性的0-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利申请公开案第2003/0082575号(第10/126,927号)中，其是以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基与含叠氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人，S"'e"ce301:964-967(2003)中。0-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶的用途涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但通常希望选择在0-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶表达于其中的细胞中很少或从未使用的密码子。举例来说，例示性密码子包含无义密码子(诸如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石))、四个或四个以上碱基密码子以及很少或未使用的其它天然三碱基密码子。可使用所属
技术领域：
中已知的突变诱发方法(包含但不限于位点特异性突变诱发、盒式突变诱发、限制选择突变诱发等)将特定选择密码子引入聚核苷酸编码序列中的适当位置中。用于产生可用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质生物合成机构的组分(诸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/0-RS对)的方法描述于Wang，L.等人，292:498-500(2001);Chin,J.W.等人，/爿附.C/ie附.124:9026-9027(2002);Zhang，Z.等人，5/oc/^肌'W^42:6735-6746(2003)中。用于在活体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案第2003/0082575号(第10/126,927号)中，其是以引用的方式并入本文中。用于选择用于有机体的活体内假单胞菌翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案第2003/0082575号(第10/126,927号)和第2003/0108885号(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。用于产生至少一种重组正交氨基酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包括(a)自第一有机体产生来源于至少一种氨基酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库，所述第一有机体包含但不限于原核有机体，诸如詹氏甲烷球菌(MW/umoco"^)、嗜热自养甲烷杆菌(MeAflw06a"e〃'w7wAennoai^o&op/n'cww)、嗜盐杆菌(//a/o6acfen'ww)、大肠杆菌、闪烁古生球菌(A/w/gzWw)、嗜热古菌(P/wn'os^)、极端嗜热古菌(户/zonl(w/n7)、超嗜热需氧古生菌".pem/x)、极端嗜热菌(IAenMO/^z7"s)等等；或真核有机体；(b)在RS(视情况突变RS)的文库中选择(和/或筛检)在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨基酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的集合；和/或(c)在所述集合中选择(视情况通过阴性选择)在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨基酰基化的活性RS(包含但不限于突变RS)，从而提供至少一种重组O-RS;其中所述至少一种重组O-RS优先使具有非天然编码氨基酸的O-tRNA氨基酰基化。在一个实施例中，RS为非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变而产生。举例来说，非活性RS可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变为不同氨基酸(包含但不限于丙氨酸)来产生。可使用所属
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中已知的各种技术来产生突变RS的文库，这些技术包含但不限于以蛋白质三维RS结构为基础的理性设计或在随机或理性设计技术中RS核苷酸的突变诱发。举例来说，可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、理性设计以及在本文中所述或所属
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中已知的其它方法产生突变RS。在一个实施例中，在RS(视情况突变RS)的文库中选择(和/或筛检)(包含但不限于)在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨基酰基化的活性成员包含将阳性选择或筛检标记(包含但不限于抗生素抗性基因等等)和(视情况突变)RS的文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛检标记包括至少一个选择密码子(包含但不限于琥珀、赭石或蛋白石密码子)；使所述多个细胞在选择剂存在的情况下生长；通过抑制阳性选择或筛检标记中的至少一个选择密码子来鉴别在选择剂和/或筛检剂存在的情况下存活(或显示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(视情况突变)RS的集合的经阳性选择细胞的子集。视情况可改变选择剂和/或筛检剂浓度。在一方面中，阳性选择标记为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因且在CAT基因中选择密码子为琥珀终止密码子。视情况，阳性选择标记为P-内酰胺酶基因且在P-内酰胺酶基因中选择密码子为琥珀终止密码子。在另一方面中，阳性筛检标记包括荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记(包含但不限于细胞表面标记)。在一个实施例中，在集合中阴性选择或筛检在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨基酰基化的活性RS(视情况突变)包含将阴性选择或筛检标记与来自阳性选择或筛检的活性(视情况突变)RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛检标记包括至少一个选择密码子(包含但不限于抗生素抗性基因，其包含但不限于氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；以及鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛检剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛检反应、但在未补充非天然编码氨基酸和选择剂或筛检剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞。举例来说，CAT鉴别方案在测定适当O-RS重组体时视情况充当阳性选择和/或阴性筛检。举例来说，视情况在一个或一个以上非天然编码氨基酸存在或不存在的情况下于含有CAT(其包括至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆集合。因此认为仅在含有非天然编码氨基酸的平板上生长的菌落含有重组O-RS。在一方面中，改变选择(和/或筛检)剂的浓度。在一些方面中，第一与第二有机体不同。因此，第一和/或第二有机体视情况包括原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌(archaebacterium)、真细菌(eubacterium)、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛检标记包括荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记。在另一个实施例中，在集合中筛检或选择(包含但不限于阴性选择)活性(视情况突变)RS包含自阳性选择步骤(b)分离活性突变RS的集合；将阴性选择或筛检标记和活性(视情况突变)RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛检标记包括至少一个选择密码子(包含但不限于毒性标记基因，其包含但不限于包括至少一个选择密码子的核糖核酸酶barnase基因)；以及鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛检反应、但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。在一方面中，所述至少一个选择密码子包括约两个或两个以上选择密码子。这些实施例视情况可包含其中所述至少一个选择密码子包括两个或两个以上选择密码子，且其中第一与第二有机体不同(包含但不限于各有机体视情况为(包含但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)。同样，一些方面包含其中阴性选择标记包括核糖核酸酶barnase基因(其包括至少一个选择密码子)。其它方面包含其中筛检标记视情况包括荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记。在本文中的实施例中，筛检和/或选择视情况包含筛检和/或选择严格度的变化。在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨基酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包括(d)分离所述至少一种重组O-RS;(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况突变)；以及(f)重复步骤(b)和(c)直至获得包括优先使O-tRNA氨基酰基化的能力的突变O-RS。视情况，将步骤(d)-(f)重复(包含但不限于)至少约两次。在一方面中，可通过突变诱发(包含但不限于随机突变诱发、位点特异性突变诱发、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。上述方法中选择/筛检步骤(包含但不限于阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检步骤(c)或阳性与阴性选择/筛检步骤(b)与(c))的严格度视情况包含改变选择/筛检严格度。在另一个实施例中，阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检步骤(c)或阳性与阴性选择/筛检步骤(b)与(c)包括使用报告基因，其中报告基因是由荧光活化细胞分选(FACS)检测或其中报告基因是由发光检测。视情况，报告基因是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等等且根据涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等等。用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包含(a)自第一有机体产生来源于至少一种tRNA(包含但不限于抑制tRNA)的突变tRNA文库；(b)在所述文库中选择(包含但不限于阴性选择)或筛检在来自第一有机体的RS不存在的情况下由来自第二有机体的氨基酰基-tRNA合成酶(RS)氨基酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供tRNA(视情况突变)的集合；以及(c)在所述tRNA(视情况突变)集合中选择或筛检由经引入正交RS(O-RS)氨基酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA;其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨基酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制tRNA和/或包括具有天然和/或非天然碱基的唯一三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包括至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中，O-tRNA无需修饰而视情况自第二有机体引入第一有机体中。在各种实施例中，第一与第二有机体相同或不同且视情况选自(包含但不限于)原核生物(包含但不限于詹氏甲垸球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐杆菌等)、真核生物、晡乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是由非天然编码氨基酸视情况氨基酰基化，其中非天然编码氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操作生物合成。非天然编码氨基酸视情况添加到至少第一或第二有机体的生长培养基中。在一方面中，在所述文库中选择(包含但不限于阴性选择)或筛检由氨基酰基-tRNA合成酶氨基酰基化的(视情况突变)tRNA(步骤(b))包含将毒性标记基因和(视情况突变)tRNA文库引入来自第二有机体的多个细胞中，其中毒性标记基因包括至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(staticagent)的基因或有机体必需的基因，其中所述标记基因包括至少一个选择密码子)；以及选择存活细胞，其中存活细胞含有包括至少一个正交tRNA或非功能tRNA的(视情况突变)tRNA的集合。举例来说，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。在另一方面中，毒性标记基因可包含两个或两个以上选择密码子。在这些方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包括至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可包含两个或两个以上琥珀密码子。在一个实施例中，在(视情况突变)tRNA的集合中选择或筛检由经引入正交RS(O-RS)氨基酰基化的成员可包含将阳性选择或筛检标记基因以及0-RS和(视情况突变)tRNA的集合引入来自第二有机体的多个细胞中，其中阳性标记基因包括药物抗性基因(其包含但不限于P-内酰胺酶基因，其包括至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子)或有机体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；以及鉴别在选择剂或筛检剂(包含但不限于抗生素)存在的情况下生长的存活或筛检细胞，从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞集合，其中所述至少一种重组tRNA是由O-RS氨基酰基化且回应至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，改变选择剂和/或筛检剂的浓度。提供用于产生特异性O-tRNA/0-RS对的方法。所述方法包含(a)自第一有机体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛检在来自第一有机体的RS不存在的情况下由来自第二有机体的氨基酰基-tRNA合成酶(RS)氨基酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供(视情况突变)tRNA的集合；(c)在(视情况突变)tRNA集合中选择或筛检由经引入正交RS(O-RS)氨基酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨基酰基化。所述方法也包含(d)自第三有机体产生来源于至少一种氨基酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库；(e)在突变RS文库中选择或筛检在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨基酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的集合；以及(f)在所述集合中阴性选择或筛检在非天然编码氨基酸不存在的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨基酰基化的活性(视情况突变)RS，从而提供至少一种特异性O-tRNA/0-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/0-RS对包括至少一个对非天然编码氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包含由所述方法产生的特异性O-tRNA/0-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/0-RS对可包含(包含但不限于)mutRNATyr曙mutTyrRS对，诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等等。另外，这些方法包含其中第一与第三有机体相同(其包含但不限于詹氏甲烷球菌)。在本发明中也包含用于选择用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。这些方法包含将标记基因、tRNA和自第一有机体分离或获得的氨基酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二有机体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二有机体的复制细胞组中；以及选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛检显示特异性筛检反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组是在选择剂或筛检剂存在的情况下生长，其中存活或筛检细胞包括用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛检包含活体内互补检定。可改变选择剂或筛检剂的浓度。本发明的有机体包括多种有机体和多种组合。举例来说，本发明的方法的第一与第二有机体可相同或不同。在一个实施例中，有机体视情况为原核有机体，其包含但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜热古菌、极端嗜热古菌、超嗜热需氧古生菌、极端嗜热菌等等。或者，有机体视情况包括真核有机体，其包含但不限于植物(包含但不限于复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包含但不限于酵母等)、动物(包含但不限于哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等等。在另一个实施例中，第二有机体为原核有机体，其包含但不限于詹氏甲垸球菌、嗜热自养甲垸杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜盐杆菌、嗜热古菌、极端嗜热古菌、超嗜热需氧古生菌、极端嗜热菌等等。或者，第二有机体可为真核有机体，其包含但不限于酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等等。在各种实施例中，第一与第二有机体不同。多种非天然编码氨基酸可取代或并入多肽中的给定位置中。一般来说，根据对多肽的三维晶体结构的研究来选择用于并入的特定非天然编码氨基酸，其包含通过其受体或(适当时)其它结合搭配物，优选保守性取代(即，以芳基为基础的非天然编码氨基酸，诸如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸取代Phe、Tyr或Trp)，以及希望引入多肽中的特异性接合化学(例如，如果想实现与带有炔部分的水溶性聚合物的Huisgen[3+2]环加成或与带有(转而)结合膦部分的芳基酯的水溶性聚合物的酰胺键形成，那么引入4-叠氮基苯丙氨酸)。在一个实施例中，所述方法进一步包含向蛋白质中并入非天然编码氨基酸，其中非天然编码氨基酸包括第一反应性基团；以及使蛋白质与包括第二反应性基团的分子(包含但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳键联的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以通过[3+2]环加成将分子与非天然编码氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包含但不限于在非天然编码氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中)且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包含但不限于在非天然编码氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸)且第二反应性基团为炔基部分。在一些情况下，一个或一个以上非天然编码氨基酸取代将与多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响多肽的其它生物特性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加多肽的稳定性(包含但不限于耐蛋白水解降解)或增加多肽对其受体的亲和性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加多肽的溶解性(包含但不限于在表达于假单胞菌宿主细胞中时)。在一些实施例中，添加、取代或缺失可增加在假单胞菌重组宿主细胞中表达之后的多肽溶解性。在一些实施例中，选择除用于并入非天然氨基酸的另一位点之外的用于经天然编码或非天然氨基酸取代的位点，其使得在假单胞菌重组宿主细胞中表达后多肽溶解性增加。在一些实施例中，多肽包括另一添加、取代或缺失，其调节对多肽受体的亲和性、调节(包含但不限于增加或降低)受体二聚合、使受体二聚体稳定、调节循环半衰期、调节释放或生物可用性、促进纯化或改良或改变特定投药途径。类似地，多肽可包括改良多肽的检测(包含但不限于GFP)、纯化或其它特性的蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包含但不限于FLAG或poly-His)或其它以亲和性为基础的序列(包含但不限于FLAG、poly-His、GST等)或键联分子(包含但不限于生物素)。K//.在俊単胞薪种和其薪祙中表达为获得克隆聚核苷酸的高水平表达，通常将编码多肽的聚核苷酸亚克隆入含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(对于编码蛋白质的核酸来说)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。在所属
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中众所周知适合细菌启动子且其描述(例如)于Sambrook等人和Ausubel等人中。用于表达本发明的多肽的细菌表达系统可获自荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌(Pw"dowomw^n'wgae)、缺陷假单胞菌(i^et/oiomw^脂'm^fl)、食油假单胞菌(Aewfitowomwo/eovonww)以及其它假单胞菌种和自其获得的菌株。可如本文中所述使用包括O-tRNA/0-RS对的假单胞菌细胞。本发明的假单胞菌宿主细胞提供自培养中的假单胞菌细胞合成大量有用的包括非天然编码氨基酸的蛋白质的能力。在一方面中，组合物视情况包含但不限于至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克、至少10克、至少50克或更多包括非天然编码氨基酸的蛋白质，或可通过大规模活体内蛋白质制备方法实现的千克级量(关于重组蛋白制备和纯化的细节提供于本文中)。在另一方面中，蛋白质视情况是以于(例如)细胞溶菌液、缓冲液、医药缓冲液、培养基或其它液体悬浮液中的(包含但不限于)每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质、或每升至少10毫克蛋白质、或每升至少50毫克蛋白质、或每升至少IOO毫克蛋白质、或每升至少500毫克蛋白质、或每升至少1000毫克蛋白质、或每升至少l克蛋白质、或每升至少5克蛋白质、或每升至少IO克蛋白质、或每升至少20克蛋白质或更多的浓度存在于组合物中。本发明的假单胞菌宿主细胞提供生物合成大量有用的包括非天然编码氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，包括非天然编码氨基酸的蛋白质可以于细胞提取物、细胞溶菌液、培养基、缓冲液等等中的(包含但不限于)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少l毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、l克/升、5克/升、10克/升或更多的蛋白质的浓度制备。所属
技术领域：
中众所周知细菌表达技术。多种载体可用于假单胞菌宿主中。载体可为单拷贝或低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于关于载体的丰富文献、许多载体的可购得以及甚至描述载体和其限制酶图谱以及特征的手册，在本文中无需详述。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记，其提供不同特征。细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如结构基因)的下游(3')转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有被称作操纵子的第二结构域，其可与RNA合成开始的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子允许阴性调节(可诱导)转录，因为基因抑制蛋白可结合操纵子且从而抑制特定基因的转录。在不存在阴性调节元件(诸如操纵子)的情况下可发生组成性表达。另外，通过基因活化蛋白结合序列可实现阳性调节，所述序列在存在时通常最接近(5')RNA聚合酶结合序列。基因活化蛋白的实例为代谢产物活化蛋白(CAP),其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[Raibaud等人，Annu.Rev.Genet.(1984)18:173]。调节表达因此可为阳性或阴性，从而增强或减弱转录。编码代谢路径酶的序列提供尤其有用的启动子序列。实例包含来源于糖代谢酶(诸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，Nature(1977)198:1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包含来源于生物合成酶(诸如色氨酸(trp))的启动子序列[Goeddel等人,Nuc.AcidsRes.(1980)8:4057;Yelverton等人，Nucl.AcidsRes.(1981)9:731;美国专利第4,738,921号；欧洲公开案第036776号和第121775号，其是以引用的方式并入本文中]。P-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)"Thecloningofinterferonandothermistakes."InInterferon3(I.Gresser编)]、噬菌体XPL[Shimatake等人，Nature(1981)292:128]和T5[美国专利第4，689，406号，其是以引用的方式并入本文中]启动子系统也提供有用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子(诸如T7启动子)以诱发高含量的hGH多肽。在所属
技术领域：
中众所周知这些载体的实例且其包含来自Novagen的pET29系列和WO99/05297(其是以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量多肽，而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列可与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4，551，433号，其是以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子为由trp启动子与lac操纵子序列组成的杂合trp-lac启动子，其由lac阻遏物调节[Amann等人，Gene(1983)25:167;deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80:21]。此外，细菌启动子可包含非细菌来源的天然存在启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合且起始转录的能力。非细菌来源的天然存在启动子也可与相容性RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高表达水平。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例[Studier等人，J.Mol.BIOL.(1986)189:113;Tabor等人，ProcNatl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。另外，杂合启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域组成(欧洲公开案第267851号)。除功能启动子序列之外，有效核糖体结合位点也适用于在原核生物中表达外来基因。在细菌中，核糖体结合位点被称作Shine-Dalgamo(SD)序列且包含起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人，Nature(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16SrRNA的3'端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人，"GeneticsignalsandnucleotidesequencesinmessengerRNA",在BiologicalRegulationandDevelopment:GeneExpression(Ed.R.F.Goldberger，1979)中]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人，"ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli",MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989]。术语"假单胞菌宿主"或"假单胞菌宿主细胞"指的是可用作或已经用作重组载体或其它转移DNA的接受者的假单胞菌种或自其获得的菌株。所述术语包含己经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解由于意外或故意突变，单一母体细胞的后代在形态或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与由相关性质(诸如存在编码多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包含在由此定义意指的后代中。所属领域的一般技术人员众所周知用于表达多肽的适合假单胞菌宿主细胞的选择。在选择用于表达的假单胞菌宿主时，适合宿主可包含显示尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体坚固性的那些宿主。假单胞菌宿主通常可获自多种来源，其包含但不限于BacterialGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA);和AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA)。在本发明的方法的另一个实施例中，宿主细胞株为假单胞菌种，包含但不限于荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。荧光假单胞菌生物型1(命名为菌株MB101)可用于蛋白质制备。某些荧光假单胞菌菌株由DowChemicalCompany描述为宿主菌株(Midland,MI，可通过万维网在dow.com上获得)。并入本文中的美国专利第4，755，465号和第4,859,600号描述假单胞菌菌株作为用于多肽制备的宿主细胞的用途。一旦形成假单胞菌宿主细胞株(即，表达构筑体已经引入宿主细胞中且分离具有合适表达构筑体的宿主细胞)，那么重组宿主细胞株即在适于制备多肽的条件下培养。所属领域的技术人员将了解，重组宿主细胞株的培养方法将依赖于所利用的表达构筑体的性质和宿主细胞的特点。通常使用所属
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中众所周知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源和无机盐源且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属
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中众所周知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不需的微生物和/或化合物(包含但不限于用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)的生长。重组宿主细胞可以分批或连续模式培养，其中细胞收集(在多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上层清液的收集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中的制备来说，优选分批培养和细胞收集。通常在表达于重组系统中之后纯化重组多肽。可通过所属
技术领域：
中已知的多种方法自宿主细胞纯化多肽。有时，在假单胞菌宿主细胞中产生的多肽可溶性较差或不可溶(以包涵体的形式)。在不溶性蛋白的情况下，可通过离心自宿主细胞溶菌液收集蛋白质，且其后可进一步进行细胞的均质化。在可溶性不良的蛋白的情况下，可添加包含但不限于聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱发部分可溶蛋白的沉淀。随后可通过离心方便地收集沉淀蛋白。使用所属领域的一般技术人员众所周知的多种方法，可使重组宿主细胞破裂或均质化以自细胞内释放包涵体。可使用众所周知技术来进行宿主细胞破裂或均质化，这些技术包含但不限于酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化(douncehomogenization)或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中，高压释放技术是用于使假单胞菌宿主细胞破裂以释放多肽的包涵体。随后可使用所属
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中已知的众多适合溶解剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀多肽。多肽优选由尿素或盐酸胍溶解。溶解多肽的体积应最小化以使得可使用可方便操作的批量大小制备大批量。在其中重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中，这个因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造多肽时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，那么应避免可损害机器和容器的苛刻化学品或其蛋白质产物。当制备呈融合蛋白形式的多肽时，优选移除融合序列。可通过酶促或化学裂解、优选通过酶促裂解来实现融合序列的移除。可使用所属领域的技术人员众所周知的方法来实现融合序列的酶促移除。如所属领域的技术人员所了解，用于移除融合序列的酶的选择将由融合的特点决定，且反应条件将由酶的选择指定。优选通过众所周知方法自裂解的融合序列来纯化裂解多肽。如所属领域的技术人员所了解，这些方法将由融合序列和多肽的特点和性质决定。纯化方法可包含但不限于尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。多肽也优选经纯化以自蛋白质溶液移除DNA。DNA可通过所属
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中已知的任何适合方法(诸如沉淀或离子交换色谱)来移除，但优选通过用核酸沉淀剂(诸如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来移除。可使用包含但不限于离心或过滤的标准众所周知方法自沉淀DNA分离多肽。宿主核酸分子的移除在其中多肽欲用于治疗人类的装置中为重要因素且本发明的方法将宿主细胞DNA降至医药学上可接受的含量。用于小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包含但不限于发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可以分批式、流加式或连续式模式过程进行。以下例示性程序中的任一种都可用于纯化本发明的多肽亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包含但不限于)DEAESEPHAROSE);硅胶色谱；反相HPLC;凝胶过滤(使用(包含但不限于)SEPHADEXG-75);疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包含但不限于制备型等电聚焦)、差示溶解度(包含但不限于硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。根据所属领域的技术人员已知且所用的标准程序，本发明的蛋白质(包含但不限于包括非天然编码氨基酸的蛋白质)、包括非天然编码氨基酸的蛋白质的抗体、包括非天然编码氨基酸的蛋白质的结合搭配物等可部分或实质上经纯化至均质。因此，可通过所属
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中众所周知的众多方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽，这些方法包含但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、外源凝集素色谱、凝胶电泳等等。必要时，在制备正确折叠成熟蛋白质时可使用蛋白质再折叠步骤。高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它适合方法可用于需要高纯度的最后纯化步骤中。在一个实施例中，将针对非天然编码氨基酸(或包括非天然编码氨基酸的蛋白质)形成的抗体用作纯化试剂(包含但不限于)以用于包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的蛋白质的以亲和性为基础的纯化。必要时，一旦纯化(部分或至均质)，多肽即视情况用于多种应用，其包含但不限于作为检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或作为用于抗体产生的免疫原。除了本文中指出的其它参考文献之外，在所属
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中众所周知多种纯化/蛋白质折叠方法，其包含但不限于在以下文献中列出的那些R.Scopes,ProteinPurification.Springer-Verlag,N.Y.(1982);Deutscher,MethodsinEnzymology第182巻GuidetoProteinPurification,AcademicPress,Inc.N.Y.(1990);Sandana,(1997)Bios6parationofProteins.AcademicPress,Inc.;Bollag等人，(1996)ProteinMethods,第2版Wiley-Liss，NY;Walker,(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ;Harris禾口Angal，(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Harris和Angal,ProteinPurificationMethods:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Scopes,(1993)ProteinPurification:PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag,NY;Janson和Ryden，(1998)ProteinPurification:Principles,HighResolutionMethodsandApplications,第2版Wiley-VCH，NY;和Walker(1998),ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress.NJ:以及其中引用的参考文献。所属领域的技术人员应了解，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质可具有不同于相关多肽的所需构象的构象。在本发明的一个方面中，表达蛋白质视情况经变性且随后复性。此是利用所属
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中已知的方法来实现，所述方法包含但不限于通过向所关注蛋白质或多肽中添加伴侣蛋白(chaperonin)、通过将蛋白质溶解于诸如盐酸胍的离液剂中、利用蛋白质二硫化物异构酶等。一般来说，有时候需要变性且还原表达多肽且随后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白可添加到所关注的翻译产物中。所属领域的技术人员众所周知还原、变性和复性蛋白质的方法(参看上述参考文献和Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070;Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem.,4:581-585;和Buchner等人，(1992)Anal.Biochem..205:263-270)。例如，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。蛋白质可再折叠入含有(包含但不限于)氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中。再折叠试剂可流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或反之亦然。通用纯化方法可对包括多肽的细胞溶菌液或由任何分离步骤得到的任何多肽混合物进行多种分离步骤中的任一种，所述任何分离步骤包含但不限于亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱("HPLC")、反相-HPLC("RP-HPLC")、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复且以任何适当次序。用于实施本文中所述技术的设备和其它必要材料在市面上有售。泵、馏分收集器、监控器、记录器和整个系统可获自(例如)AppliedBiosystems(FosterCity，CA)、Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA)和AmershamBiosciences,Inc.(Piscataway，NJ)。包含但不限于交换基质材料、培养基和缓冲液的色谱材料也可获自这些公司。使用专用设备(诸如泵)可更迅速地实现平衡以及在本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤(诸如洗涤和洗提)。市售泵包含但不限于11^^0泵？-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。馏分收集器的实例包含RediFmc馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器和SUPERFRAC⑧馏分收集器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。混合器也可用于形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包含梯度混合器GM-l和管道混合器(AmershamBiosciences,Piscataway,N)。可使用任何市售监控器来监控色谱过程。这些监控器可用于收集如UV、pH值和传导率的信息。检测器的实例包含监控器UV-l、UVICORDSII、监控器UV-MII、监控器UV-900、监控器UPC-900、监控器pH/C-900和传导率监控器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。实际上，整个系统在市面上有售，其包含来自AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)的各种AKTA②系统。在本发明的一个实施例中，例如，可通过首先在尿素中使所得纯化多肽变性，接着在适合pH值下稀释于含有还原剂(诸如DTT)的TRIS缓冲液中来还原多肽且使其变性。在另一个实施例中，多肽是以约2M至约9M的浓度范围于尿素中变性，接着在约5.0至约8.0的范围内的pH值下于TRIS缓冲液中稀释。随后可培育这个实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，再折叠混合物在室温下培育4小时至24小时。随后可将还原且变性多肽混合物进一步分离或纯化。如本文中所述，在进行任何随后分离步骤之前，可调节第一多肽混合物的pH值。另外，可使用所属
技术领域：
中已知的技术来浓縮第一多肽混合物或其任何随后混合物。此外，可使用所属领域的一般技术人员众所周知的技术将包括第一多肽混合物或其任何随后混合物的洗提缓冲液交换为适用于下个分离步骤的缓冲液。离子交换色谱在一个实施例中，且作为可选的额外步骤，可对第一hGH多肽混合物进行离子交换色谱。通常参看IonExchangeChromatography:PrinciplesandMethods(目录号18-1114-21，AmershamBiosciences(Piscataway，NJ))。市售离子交换柱包含HITRAP、HIPREP②和HILOAD㊣柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。这些柱利用强阴离子交换器，诸如QSEPHAROSEFastFlow、QSEPHAROSEHighPerformance和QSEPHAROSEXL;强阳离子交换器，诸如SPSEPHAROSEHighPerformance、SPSEPHAROSEFastFlow和SPSEPHAROSEXL;弱阴离子交换器，诸如DEAESEPHAROSEFastFlow;和弱阳离子交换器，诸如CMSEPHAROSEFastFlow(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。可在纯化过程的任何阶段对多肽进行阳离子交换柱色谱以分离实质上经纯化的多肽。可使用任何适合阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。有用的阳离子交换基质包含但不限于纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包含但不限于纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述物质的复合物。在多肽吸附于阳离子交换器基质上之后，可通过使基质与具有足够高pH值或离子强度的缓冲液接触以自基质置换多肽来洗提实质上经纯化的多肽。用于实质上经纯化多肽的高pH值洗提中的适合缓冲液包含但不限于浓度在至少约5mM至至少约100mM的范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。反相色谱可根据所属领域的一般技术人员已知的适合方案进行RP-PIPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人，AnalBIOCHEM.(1982)124:217-230(1982);Rivier等人，J.Chrom.(1983)268:112-119;Kunitani等人，J.Chrom.(1986)359:391-402。可对hGH多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的hGH多肽。在这方面，可使用具有多种长度(包含但不限于至少约C3至至少约C3Q、至少约C3至至少约C20或至少约C3至至少约C18)的烷基官能团的二氧化硅衍生树脂。或者，可使用聚合物树脂。举例来说，可使用TosoHaasAmberchromeCG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合物树脂。此外，可用诸如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。含有离子配对剂和有机改质剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的适合洗提缓冲液可用于自RP-HPLC柱洗提多肽。最常用离子配对剂包含但不限于乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵、乙酸三乙基铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗提，其中优选减少分离时间且降低峰宽度的梯度条件。另一方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。用于本文中的适合洗提缓冲液的实例可包含但不限于乙酸铵和乙腈溶液。疏水相互作用色谱纯化技术可对多肽进行疏水相互作用色谱(HIC)。通常参看HydrophobicInteractionChromatographyHandbook:PrinciplesandMethods(巨录号18-1020-90,AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))，其是以引用的方式并入本文中。适合HIC基质可包含但不限于经垸基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包含琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂(包含但不限于聚乙烯胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水相互作用柱色谱的市售来源包含但不限于HITRAP、HIPREP②和HILOAD⑧柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。简单地说，在装载之前，可使用所属领域的一般技术人员已知的标准缓冲液(诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。在装载多肽后，随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以移除不需要的物质，但将多肽留在HIC柱上。可用约3至约10倍柱体积的标准缓冲液(诸如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗提多肽。使用(例如)磷酸钾梯度的降低的线性盐梯度也可用于洗提分子。随后可(例如)通过过滤(诸如透滤或超滤)来浓縮洗出液。可使用透滤来移除用于洗提hGH多肽的盐。其它纯化技术可对第一hGH多肽混合物或其任何随后混合物进行使用(例如)凝胶过滤(GelFiltration:PrinciplesandMethods(目录号18-1022-18，AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，其是以引用的方式并入本文中)、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等等的另一分离步骤，以移除任何过量盐且用适合缓冲液来代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最后药物产品的调配。在本文中所述的各步骤下可使用所属领域的一般技术人员已知的技术来监控多肽(包含实质上经纯化多肽)的产率。这些技术也可用于在最后分离步骤后评估实质上经纯化多肽的产率。举例来说，可使用具有多种烷基链长度的若干反相高压液相色谱柱(诸如氰基RP-HPLC、dsRP-HPLC以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC)中的任一种来监控多肽的产率。可使用诸如SDS-PAGE的标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA检定测量多肽来测定纯度。举例来说，可针对自阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质产生多克隆抗体。抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。RP-HPLC材料VydacC4(Vydac)由硅胶粒子组成，其表面带有C4-烷基链。多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水相互作用强度的差别。用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗提。使用不锈钢柱(填充2.8至3.2升VydacC4硅胶)进行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogd洗出液且将其装载于VydacC4柱上。对于洗涤和洗提来说，使用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集馏分且立即用磷酸盐缓冲液将其中和。汇集在IPC限度内的多肽馏分。DEAESepharose(Pharmacia)材料由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。通过离子性相互作用来介导多肽与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在这些物质经洗掉之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来移除痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱且用具有增加的离子强度的缓冲液洗提多肽。用DEAESepharosefastflow填充柱。调节柱体积以确保多肽装载量在每毫升凝胶3-10mg多肽的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)洗涤柱。装填HPLC洗出液的汇集馏分且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，根据标准洗提概况用洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/钾)将多肽自柱洗提且收集于单一馏分中。将DEAESepharose柱的洗出液调节至指定传导率。将所得药物物质无菌过滤入铁氟隆(Teflon)瓶中且储存在-7(TC下。多种方法和程序可用于评估含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的蛋白质的产率和纯度，这些方法和程序包含但不限于Bradford检定、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱(包含但不限于MALDI-TOF)和所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。K///.在替代系统中的表达已描述多种替代性表达系统(包含但不限于在本文中揭示的那些)用于大肠杆菌中重组蛋白表达，且这些系统可以类似方式用于本发明的假单胞菌翻译系统中。开发被称作选择性压力并入的活体内方法以使用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa，C.Minks,S.Alefelder，W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder和R.Huber，FASEBJ,,13:41(1999)。其中向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株是生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中，而靶基因的转录受到抑制。在固定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽且经非天然编码氨基酸类似物替换。重组蛋白表达的诱发使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且其在UV光谱中显示两个易于鉴别的特征性肩，例如参看C.Minks,R.Huber，L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29(2000);三氟甲硫氨酸已用于代替噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通过19FNMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry.36:3404(1997);且三氟亮氨酸已代替亮氨酸并入，使得亮氨酸-拉链蛋白的热和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl..40:1494(2001)。此外，硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸经并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBOJ"9:1665(19卯)；J.O.Boles，K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol.,1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange，C.Eckerskom，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.,230:788(1995);和N.Budisa,W.Karnbrock，S.Steinbacher,A.Humm，L.Prade,T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol..270:616(1997)。具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物也已有效并入，其允许通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett,428:68(1998);J.C.M.vanHest，K.L.Kiick和D.A.Tirrell,丄Am.Chem.Soc.122:1282(2000);和K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美国专利第6,586,207号；美国专利公开案第2002/0042097号，其是以引用的方式并入本文中。这种方法的成功取决于氨基酰基-tRNA合成酶对非天然编码氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式在于放宽氨基酰基4RNA合成酶的底物特异性，其已在有限数目的情况下达成。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置换Ala294可增加底物结合位点的尺寸，且导致对Cl-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)对tRNAPhe的酰化。参看，M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry.33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许对Cl-苯丙氨酸或对Br-苯丙氨酸代替苯丙氨酸并入。例如参看M.Ibba和H.Hennecke,FEBSLett.,364:272(1995);和N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell,FEBSLett.,467:37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phel30Ser允许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参看F.Hamano-Takaku,T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake,D.Soil和S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。在活体内将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸且因此将其活化。此错误在单独位点上得到修正，使来自tRNA的错装配氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错活化的结构类似物可避开编辑功能且经并入。目前已用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle，T.L.Hendrickson，V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel和P.Marliere，Science,292:501(2001、。ValRS可使具有Cys、Thr或氨基丁酸根(Abu)的tRNAVal错氨基酰基化；随后通过编辑域水解这些非同源氨基酸。在大肠杆菌染色体的随机突变诱发之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地用Cys装配tRNAVal。因为Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团是由Abu中的-CH3置换)，所以当这种突变大肠杆菌菌株在Abu存在的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白中的各缬氨酸位置处约24%的缬氨酸由Abu置换。先前已显示可通过向由含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白合成反应中添加化学氨基酰基化的抑制tRNA而在活体外将非天然编码氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，我们使用对特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，可用接近的结构同源物代替多种20种常见氨基酸，例如，用氟苯丙氮酸代替苯丙氨酸。例如参看Noren，C丄，Anthony-Cahill，Griffith,M.C.,Schultz，P.G.爿ge"era//weAod/orWe-s/7e"ycz'"coA7ora"owo/wow-w加wra〃yewcocfe(ia/m'woac/^s/wfo/roWw，Science,244:182-188(1989);M.W.Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain，J.D.,Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin,A.R.,Diala，E.S.5fo5^W/i"/cWe-印ec(/c/coora"'oo/awow-w加i/ra/a/m"oz"foa/o/>pe/7fzWe，J.AmChemSoc.111:8013-8014(1989);n.Budisa等人，FASEBJ.13:41-51(1999);Ellman,J.A.,Mendel，D.，Anthony-Cahill,S.,Noren,C丄，Schultz，P.G.j5/o5^"^i"/c;m"/ioc//orz'w^odwcz'"gwow-"^"//;)^e"cocfedotw/woi77e邻e"ycfl〃y/Wo/raf"."51，MethodsinEnz.,301-336(1992);和Mendel,D.,Cornish,V.W.和Schultz,P.G.M/啤ewe^a"五jc戸wcfedGew"z'cCWe,AnnuRevBiophvs.BiomolStruct.24,435-62(1995)。举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制tRNA且用非天然编码氨基酸使其化学氨基酰基化。常规定点突变诱发用于在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'，3'五xo"wdewe/"p/j(wp/joro^z/oa^-6asef/o//gowc/eof/t/e-<^>*e"ec//ww啤e肌's,NucleicAcidsRes,16(3):791-802(1988)。当酰基化抑制tRNA和突变基因组合于活体外转录/翻译系统中时，回应UAG密码子而并入非天然编码氨基酸，得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用卩H]-Phe的实验以及使用a-羟基酸的实验证实在由UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白质中的任何其它位点处并入。例如参看Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;和Ellman，J.A.，Mendel,D.,Schultz,P.G.S"e-印e"yc/"coA7on2"OMo/wove/6flc&60we/Wo;她z;M，Science,255(5041):197-200(1992)。在活体内将非天然编码氨基酸直接并入蛋白质中的能力提供以下优点突变蛋白的高产率，技术容易，在细胞中或可能在活有机体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白在治疗性治疗中的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它性质的非天然编码氨基酸包含入蛋白质中的能力可极大地扩展我们理性且系统性地操纵蛋白质结构的能力，以探究蛋白质功能且产生具有新颖性质的新蛋白质或有机体。然而，由于在蛋白质翻译中实现高保真度所需的tRNA-合成酶相互作用的复杂本质，所以所述过程是困难的。在位点特异性地并入对F-Phe的一次尝试中，酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对用于对F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参看R.Furter,ProteinSci.,7:419(1998)。使用不含细胞的(活体外)翻译系统获得本发明的聚核苷酸的表达也为可能的。在可包含mRNA作为模板(活体外翻译)或DNA作为模板(组合型活体外转录和翻译)的这些系统中，由核糖体指导活体外合成。对于开发不含细胞的蛋白质表达系统已作出相当大的努力。例如参看Kim，D.-M.和J.R.Swartz,所ofec/mo/ogy所oewgZween'"g，74:309-316(2001);Kim，D.-M.和J.R.Swartz，淑ec/mo/ogy22,1537-1542,(2000);Kim,D,M.和J.R.Swartz,尸ragre^，16,385-390，(2000);Kim，D,M.和J.R.Swartz，am/5/oe"gi"eeWwg，66，180-188，(1999);和Patnaik,R.和J.R.Swartz，所Wec/jm々wM24,862-868,(1998);美国专利第6，337，191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353;WO90/05785，其是以引用的方式并入本文中。可应用于包括非天然编码氨基酸的多肽表达的另一种方法包含mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak,Prac.iVo^/JcadSc/.(77&i>94:12297-12302(1997);A.Frankel等人，C/ze;m'WA7(&所o/ogy10:1043-1050(2003)。在这种方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)键联的mRNA模板翻译为肽。如果一种或一种以上tRNA分子已经修饰，那么非天然氨基酸也可并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子之后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽接合物在活体外检定中具有引人关注的性质，那么易于自mRNA序列揭示其特性。用这种方式，可筛检包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的多肽的文库以鉴别具有所需性质的多肽。最近，已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人，Prac.iVaf/爿cflJ.Sc/.100:6353(2003)。iX与多肽偶合的大分子聚合物可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包含将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上，这些官能团包含但不限于标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反义聚核苷酸；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。作为本文中所述组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将集中于将大分子聚合物加成到非天然氨基酸多肽上，同时应理解，对其所述的组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时经适当更改且所属领域的技术人员可用本文中的揭示内容进行)添加其它官能团(包含但不限于上文列出的那些官能团)。多种大分子聚合物和其它分子可与本发明的多肽键联以调节多肽的生物性质和/或向分子提供新颖生物性质。这些大分子聚合物可通过天然编码氨基酸、通过非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或加成到天然或非天然氨基酸上的任何取代基或官能团与多肽键联。本发明提供实质上均质的聚合物蛋白质接合物的制剂。如在本文中所用的"实质上均质"意谓观察到聚合物蛋白质接合物分子大于总蛋白质的一半。所述聚合物蛋白质接合物具有生物活性且本文中提供的本发明的"实质上均质"的聚乙二醇化多肽制剂为足够均质以显示均质制剂的优点(例如，在批次之间药物动力学的可预测性的临床应用中的简易性)的制剂。也可选择制备聚合物蛋白质接合物分子的混合物，且本文中提供的优点在于可选择包含于混合物中的单聚合物蛋白质接合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数目的所连接的聚合物部分(即，二-、三-、四-等)的混合物，且将所述接合物与所述使用本发明的方法制备的单聚合物蛋白质接合物组合，并获得具有预定比例的单聚合物蛋白质接合物的混合物。所选聚合物可为水溶性的以使得其所连接的蛋白质在水性环境(诸如生理环境)中不沉淀。聚合物可分枝或未分枝。对于最终产品制剂的治疗性用途来说，聚合物优选将为医药学上可接受的。聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将改变，其在反应混合物中的浓度也将改变。一般来说，通过所选聚乙二醇的分子量和可提供的可用反应性基团的数目可确定最佳比率(就反应效率来说，因为存在最小过量的未反应蛋白质或聚合物)。当涉及分子量时，通常聚合物的分子量越高，可与蛋白质连接的聚合物分子的数目就越少。类似地，当最佳化这些参数时，应将聚合物的分枝考虑在内。通常，分子量越高(或支链越多)，聚合物蛋白质比率就越高。水溶性聚合物可为包含但不限于线性、分叉或分枝的任何结构形式。水溶性聚合物通常为聚(垸撑二醇)(诸如聚乙二醇(PEG))，但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG来描述本发明的某些实施例。PEG为众所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根据所属
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中众所周知的方法(Sandler和Karo,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,第3巻，第138-161页)通过乙二醇的开环聚合来制备。术语"PEG"广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子而不用考虑尺寸或在PEG末端处的修饰，且可由下式表示为与hGH多肽键联XO-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y其中n为2至IO，OOO且X为H或末端修饰，其包含但不限于d-4烷基。在一些情况下，在本发明中所用的PEG在一个末端上经羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH3("甲氧基PEG")。或者，PEG可经反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包含通常用于与20种常见氨基酸中发现的官能团反应的那些反应性基团(包含但不限于马来酰亚胺基、活化碳酸酯(包含但不限于对硝基苯酯)、活化酯(包含但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)和对20种常见氨基酸呈惰性、但与非天然编码氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包含但不限于叠氮基、炔基)。应注意，PEG的另一末端(在上式中由Y表示)将通过天然存在或非天然编码氨基酸与多肽直接或间接连接。举例来说，Y可为与多肽的胺基(包含但不限于赖氨酸的s胺或N末端)键联的酰胺、氨基甲酸酯或尿素。或者，Y可为与硫醇基团(包含但不限于半胱氨酸的硫醇基团)键联的马来酰亚胺。或者，Y可为与通过20种常见氨基酸通常不可接近的残基的键。举例来说，PEG上的叠氮基可与多肽上的炔基反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮基反应以形成类似产物。在一些实施例中，强亲核试剂(包含但不限于肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码氨基酸中存在的醛或酮基反应以形成腙、肟或縮氨基脲，适当时，在一些情况下其可通过由适当还原剂处理而进一步还原。或者，强亲核试剂可通过非天然编码氨基酸并入多肽中且用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基反应。可按照实际需要使用任何分子质量的PEG，其必要时包含但不限于约100道尔顿(Dalton;Da)至100,000道尔顿或更大(包含但不限于有时为0.1-50kDa或10-40kDa)。也可使用支链PEG，其包含但不限于各链具有在1-100kDa(包含但不限于1-50kDa或5-20kDa)范围内的MW的PEG分子。多种PEG分子描述于(包含但不限于)ShearwaterPolymers,Inc.目录、NektarTherapeutics目录中，其以引用的方式并入本文中。通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，带有用于与氨基酸侧链反应的炔基和叠氮基部分的PEG衍生物可用于将PEG与如本文中所述的非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包括叠氮基，那么PEG通常将含有实现[3+2]环加成产物形成的炔部分或实现酰胺键形成的含有膦基的活化PEG物质(即，酯、碳酸酯)。或者，如果非天然编码氨基酸包括炔，那么PEG通常将含有实现[3+2]Huisgen环加成产物形成的叠氮基部分。如果非天然编码氨基酸包括羰基，那么PEG通常将分别包括有效亲核试剂(包含但不限于酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以实现相应腙、肟和縮氨基脲键的形成。在其它替代物中，可使用上述反应性基团的相反定向，即，非天然编码氨基酸中的叠氮基部分可与含有炔的PEG衍生物反应。在一些实施例中，具有PEG衍生物的多肽含有可与非天然编码氨基酸的侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。在一些实施例中，本发明提供含叠氮基和乙炔的聚合物衍生物，其包括具有约800Da至约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚乙二醇。然而，应了解包含但不限于聚乙二醇和其它相关聚合物(包含聚(葡聚糖)和聚丙二醇)的多种水溶性聚合物也适用于实施本发明，且术语PEG或聚乙二醇的使用打算涵盖且包含所有这些分子。术语PEG包含但不限于其任何形式的聚乙二醇，包含双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、支链PEG、侧接PEG(即具有一种或一种以上与聚合物主链侧接的官能团的PEG或相关聚合物)或其中具有可降解键的PEG。PEG通常为透明、无色无味的，可溶于水中，对热稳定，对许多化学剂呈惰性，不水解或变质，且通常无毒。认为聚乙二醇为生物相容性的，也就是说PEG能够与活组织或有机体共存而不造成伤害。更特定来说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说PEG在体内不倾向于产生免疫反应。当与在体内具有一些所要功能的分子(诸如生物活性剂)连接时，PEG倾向于掩蔽所述药剂且可减少或消除任何免疫反应以使得有机体可耐受所述药剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质免疫反应或造成凝血或其它不需的效应。具有式--CH2CH20-(CH2CH20)n—CH2CH2—(其中n为约3至约4000，通常约20至约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，具有约800Da至约100,000Da的分子量的PEG尤其适于用作聚合物主链。聚合物主链可为线性或分枝的。所属
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中通常已知分枝聚合物主链。通常，分枝聚合物具有中心分枝核心部分和多个与中心分枝核心键联的线性聚合物链。PEG通常以分枝形式使用，其可通过向各种多元醇(诸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)中添加环氧乙垸来制备。中心分枝部分也可自若干种氨基酸(诸如赖氨酸)衍生。分枝聚乙二醇可以通用形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R是衍生自诸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇的核心部分，且m表示臂数目。多臂PEG分子(诸如在美国专利第5，932，462号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596;WO96/21469;和WO93/21259中所述的那些，这些文献各自是以引用的方式全部并入本文中)也可用作聚合物主链。分枝PEG也可为由PEG(-YCHZ2)n表示的分叉PEG的形式，其中Y为键联基团且Z为通过规定长度的原子链与CH键联的活化末端基团。另一分枝形式侧接PEG沿PEG主链而不是在PEG链的末端上具有诸如羧基的反应性基团。除这些形式的PEG之外，也可制备在主链中具有弱键或可降解键的聚合物。举例来说，可制备在聚合物主链中具有受水解影响的酯键的PEG。如下文所示，此水解使聚合物裂解为较低分子量的片段--PEG-C02-PEG-+H20+PEG-C02H+HO-PEG-所属领域的技术人员应了解，术语聚乙二醇或PEG表示或包含所属
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中已知的所有形式，其包含但不限于在本文中所揭示的那些形式。许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具有2至约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。适合聚合物的实例包含但不限于其它聚(烷撑二醇)，诸如聚丙二醇("PPG")、其共聚物(包含但不限于乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等等。尽管聚合物主链的各链的分子量可改变，但其通常在约800Da至约100，000Da、通常约6，000Da至约80，000Da的范围内。所属领域的一般技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述列表绝非详尽的且仅为说明性的，且预期具有上述品质的所有聚合物材料都适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为"多官能的"，意谓聚合物主链具有经官能团官能化或活化的至少两个末端且可能多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包含但不限于具有两个末端的线性聚合物，其中每一末端与可相同或不同的官能团键结。在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构X—A—POLY—B~N=N=N其中N:N-N为叠氮基部分；B为键联部分，其可存在或不存在；POLY为水溶性非抗原聚合物；A为键联部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且X为第二官能团。A和B的键联部分的实例包含但不限于含有多达18个且更优选1-10个的碳原子的多官能化垸基。诸如氮、氧或硫的杂原子可包含于烷基链中。垸基链也可在杂原子上分枝。A和B的键联部分的其它实例包含但不限于含有多达10个且更优选5-6个碳原子的多官能化芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适合键联基团的其它实例包含在美国专利第5,932,462号、第5,643,575号和美国专利申请公开案2003/0143596中所述的那些键联基团，这些文献是以引用的方式并入本文中。所属领域的一般技术人员将认识到，键联部分的上述列表绝非详尽的且仅为说明性的，且预期具有上述品质的所有键联部分都适用于本发明中。用作X的适合官能团的实例包含但不限于羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和l-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和l-苯并三唑基碳酸酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙基磺酸盐、烯烃、酮和叠氮化物。如所属领域的技术人员所了解，所选X部分应与叠氮基相容以使得不与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为同双官能的，意谓第二官能团(即，X)也是叠氮基部分，或异双官能的，意谓第二官能团为不同官能团。术语"经保护"指的是存在防止在某些反应条件下化学反应性官能团发生反应的保护基或部分。保护基将视欲保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苄基或诸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所属
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中已知的其它保护基也可用于本发明中。文献中末端官能团的特定实例包含但不限于N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(例如参看美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参看Buckmann等人，Makromol.Chem.182:1379(1981);Zaplipsky等人，Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如参看Andresz等人，Makromol.Chem.179:301(1978))、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(例如参看Olson等人，Poly(ethyleneglycol)Chemistry&BiologicalA卯lications，第170-181页，Harris禾卩Zaplipsky编，ACS,Washington,D.C.，1997;也参看美国专利第5，672，662号)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(例如参看Abuchowski等人，CancerBiochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人，Macrolol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亚胺基酯(例如参看美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(例如参看美国专利第5，650，234号)、縮水甘油醚(例如参看Pitha等人,Eur.JBiochem.94:11(1979);Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧基羰基咪唑(例如参看Beauchamp等人，Anal.Biochem.131:25(1983);Tondelli等人，J.ControlledRelease1:251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech"11:141(1985);和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech"27:45(1991))、醛(例如参看Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984);美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参看Goodson等人，Bio/Technology8:343(1990);Romani等人，ChemistryofPeptidesandProteins2:29(1984);和Kogan,SyntheticComm.22:2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(例如参看Woghiren等人，Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如参看Sawhney等人，Macromolecules，26:581(1993))、乙烯基砜(例如参看美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包括具有以下结构的聚合物主链X~CH2CH20—(CH2CH20)n—CH2CH2-N=N=N其中X为如上所述的官能团；且n为约20至约4000。在另一个实施例中，本发明的聚合物衍生物包括具有以下结构的聚合物主链X~CH2CH20—(CH2CH20)n—CH2CH2-0-(CH2)m-W-N=N=N其中W为包括介于1-10个之间的碳原子的脂肪族或芳香族键联部分；n为约20至约4000;且X为如上所述的官能团，m介于l与10之间。可通过所属
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中已知和/或在本文中揭示的多种方法来制备本发明的含叠氮基的PEG衍生物。在下文展示的一种方法中，具有约800Da至约100，000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与适合离去基键结的第二末端)与叠氮基阴离子(其可与众多适合抗衡离子(包含钠、钾、叔丁基铵等等)中的任一种配对)反应。离去基经历亲核置换且由叠氮基部分置换，得到所需含叠氮基的PEG聚合物。X-PEG-L+N3'X-PEG-N3如所示，用于本发明中的适合聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚乙二醇且X为不与叠氮基反应的官能团且L为适合离去基。适合官能团的实例包含但不限于羟基、经保护羟基、縮醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫吡啶和乙烯基吡啶以及酮。适合离去基的实例包含但不限于氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙基磺酸根和甲苯磺酸根。在用于制备本发明的含叠氮基聚合物衍生物的另一种方法中，使带有叠氮基官能团的键联剂与具有约800Da至约IOO，OOODa的平均分子量的水溶性聚合物主链接触，其中键联剂带有会与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应的化学官能团，以形成含叠氮基聚合物衍生物产物，其中叠氮基是由键联基团与聚合物主链分离。例示性反应流程展示如下X-PEG-M+N,联齐^N-N-N+PG-X-PEG凝联剂-N-N-N其中PEG为聚乙二醇且X为诸如垸氧基的封端基团或如在上文中所述的官能团；且M为不可与叠氮基官能团反应、但可与N官能团有效且选择性反应的官能团。适合官能团的实例包含但不限于如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核基团，那么M为离去基。可由已知方法(包含但不限于沉淀产物，必要时接着色谱)实现粗产物的纯化。下文展示在PEG二胺的情况下的更特定实例，其中一个胺经诸如叔丁基-Boc的保护基部分保护且所得单保护PEG二胺与带有叠氮基官能团的键联部分反应BocHN-PEG-NH2+H02C-(CH2)3-N=N-N。在这种情况下，可使用多种活化剂(诸如亚硫酰氯或碳化二酰亚胺试剂以及N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)使胺基与羧酸基团偶合以在单胺PEG衍生物与带有叠氮基的键联剂部分之间产生酰胺键。在酰胺键成功形成之后，所得经N-叔丁基-Boc保护的含叠氮基衍生物可直接用于修饰生物活性分子或其可经进一步精制以安装其它有用官能团。举例来说，可通过用强酸处理使N-t-Boc基团水解以产生o)-氨基-PEG-叠氮化物。所得胺可用作安装其它有用官能团(诸如马来酰亚胺基团、活化二硫化物、活化酯等等)的合成把手(synthetichandle)以产生有价值的异双官能试剂。当需要将不同分子与聚合物的每一末端连接时，异双官能衍生物尤其有用。举例来说，co-N-氨基-N-叠氮基PEG会允许具有活化亲电子基团(诸如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等等)的分子与PEG的一个末端连接且具有乙炔的分子与PEG的另一个末端连接。在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构X—A—POLY—B~~CsC-R其中R可为H或垸基、烯烃、烷氧基或芳基或经取代芳基；B为键联部分，其可存在或不存在；POLY为水溶性非抗原性聚合物；A为键联部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且X为第二官能团。A和B的键联部分的实例包含但不限于含有多达18个且更优选1-10个的碳原子的多官能化垸基。诸如氮、氧或硫的杂原子可包含于垸基链中。烷基链也可在杂原子上分枝。A和B的键联部分的其它实例包含但不限于含有多达10个且更优选5-6个碳原子的多官能化芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适合键联基团的其它实例包含在美国专利第5,932,462号和第5,643,575号和美国专利申请公开案2003/0143596中所述的那些键联基团，这些文献是以引用的方式并入本文中。所属领域的一般技术人员将认识到，键联部分的上述列表绝非详尽的且仅为说明性的，且预期具有上述品质的多种键联部分适用于本发明中。用作X的适合官能团的实例包含羟基、经保护羟基、垸氧基、活性酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和l-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和l-苯并三唑基碳酸酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氟酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙基磺酸盐、烯烃、酮和乙炔。如所属领域的技术人员所了解，所选X部分应与乙炔相容以使得不与乙炔发生反应。含乙炔的聚合物衍生物可为同双官能的，意谓第二官能团(即，X)也是乙炔部分，或异双官能的，意谓第二官能团为不同官能团。在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物包括具有以下结构的聚合物主链X__CH2CH20—(CH2CH20)n—CH2CH2-0-(CH2)m-OCH其中X为如上所述的官能团；n为约20至约4000;且m介于1与IO之间。各异双官能PEG聚合物的特定实例展示如下。可使用所属
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中已知和/或在本文中揭示的方法来制备本发明的含乙炔的PEG衍生物。在一种方法中，使具有约800Da至约IOO，OOODa的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与适合亲核基团键结的第二末端)与适于与PEG上的亲核基团反应的带有乙炔官能团和离去基的化合物反应。当带有亲核部分的PEG聚合物与带有离去基的分子组合时，离去基经历亲核置换且由亲核部分置换，得到所需含乙炔的聚合物。X-PEG-Nu+L-A-C^X-PEG-Nu-A-OCR，如所示，用于反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚乙二醇，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。Nu的实例包含但不限于主要通过SN2型机理反应的胺、垸氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯、酰肼、氨氧基。Nu基团的其它实例包含主要通过亲核加成反应来反应的那些官能团。L基团的实例包含氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙基磺酸根和甲苯磺酸根和预期经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、a-p不饱和羰基、碳酸酯和预期经历亲核试剂加成的其它亲电子基团。在本发明的另一个实施例中，A为具有介于l-10个之间的碳原子的脂肪族键联剂或具有介于6-14个之间的碳原子的经取代芳基环。X为不与叠氮基反应的官能团且L为适合离去基。在用于制备本发明的含乙炔聚合物衍生物的另一种方法中，使具有约800Da至约100,000Da的平均分子量、在一个末端上带有经保护官能团或封端剂且在另一个末端上带有适合离去基的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。例示性反应流程展示如下X-PEG-L+-OCR，^X-PEG-CsCR，其中PEG为聚乙二醇且X为诸如烷氧基的封端基团或如上所述的官能团；且R'为H、烷基、垸氧基、芳基或芳氧基或经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。在上文实例中，当与足够浓度的乙炔阴离子接触时，离去基L应充分反应以经历SN2型置换反应。所属
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中众所周知由乙炔阴离子实现离去基的SN2置换所需的反应条件。通常可由所属
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中已知的方法(包含但不限于沉淀产物，必要时接着色谱)来实现粗产物的纯化。与本发明的多肽键联的水溶性聚合物在多肽链中的数目和位置(即，聚乙二醇化或糖基化的程度)可经调节以提供改变的(包含但不限于增加或降低的)药理学、药物动力学或药效特征(诸如活体内半衰期)。在一些实施例中，多肽的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、10倍、50倍或至少约100倍。含有强亲核基团(即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物在本发明的一个实施例中，包括含羰基非天然编码氨基酸的多肽经含有与PEG主链直接键联的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰。在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-0-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-l,000且X视情况为可存在或不存在的羰基(OO)。在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为IOO-I，OOO。在本发明的另一个实施例中，包括含羰基氨基酸的hGH多肽经含有借助于酰胺键与PEG主链键联的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰。在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-0-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-X-NH-NH2其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为IOO-I，OOO且X视情况为可存在或不存在的幾基(C=0)。在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为IOO-I，OOO。在本发明的另一个实施例中，包括含羰基氨基酸的多肽经含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且更优选5-20kDa范围内的MW。在本发明的另一个实施例中，包括非天然编码氨基酸的多肽经具有分枝结构的PEG衍生物修饰。举例来说，在一些实施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物将具有以下结构-[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000，且X视情况为可存在或不存在的羰基(c=o)。在一些实施例中，含有氨基脲基团的PEG衍生物将具有以下结构[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0)-NH-CH2-CH2〗2CH-X-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为IOO-I，OOO。在一些实施例中，含有羟胺基团的PEG衍生物将具有以下结构[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-0-NH2其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、0、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为IOO-I，OOO。用于聚合物的活化和肽的接合的方法和化学描述于文献中且在所属
技术领域：
中已知。用于活化聚合物的常用方法包含但不限于用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二酰亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团。(参看R.F.Taylor，(1991),PROTEINImmobilisation.FundamentalandApplications,MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992)，ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking,CRCPress,BocaRaton;G.T.Hermanson等人，(1993),ImmobilizedAffinityLigandTechniques,AcademicPress,N.Y.;Du皿，R丄.等人编，POLYMERICDRUGSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,ACSSymposiumSeries第469巻，AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.1991)。可获得关于PEG的官能化和接合的若干概述和专论。例如参看Harris,Macro朋/.C7iew,PA".C25:325-373(1985);Scouten,A/"&oc/s￡"z>wo〖ogy135:30-65(1987);Wong等人，五"zy/weAfzcro6.Tec/mo/14:866-874(1992);Delgado等人，Oz"ca/及evzews!"77lem;ew"cZ>wgC。m.e;49:249-304(1992);Zalipsky，肠co咖gafeChem.6:150-165(1995)。用于活化聚合物的方法也可见于WO94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO94/04193、美国专利第5，219，564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5，281，698号和WO93/15189中，以及使活化聚合物与包含但不限于凝血因子VIII(WO94/15625)、血红蛋白(WO94/09027)、携氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，々少.说oc/ze肌所o,ecA.11:141-45(1985))的酶之间接合的方法。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。通过任何便利方法进行含有非天然编码氨基酸(诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的多肽的聚乙二醇化(即，添加任何水溶性聚合物)。举例来说，用经炔基封端的mPEG衍生物使多肽聚乙二醇化。简单地说，在室温下在搅拌下向含对叠氮基-L-Phe的多肽的水溶液中添加过量固体mPEG(5000)-O-CHrC三CH。通常用具有接近反应进行的pH值(通常pH值约为4-10)的pKa的缓冲液缓冲水溶液。用于在pH7.5下聚乙二醇化的适合缓冲液的实例(例如)包含但不限于HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HC1、EPPS和TES。必要时连续监控且调节pH值。通常使反应持续进行约l-48小时之间。反应产物随后经历疏水相互作用色谱以将聚乙二醇化多肽变体与游离mPEG(5000)-O-CH2-C三CH和当未封闭PEG在分子两端经活化从而使hGH多肽变体分子交联时可形成的聚乙二醇化hGH多肽的任何高分子量复合物分离开来。疏水相互作用色谱期间的条件应使得游离mPEG(5000)-O-CH2-CECH流过柱，而任何交联聚乙二醇化hGH多肽变体复合物在所需形式后流出，其含有与一个或一个以上PEG基团接合的一种hGH多肽变体分子。适合条件视交联复合物相对于所需接合物的相对尺寸而改变且易于由所属领域的技术人员确定。将含有所需接合物的洗出液通过超滤浓縮且通过透滤脱盐。必要时，可由一种或一种以上所属领域的技术人员已知的程序进一步纯化获自疏水性色谱的聚乙二醇化多肽，这些程序包含但不限于亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包含但不限于)DEAESEPHAROSE);硅胶色谱；反相HPLC;凝胶过滤(使用(包含但不限于)SEPHADEXG-75);疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚集；置换色谱；电泳程序(包含但不限于制备型等电聚焦)；差示溶解度(包含但不限于硫酸铵沉淀)；或萃取。可通过与球状蛋白质标准物(PROTEINPURIFICATIONMethods,Apracticalapproach(Harris和Angal编)IRLPress1989，293-306)进行比较由GPC来估计表观分子量。可通过蛋白水解降解(包含但不限于胰蛋白酶裂解)，接着质谱分析来评估hGH-PEG接合物的纯度。PepinskyB.等人，i^annco/.&五jc;.77^.297(3):1059-66(2001)。可不受限制地进一步衍生或取代与本发明的多肽的氨基酸键联的水溶性聚合物。含疊氮基的PEG衍生物在本发明的另一个实施例中，多肽是经含有可与非天然编码氨基酸的侧链上存在的炔基部分反应的叠氮基部分的PEG衍生物修饰。一般来说，PEG衍生物具有在1-100kDa且在一些实施例中10-40kDa的范围内的平均分子量。在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-N3其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为IOO-I，OOO(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在另一实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0)-(CH2)p-N3其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在本发明的另一个实施例中，包括含炔基氨基酸的多肽是经含有末端叠氮基部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且更优选5-20kDa的范围内的MW。举例来说，在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，且n为100-1,000，且X视情况为O、N、S或羰基(OO)，在每一情况下X可存在或不存在。含炔基PEG衍生物在本发明的另一个实施例中，多肽是经含有可与非天然编码氨基酸的侧链上存在的叠氮基部分反应的炔基部分的PEG衍生物修饰。在一些实施例中，炔基末端PEG衍生物将具有以下结构HO-(CH2GH20)n-CHGH2)m-feGH其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在本发明的另一个实施例中，包括含炔基非天然编码氨基酸的多肽是经含有借助于酰胺键与PEG主链键联的末端叠氮基或末端炔基部分的PEG衍生物修饰。在一些实施例中，炔基末端PEG衍生物将具有以下结构-RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0>(CH2VCsCH其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。在本发明的另一个实施例中，包括含叠氮基氨基酸的hGH多肽是经含有末端炔基部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且更优选5-20kDa范围内的MW。举例来说，在一些实施例中，炔基末端PEG衍生物将具有以下结构[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pOCH其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，且n为100-1,000,且X视情况为O、N、S或羰基(C=0)或不存在。含膦PEG衍生物在本发明的另一个实施例中，多肽是经含有活化官能团(包含但不限于酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰，所述官能团进一步包括会与非天然编码氨基酸的侧链上存在的叠氮基部分反应的芳基膦基团。一般来说，PEG衍生物将具有在1-100kDa且在一些实施例中10-40kDa的范围内的平均分子量。在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage85</formula>其中n为l-10;X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构:其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可为H、垸基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包含但不限于-CH2、-C(CH3)3、-OR'、墨NR'R"、-SR'、-卣素、-C(O)R'、國CONR'R"、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-0^和->^02。R'、R"、R'"和R""各自独立地指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包含但不限于经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫垸氧基或芳基垸基。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R'"和R""基团一样独立地选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包含但不限于l-吡咯垸基和4-吗啉基。根据关于取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语"垸基"打算包含包括与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，诸如卣垸基(包含但不限于-CF3和-CH2CF3)和酰基(包含但不限于-C(0)CH3、-C(0)CF3、-C(0)CH2OCH3等等)。其它PEG衍生物以及通用聚乙二醇化技术可与多肽键联的其它例示性PEG分子和聚乙二醇化方法包含在以下文献中所述的那些例如，美国专利公开案第2004/0001838号；第2002/0052009号;第2003/0162949号；第2004/0013637号；第2003/0228274号；第2003/0220447号；第2003/0158333号；第2003/0143596号；第2003/0114647号；第2003/0105275号；第2003/0105224号；第2003/0023023号；第2002/0156047号；第2002/0099133号；第2002/0086939号；第2002/0082345号；第2002/0072573号；第2002/0052430号；第2002/0040076号；第2002/0037949号；第2002/0002250号；第2001/0056171号；第2001/0044526号；第2001/0027217号;第2001/0021763号；美国专利第6，646，110号;第5,824,778号;第5,476,653号；第5,219,564号；第5，629，384号；第5,736,625号；第4，卯2,502号；第5,281,698号；第5,122,614号；第5，473，034号；第5,516,673号；第5，382,657号；第6,552,167号；第6,610,281号；第6,515,100号；第6,461,603号；第6,436,386号；第6，214，966号;第5,990,237号；第5，900，461号；第5,739,208号；第5，672，662号；第5，446，090号；第5,808,096号；第5,612,460号；第5,324,844号;第5,252,714号;第6，420，339号；第6,201,072号；第6,451,346号；第6,306,821号；第5,559,213号；第5,612,460号；第5,747,646号；第5，834，594号；第5,849,860号；第5,980,948号；第6,004,573号；第6,129,912;WO97/32607、EP229,108、EP402,378、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、W095/13312、EP921131、WO98/05363、EP809996、WO96/41813、WO96/07670、EP605963、EP510356、EP400472、EP183503和EP154316,其是以引用的方式并入本文中。本文中所述的任一种PEG分子可以任何形式使用，所述形式包含但不限于单链、分枝、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。X多傲的糖基化本发明包含结合有一个或一个以上带有糖残基的非天然编码氨基酸的多肽。糖残基可为天然(包含但不限于N-乙酰基葡糖胺)或非天然(包含但不限于3-氟半乳糖)。糖可通过N或0键联的糖苷键(包含但不限于N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包含但不限于肟或相应的C或S键联糖苷)与非天然编码氨基酸键联。糖(包含但不限于糖基)部分可在活体内或活体外添加到多肽中。在本发明的一些实施例中，包括含羰基非天然编码氨基酸的多肽是经以氨氧基衍生的糖修饰以通过肟键键联产生相应糖基化多肽。一旦与非天然编码氨基酸连接，糖即可通过用糖基转移酶和其它酶处理而进一步精制以产生与多肽结合的寡糖。例如参看H.Liu等人，乂X附.CAe附.Soc.125:1702-1703(2003)。在本发明的一些实施例中，包括含羰基非天然编码氨基酸的多肽是经制备为氨氧基衍生物的具有规定结构的聚糖直接修饰。所属领域的技术人员将认识到，其它官能团(包含叠氮基、炔基、酰肼、肼和氨基脲)可用于将糖与非天然编码氨基酸键联。在本发明的一些实施例中，包括含叠氮基或炔基非天然编码氨基酸的多肽随后可分别经(包含但不限于)炔基或叠氮基衍生物由(包含但不限于)Huisgen[3+2]环加成反应进行修饰。这种方法允许在极高选择性下修饰蛋白质。JWK没药和医药组合物本发明的多肽或蛋白质(包含但不限于包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的蛋白质等)视情况(包含但不限于)与适合医药载剂组合用于治疗用途。这些组合物(例如)包括治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包含但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。制备适用于投药模式的调配物。一般来说，所属
技术领域：
中众所周知投与蛋白质的方法且其可用于投与本发明的多肽。根据所属
技术领域：
中众所周知的方法，包括一种或一种以上本发明的多肽的治疗组合物视情况在一种或一种以上适当活体外和/或活体内患病动物模型中进行测试以确认功效、组织代谢且评估剂量。特定来说，可由本文中的非天然氨基酸与天然氨基酸同源物相比(包含但不限于经修饰以包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的多肽与天然氨基酸多肽的比较)(即，在相关检定中)的活性、稳定性或其它适合量度来初始确定剂量。通过通常用于引入分子以最终与血液或组织细胞接触的任何途径进行投药。本发明的非天然编码氨基酸多肽是视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂以任何适合方式一起投与。可使用向患者投与本发明上下文中的这些多肽的适合方法，且尽管一种以上途径可用于投与特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径更即时且更有效的作用或反应。医药学上可接受的载剂是部分由欲投与的特定组合物以及由用于投与组合物的特定方法决定。因此，存在多种本发明的医药组合物的适合调配物。可由包含但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或经直肠方式的多种途径投与多肽组合物。经修饰或未经修饰的包括非天然氨基酸多肽的组合物也可通过脂质体投与。所属领域的技术人员通常已知这些投药途径和适当调配物。单独或与其它适合组分组合的包括非天然氨基酸的多肽也可制成通过吸入投与的气溶胶调配物(即，其可"雾化")。气溶胶调配物可置于加压的可接受推进剂(诸如二氯二氟甲垸、丙垸、氮气等等)中。适用于非经肠投药(诸如，通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包含水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。包装核酸的调配物可呈现于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。非经肠投药和静脉内投药为优选投药方法。特定来说，已用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包含但不限于通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药递送蛋白的那些投药途径)以及目前使用的调配物一起提供优选投药途径和本发明的多肽的调配物。在本发明的上下文中，视应用而定，投与患者的剂量足以随时间在患者中产生有益治疗反应，或(包含但不限于)抑制病原体感染或其它适当活性。剂量是由以下因素决定特定载体或调配物的功效和所用非天然编码氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的状况，以及欲治疗的患者的体重或表面积。剂量大小也由特定患者中伴随特定载体、调配物等等的投与产生的任何有害副作用的存在、性质和程度决定。在确定在治疗或预防疾病(包含但不限于癌症、遗传性疾病、糖尿病、AIDS等等)中欲投与的载体或调配物的有效量时，医师评估循环血浆含量、调配物毒性、疾病进程和/或(相关时)抗非天然编码氨基酸多肽抗体的产生。(例如)向70千克患者投与的剂量通常在相当于目前使用的治疗性蛋白的剂量的范围内，其是根据相关组合物的改变的活性或血清半衰期进行调节。本发明的载体可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，这些常规疗法包含抗体投与、疫苗投与、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等等。对于投药来说，本发明的调配物是在由相关调配物的LD-50或ED-50和/或对在各种浓度下非天然编码氨基酸的任何副反应(包含但不限于当关系到患者的体重和整体健康时)的观测所确定的速率下投与。可通过单一或多次剂量实现投药。如果经历调配物输液的患者出现发热、发冷或肌痛，那么他/她接受适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它疼痛/发热控制药物。在即将输液前30分钟，用阿司匹林、醋氨酚或(包含但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)对经历输液反应(诸如发热、肌痛和发冷)的患者进行前驱用药。度冷丁(meperidine)用于不能对退热剂和抗组胺剂迅速作出反应的更严重的发冷和肌痛。视反应的严重性而定减缓或中断细胞输液。本发明的多肽可直接投与哺乳动物个体。通过通常用于向个体引入多肽的任何途径进行投药。根据本发明的实施例的多肽组合物包含适于口服、经直肠、局部、吸入(包含但不限于通过气溶胶)、经颊(包含但不限于舌下)、经阴道、非经肠(包含但不限于皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面，其包含气管表面)以及经皮投药的那些多肽组合物，但在任何给定情况下最适合途径将视欲治疗的病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身性投药。化合物的调配物可呈现于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。本发明的多肽可制备为单位剂量可注射形式(包含但不限于溶液、悬浮液或乳液)与医药学上可接受的载剂的混合物。也可通过连续输液(使用(包含但不限于)微型泵，诸如渗透泵)、团注(singlebolus)或缓释储槽调配物来投与本发明的多肽。适于投药的调配物包含水性和非水性溶液(等张无菌溶液)，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可由先前所述类型的无菌粉末、颗粒和片剂来制备溶液和悬浮液。本发明的医药组合物可包括医药学上可接受的载剂。医药学上可接受的载剂部分是由欲投与的特定组合物以及由用于投与组合物的特定方法决定。因此，存在多种本发明的医药组合物(包含可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的适合调配物。(例如参看及e;m'"gfoM's尸/uw脂cew"WSdewces,第17版，1985))。适合载剂包含缓冲剂，其含有磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，其包含抗坏血酸；低分子量(少于约IO个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，其包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;二价金属离子，诸如锌、钴或铜；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如Tween、PluronicsTM或PEG。本发明的多肽(包含与诸如PEG的水溶性聚合物键联的多肽)也可通过持续释放系统或作为其部分来投与。持续释放组合物包含(包含但不限于)呈定形物品(包含但不限于薄膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包含生物相容性材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人，J!5f画dA/血M，15:167-277(1981);Langer,C^w.rec/i.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚一D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)、聚乳酸(polylactide;polylacticacid)(美国专利第3，773，919号；EP58,481)、聚乙醇酸(乙醇酸的聚合物)、聚乳酸-共-乙醇酸(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与，乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman等人，5/叩o/ywe22，547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物也包含脂质体捕获的化合物。含有化合物的脂质体是由本身已知的方法来制备DE3,218,121;Epstein等人，麵.爿ca《Sc/C/.S.A,82:3688-3692(1985);Hwang等人，Prac.脂/爿cadScft/.S.左，77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP102,324。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。脂质体捕获的多肽可由以下方法来制备，其描述于(例如)DE3,218,121;Epstein等人，Wa"爿cac/.C/.S.A，82:3688-3692(1985);Hwang等人，iVoc.TVa".爿cadSc/.C/.5H，11:4030-4034(1980);EP52,322;EP36，676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP102,324中。脂质体的组成和尺寸为众所周知的或能够由所属领域的技术人员根据经验容易地确定。脂质体的一些实例描述于(例如)ParkJW等人，iVoc.Scz'.t/&492:1327-1331(1995);LasicD和PapahadjopoulosD(编):MedicalApplicationsofLiposomes(1998);DmmmondDC等人，LiposomaldrugdeliverySystemsforcancertherapy,在TeicherB(编)CANCERDRUGDiscoveryandDevelopment(2002)中；ParkJW等人，C"".Ca"cer及仏8:1172-1181(2002);NielsenUB等人，5/oc/m.所o//i".爿"a1591(1-3):109-118(2002);MamotC等人，Ca"cer63:3154-3161(2003)中。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。在本发明的上下文中，向患者投与的剂量应足以随时间在个体中产生有益反应。通常，每剂量非经肠投与的本发明的多肽的总医药学有效量在每天每千克患者体重约0.01吗至约100ng或约0.05mg至约lmg的范围内，但此受治疗判断影响。给药频率也由治疗判断影响，且可比经批准用于人类的市售多肽产品的频率更大或更小。通常，本发明的聚乙二醇化多肽可通过上述任何投药途径投与。实例提供以下实例以说明而不是限制本发明。实例1包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)的假单胞菌种宿主细胞翻译系统用于表达含有非天然编码氨基酸的hGH。O-RS优先使具有非天然编码氨基酸的O-tRNA氨基酰基化。假单胞菌翻译系统转而回应经编码选择密码子而将非天然编码氨基酸插入hGH中。如所属
技术领域：
中所述来建构假单胞菌种的多肽表达系统(参看ProductionofRecombinantProteins:NovelMicrobialandEukaryoticExpressionSystems,Gellissen(编辑)，JohnWiley&Sons,Inc.publisher,2005)。利用荧光假单胞菌生物型I菌株MB101。表2:O-RS和O-tRNA序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>用含有经修饰hGH基因和正交氨基酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然编码氨基酸具特异性)的质粒转化荧光假单胞菌允许将非天然编码氨基酸位点特异性地并入hGH多肽中。在37'C下在含有介于0.01-100mM之间的特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的经转化荧光假单胞菌在高保真度和高效率下表达经修饰hGH。含有非天然编码氨基酸的His标记hGH是由假单胞菌宿主细胞以可溶性蛋白、包涵体或聚集体形式产生。用于纯化hGH的方法在所属
技术领域：
中众所周知且由SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾-电离离子阱质谱等等证实。在装载于凝胶上之前，通过由制造商提供的标准His标记蛋白纯化程序使用ProBond镍螯合树脂(Invitrogen，Carlsbad,CA)，接着通过阴离子交换柱来纯化His标记hGH蛋白。为进一步评估经修饰hGH多肽的生物活性，使用测量hGH与其受体的相互作用的下游标记的检定。hGH与其内源产生受体的相互作用使得转录家族成员STAT5的信号转导因子和活化因子在人类IM-9淋巴细胞系中进行酪氨酸磷酸化。用本发明的hGH多肽刺激IM-9细胞。人类IM-9淋巴细胞可购自ATCC(Manassas,VA)且生长于补充有丙酮酸钠、青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)(Invitrogen，Carlsbad,SanDiego)和10%热灭活胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的RPMI1640中。将IM-9细胞在检定培养基(无苯酚红的RPMI、10mMHepes、经1%热灭活木炭/葡聚糖处理的FBS、丙酮酸钠、青霉素和链霉素)中饥饿整夜，随后在37'C下用12点剂量范围的hGH多肽刺激10分钟。将受激细胞用1%甲醛固定，随后在冰上用卯％冰冷甲醇渗透1小时。通过在室温下用第一磷酸基-STAT5抗体(CellSignalingTechnology,Beverly,MA)进行细胞内染色30分钟、接着用PE接合的第二抗体染色来检测STAT5磷酸化程度。在FACS阵列上进行样品获取，其中所获取的数据是在Flowjo软件(TreeStarInc.,Ashland,OR)上分析。自使用SigmaPlot以平均荧光强度(MFI)对蛋白质浓度绘制的剂量反应曲线得到ECso值。本实例详述含羰基氨基酸的引入以及其与含氨氧基PEG的随后反应。本实例展示用于产生结合有含酮非天然编码氨基酸的hGH多肽的方法，所述氨基酸随后与约5,000MW的含氨氧基PEG反应。所选氨基酸位置可经具有以下结构的非天然编码氨基酸单独取代一旦经修饰，包括含羰基氨基酸的hGH多肽变体就与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应R-PEG(N)-0-(CH2)n-0-NH2其中R为甲基，n为3且N为约5，000MW。PEG-hGH随后经稀释于适当缓冲液中以进行立即纯化和分析。实例3与由通过酰胺键与PEG键联的羟胺基组成的PEG接合。具有以下结构的PEG试剂是使用实例3中所述的程序与含酮非天然编码氨基酸偶MilR-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-0-NH2其中R为甲基，n二4且N为约20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。实例4本实例详述将两种不同非天然编码氨基酸引入hGH多肽中。本实例展示用于产生结合有在两个位置上包括酮官能团的非天然编码氨基酸的hGH多肽的方法。除抑制密码子是在核酸内的两个不同位点处引入之外，如本文中所述来制备hGH多肽。实例5本实例详述hGH多肽与含酰肼PEG的接合和随后的原位还原。结合有含羰基氨基酸的hGH多肽是根据实例2和3中所述的程序来制备。一旦经修饰，具有以下结构的含酰肼PEG就与hGH多肽接合R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-X-NH-NH2其中R为甲基，n=2且N-10,000MW且X为羰基(C-O)。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化hGH在介于0.1-10mg/mL之间溶解于25mMMES(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH6.0、25mMHepes(SigmaChemical,St.Louis，MO)pH7.0或10mM乙酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH4.5中，其与1至100倍过量的含酰肼PEG反应，且通过添加储备液1MNaCNBH3(SigmaChemical,St.Louis，MO)原位还原相应腙，将其溶解于H20中至最终浓度为10-50mM。在黑暗中在4"C至室温下进行反应18-24小时。通过添加约pH7.6的1MTris(SigmaChemical,St.Louis,MO)至最终Tris浓度为50mM来终止反应或将反应稀释于适当缓冲液中以进行立即纯化。实例6本实例详述将含炔氨基酸引入hGH多肽中以及用mPEG-叠氮化物进行衍生。所选残基各自经以下非天然编码氨基酸取代<formula>formulaseeoriginaldocumentpage95</formula>将含有炔丙基酪氨酸的hGH多肽表达于荧光假单胞菌中且使用本文中所述的条件纯化。将含有炔丙基-酪氨酸的经纯化hGH在介于0.1-10mg/mL的浓度下溶解于PB缓冲液(lOOmM磷酸钠，0.15MNaCl，pH=8)中且向反应混合物中添加10至1000倍过量的含叠氮基PEG。随后将催化量的CuS04和铜丝添加到反应混合物中。在混合物经培育(包含但不限于在室温或37'C下约4小时，或在4'C下整夜)后，添加H20且将混合物经透析膜过滤。可通过(包含但不限于)本文中所述的类似程序来对样品分析PEG的添加。在本实例中，PEG将具有以下结构R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-N3其中R为甲基，n为4且N为10，000MW。实例7本实例详述hGH多肽中的大疏水性氨基酸经炔丙基酪氨酸的取代。在hGH的以下区域1-5(N末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋))、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C末端)中的一个内所存在的Phe、Trp或Tyr残基是经如实例7中所述的以下非天然编码氨基酸取代H2N,、C02H一旦经修饰，PEG就连接到包括含炔氨基酸的hGH多肽变体上。PEG将具有以下结构Me-PEG(N)-0-(CH2)2-N3且偶合程序将遵循实例7中的程序。这个过程会产生hGH多肽变体，其包括大致与一种天然存在的大疏水性氨基酸等比容的非天然编码氨基酸且在多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰。实例8本实例详述由一个或一个以上PEG键联剂分隔的hGH多肽同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体的产生。在实例7中产生的含炔hGH多肽变体与以下形式的双官能PEG衍生物反应N3-(CH2)n-C(0)-NH-(CH2)2-0-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(OHCH2)n-N3其中n为4且PEG具有约5,000的平均MW,以产生其中两个hGH分子由PEG物理隔开的相应hGH多肽同二聚体。hGH多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合以形成异二聚体、同多聚体或异多聚体。将按照实例7和实例3中进行偶合、纯化和分析。实例9本实例详述糖部分与hGH多肽的偶合。hGH的一个残基经实例3中所述的以下非天然编码氨基酸取代。H2N、C02H一旦经修饰，包括含羰基氨基酸的hGH多肽变体就与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的P-键联氨氧基类似物反应。将hGH多肽变体U0mg/mL)与氨氧基糖(21mM)混合于lOOmM水性乙酸钠缓冲液(pH5.5)中且在37'C下培育7小时至26小时。通过在周围温度下将糖-接合hGH多肽(5mg/mL)与UDP-半乳糖(16mM)和卩-l，4-半乳糖基转移酶(0.4单位/毫升)在150mMHEPES缓冲液(pH7.4)中培育48小时而将第二种糖与第一种糖酶促偶合(Schanbacher等人，《/.5fo/.C/jew.1970，245,5057-5061)。实例10其中hGH分子是直接键联的hGH多肽同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体的产生。包括含炔氨基酸的hGH多肽变体可与包括含叠氮基氨基酸的另一种hGH多肽变体直接偶合，其各自包括在(但不限于)实例IO中所述位点处的非天然编码氨基酸取代。此会产生其中两个hGH多肽变体在位点II结合界面处物理连接的相应hGH多肽同二聚体。hGH多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合以形成异二聚体、同多聚体或异多聚体。按照实例3、实例6和实例7中进行偶合、纯化和分析。实例11PEG-OH+Br-(CH2)n-OCR，+PEG-0-(CH2)n-CsCR，AB聚烷撑二醇(P-OH)与垸基卤化物(A)反应以形成醚(B)。在这些化合物中，n为1至9的整数且R'可为直链或支链、饱和或不饱和CI至C20烷基或杂烷基。R'也可为C3至C7饱和或不饱和环状烷基或环状杂烷基、经取代或未经取代芳基或杂芳基，或经取代或未经取代烷芳基(烷基为C1至C20饱和或不饱和烷基)或杂垸芳基。通常，PEG-OH为具有800至40,000道尔顿(Da)的分子量的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。实例12mPEG-OH+Br-CH2-feCHmPEG-0-CH2-CsCH将具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa;2.0g，O.lmmol，Sunbio)用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理。随后将呈溶解于二甲苯(0.56mL，5mmol，50当量，Aldrich)中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液和催化量的KI添加到溶液中且将所得混合物加热至回流历时2小时。随后添加水(lmL)且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2C12(25mL)且将有机层分离，经无水Na2S04干燥，且将体积縮减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。将所得沉淀物收集，用若千份冷乙醚洗涤且干燥以得到炔丙基-O-PEG。实例13mPEG-OH+Br-(CH2)3-OCH>mPEG-0-(CH2)3-OCH将具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa;2.0g，0.1mmol，Sunbio)用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理。随后将50当量的5-溴-l-戊炔(0.53mL，5mmo1，Aldrich)和催化量的KI添加到混合物中。将所得混合物加热至回流历时16小时。随后添加水(lmL)且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2C12(25mL)且将有机层分离，经无水Na2S04干燥，且将体积縮减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。将所得沉淀物收集，用若干份冷乙醚洗涤且干燥以得到相应炔。5-氯-l-戊炔可用于类似反应中。实例14(1)/n-HOCH2C6H40H+NaOH+Br-CH2-CsCH+w-HOCH2C6H40-CH2-CsCH(2)w-HOCH2C6H40-CH2-CsCH+MsCl+N(Et)3+w-MsOCH2C6H40-CH2-CsCH(3)m-MsOCH2C6H40-CHrCsCH+LiBr7n-Br-CH2C6H40-CH2-CsCH(4)mPEG-OH+w-Br-CH2C6H40-CH2-CsCH^mPEG-0-CH2-C6H40-CH2-OCH向3-羟基苄醇(2.4g，20mmol)于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中首先添加粉末状氢氧化钠(1.5g,37.5mmol)且随后添加呈溶解于二甲苯(3.36mL,30mmo1)中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液。将反应混合物在回流下加热6小时。向混合物中添加10%柠檬酸(2.5mL)且在真空下移除溶剂。将残余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且将经合并有机层用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，经MgS04干燥且浓縮以得到3-炔丙基氧基节醇。在0。C下将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmo1)和三乙胺(2.8mL，20mmol)添加到化合物3(2.0g，ll.Ommol)于CH2C12中的溶液中，且将反应置于冰箱中16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中且添加LiBr(2.0g,23.0mmo1)。将反应混合物加热至回流历时1小时且随后冷却到室温。向混合物中添加水(2.5mL)且在真空下移除溶剂。将残余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且将经合并有机层用饱和NaCl溶液U0mL)洗涤，经无水Na2S04干燥且浓縮以得到所需溴化物。将mPEG-OH20kDa(l.Og，0.05mmol，Sunbio)溶解于THF(20mL)中且将溶液在冰浴中冷却。在强烈搅拌下经一段若干分钟的时期添加NaH(6mg，0.25mmol)，接着添加上文获得的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量的KI。移除冷却浴且将所得混合物加热至回流历时12小时。向混合物中添加水(1.0mL)且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2C12(25mL)且将有机层分离，经无水Na2S04干燥，且将体积縮减到约2mL。逐滴添加到醚溶液(150mL)中产生白色沉淀物，将其收集得到PEG衍生物。实例15mPEG-NH2+X-C(0)-(CH2)n-feCR，今mPEG-NH-C(0)-(CH2)n-CsCR，如上所示，也可通过将含有末端官能团的聚乙二醇聚合物与含有炔官能团的反应性分子偶合来获得末端含炔的聚乙二醇聚合物。n介于1与10之间。R'可为H或C1至C4小烷基。实例16(1)H02C-(CH2)2-CsCH+NHS+DC。NHSO-C(0)-(CH2)2-CsCH(2)mPEG-NH2+NHSO-C(0)-(CH2)2-CsCHmPEG-NH-C(0)-(CH2)2-OCH将4-戊炔酸(2.943g,3.0mmol)溶解于CH2C12(25mL)中。添加N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g,3.3mmol)和DCC(4.66g,3.0mmol)且在室温下将溶液搅拌整夜。所得粗NHS酯7未经进一步纯化即用于下个反应中。将具有5,000Da的分子量的mPEG-NH2(mPEG-NH2,1g，Sunbio)溶解于THF(50mL)中且将混合物冷却到4。C。在强烈搅拌下逐份添加NHS酯7(400mg，0.4mmol)。将混合物搅拌3小时，同时温至室温。随后添加水(2mL)且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2C12(50mL)且将有机层分离，经无水Na2S04干燥，且将体积縮减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚U50mL)中。将所得沉淀物收集且在真空中干燥。实例17本实例表示聚乙二醇的甲垸磺酰基酯(其也可被称作聚乙二醇的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯)的制备。可通过类似程序来制备相应甲苯磺酸酯和卤化物。mPEG-OH+CH3S02C1+N(Et)3mPEG-0-S02CH3今mPEG-N3在氮气下将于150mL甲苯中的mPEG-OH(MW=3,400，25g,10mmol)共沸蒸馏2小时且将溶液冷却至室温。将40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺(15mmol)添加到溶液中。将溶液在冰浴中冷却且逐滴添加1.2mL经蒸馏甲烷磺酰氯(15mmol)。在氮气下在室温下将溶液搅拌整夜，且通过添加2mL无水乙醇来中止反应。将混合物在真空下蒸发以移除溶剂(主要是除甲苯之外的溶剂)，过滤，再次真空浓縮且随后沉淀于100mL乙醚中。将滤液用若干份冷乙醚洗涤且在真空下干燥以得到甲磺酸酯。将甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75mlTHF中且将溶液冷却到4'C。向冷却溶液中添加叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下将反应加热至回流历时2小时。随后蒸发溶剂且用CH2Cl2(50mL)稀释残余物。将有机馏分用NaCl溶液洗涤且经无水MgSO4干燥。将体积縮减至20ml且通过添加到150ml冷无水乙醚中来沉淀产物。实例18(1)N3-C6H4-C02HN3-C6H4CH2OH(2)N3-C6H4CH2OHBr-CH2-C6H4-N3(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3mPEG-0-CH2-C6H4-N3可使用美国专利第5,998,595号中所述的方法来制备4-叠氮基苄醇，所述文献是以引用的方式并入本文中。在0。C下将甲垸磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)添加到4-叠氮基苄醇(1.75g，11.0mmol)于CH2C12中的溶液中且将反应置于冰箱中16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中且添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热至回流历时1小时且随后冷却至室温。向混合物中添加水(2.5mL)且在真空下移除溶剂。将残余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且将经合并有机层用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，经无水Na2S04干燥且浓縮以得到所需溴化物。将mPEG-OH20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理且向混合物中添加溴化物(3.32g，15mmol)和催化量的KI。将所得混合物加热至回流历时12小时。将水(1.0mL)添加到混合物中且在真空下移除溶剂。向残余物中添加CH2C12(25mL)且将有机层分离，经无水Na2S04干燥，且将体积缩减到约2mL。逐滴添加到乙醚溶液(150mL)中产生沉淀物，将其收集得到mPEG-0-CH2-C6H4-N3。实例19NH2-PEG-0-CH2CH2C02H+N3-CH2CH2C02-NHS+N3-CH2CH2-C(0)NH-PEG-0-CH2CH2C02H将NH2-PEG-0-CH2CH2C02H(MW3,400Da，2.0g)溶解于NaHC03饱和水溶液(10mL)中且将溶液冷却到0'C。在强烈搅拌下添加3-叠氮基-l-N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(5当量)。3小时后，添加20mLH2O且在室温下将混合物另外搅拌45分钟。用0.5NH2S04将pH值调节到3且添加NaCl至浓度为约15重量％。将反应混合物用CH2C12(lOOmL")萃取，经Na2S04干燥且浓縮。在用冷乙醚沉淀后，将产物通过过滤收集且在真空下干燥以得到(o-羧基-叠氮化物PEG衍生物。实例20mPEG-OMs+HOCLi+mPEG-0-CH2-CH2-OC-H在强烈搅拌下向如所属
技术领域：
中已知所制备且冷却到-78'C的乙炔锂(4当量)于THF中的溶液中逐滴添加溶解于THF中的mPEG-OMs溶液。3小时后，使反应温至室温且通过添加1mL丁醇中止反应。随后添加20mLH20且在室温下将混合物另外搅拌45分钟。用0.5NH2S04将pH值调节到3且添加NaCl至浓度为约15重量％。将反应混合物用CH2Cl2(100mLx3)萃取，经Na2S04干燥且浓縮。在用冷乙醚沉淀后，将产物通过过滤收集且在真空下干燥以得到l-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。实例21使用以下文献中描述的方法将含叠氮基氨基酸和含乙炔氨基酸位点选择性地并入蛋白质中L.Wang等人，(2001),Science292:498-500:J.W.Chin等人.Science301:964-7(2003);J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002)，ChemBioChem11:1135-1137;J.W.Chin等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;和L.Wang和P.G.Schultz,(2002)，Chem.Comm.l-10。一旦并入氨基酸，就在37。C下在2mMPEG衍生物、1mMCuS04和约1mg铜丝存在的情况下用磷酸盐缓冲液(PB)(pH8)中的0.01mM蛋白质进行环加成反应4小时。实例22本实例描述对乙酰基-D,L-苯丙氨酸(pAF)和间-PEG-羟胺衍生物的合成。使用Zhang,Z.,Smith,B.A.C，Wang,L.，Brock，A.，Cho，C.和Schultz,P.G"Biochemistry,(2003)42，6735-6746中先前所述的程序来合成外消旋pAF。为合成间-PEG-羟胺衍生物，完成以下程序。向在室温(RT)下搅拌1小时的(N-t-Boc-氨氧基)乙酸(0.382g,2.0mmol)和1,3-二异丙基碳化二酰亚胺(0.16mL，l.Ommol)于二氯甲烷(DCM,70mL)中的溶液中添加甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH2,7.5g，0.25mmol，Mt.30K,来自BioVectra)和二异丙基乙胺(0.1mL，0.5mmol)。将反应在室温下搅拌48小时，且随后浓縮至约100mL。将混合物逐滴添加到冷乙醚(800mL)中。经t-Boc保护的产物沉淀出且通过过滤收集，用乙醚(3x100mL)洗涤。通过再溶解于DCM(lOOmL)中且于乙醚(800mL)中沉淀两次将其进一步纯化。将产物在真空下干燥得到7.2g(96%),其由NMR和Nihydrin试验得以证实。在50%TFA/DCM(40mL)中在(TC下进行上文获得的经保护产物(7.0g)的去叔丁氧羰基作用1小时且随后在室温下进行1.5小时。在真空中移除大多数TFA之后，通过向残余物中添加于二噁烷(lmL)中的4NHC1而将羟胺衍生物的TFA盐转化为HC1盐。将沉淀物溶解于DCM(50mL)中且再沉淀于乙醚(800mL)中。将最终产物(6.8g,97%)通过过滤收集，用乙醚(3x100mL)洗涤，在真空中干燥，储存在氮下。使用相同程序来合成其它PEG(5K、20K)羟胺衍生物。实例23本实例描述用于包括非天然氨基酸的hGH多肽的表达和纯化方法。宿主细胞已经正交tRNA、正交氨基酰基tRNA合成酶和hGH构筑体转化。使来自经转化DH10B(fis3)细胞的冷冻甘油储备液的小刺首先在37。C下在含有100pg/ml氨比西林(ampicillin)的2ml成分明确培养基(补充有亮氨酸、异亮氨酸、痕量金属和维生素的葡萄糖基本培养基)中生长。当ODs(K)达到2-5时，将60pl转移到含有100pg/ml氨比西林的60ml新鲜的成分明确培养基中且在37。C下再次生长至OD600为2-5。将50ml培养物转移到于5升发酵罐(SartoriusBBI)中的含有100ng/ml氨比西林的2升成分明确培养基中。用碳酸钾控制发酵罐pH值为pH6.9，温度为37'C，空气流动速率为5lpm，且用聚亚烷基消泡剂KFOF119(Lubrizol)起泡。自动调节搅拌器速度以保持溶解氧含量230%,且如果搅拌器速度达到其最大值，那么使用纯氧来补充空气喷射。在37'C下历时8小时后，以呈指数增加的速率向培养物中馈入成分明确培养基的50x浓縮物以保持比生长速率为0.15/小时。当OD6oo达到约100时，添加对乙酰基-苯丙氨酸的外消旋混合物至最终浓度为3.3mM，且将温度降低至28'C。在0.75小时后，添加异丙基-b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷至最终浓度为0.25mM。使细胞在28'C下另外生长8小时，将其造粒且冷冻在-80'C下直至进一步处理。His标记突变hGH蛋白是通过由Invitrogen的使用手册提供的标准His标记蛋白纯化程序使用ProBond镍螯合树脂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，接着由阴离子交换柱进行纯化。将经纯化hGH浓縮为8mg/ml且将缓冲液交换为反应缓冲液(20mM乙酸钠，150mMNaCl，1mMEDTA，pH4.0)。以PEG:hGH为20:1的摩尔比率将MPEG-氧基胺粉末添加到hGH溶液中。在轻微震荡下在28'C下进行反应2天。通过阴离子交换柱自未反应的PEG和hGH纯化PEG-hGH。在进入动物实验之前通过三种检定来评估各聚乙二醇化突变hGH的品质。通过在非还原性条件下用MESSDS电泳缓冲液进行4%-12%丙烯酰胺NuPAGEBis-Tris凝胶(Invitrogen)电泳来检测PEG-hGH的纯度。用考马斯蓝将凝胶染色。根据密度测定扫描，PEG-hGH条带大于95%纯。使用来自CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)的KTAZ试剂盒，通过动力学LAL检定来测试各PEG-hGH中的内毒素含量，且其小于每剂量5EU。用IM-9pSTAT5生物检定(在实例2中提及)来评估PEG-hGH的生物活性，且ECso值小于15nM。实例24本实例描述测量聚乙二醇化hGH的活体外和活体内活性的方法。细胞结合检定在0'C下，在不存在或存在各种浓度(体积10jil)的未经标记GH、hGH或GM-CSF的情况下且在^I-GH(约100,000cpm或1ng)存在的情况下，在PBS/1%BSA(100pi)中将细胞(3xl06)双份培育90分钟(总体积120W)。随后将细胞再悬浮且于350^1塑料离心管中于200pl冰冷FCS上分层且离心(1000g;l分钟)。通过切断管的末端来收集丸粒且以Y计数器(Packard)对丸粒和上层清液分别计数。特异性结合(cpm)经确定为在不存在竞争试剂的情况下的总结合(复本的平均值)减去在IOO倍过量的未标记GH存在的情况下的结合(cpm)(非特异性结合)。对所用各细胞类型测量非特异性结合。实验是使用相同^I-GH制剂不在同一天进行且应显示内部一致性。"I-GH证实与产生GH受体的细胞的结合。所述结合是以剂量依赖性方式受到未经标记天然GH或hGH抑制，但并不受GM-CSF或其它阴性对照物抑制。hGH竞争结合天然125I-GH的能力与天然GH类似，表明受体同样良好地识别两种形式。序列<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>SEQID号10注释p-NHrPheRS(2)tRNA或RS/~NH2-PheRS(3a)RSp~NHrPheRS(3b)RSO-烯丙基-TyrRS(l)RS序列ATGGAACTTATAGAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATTQTTCTCATTATTATGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACAT6TTA6CAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTT6TTT6TATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTQATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAQAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAQAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTQAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTAATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTTCGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAOGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTOATTTACAAAATaCTGGATTTGATATAATTATATTGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGSGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTACGTTCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAQAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAAATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGQAAGAGTTAAQAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCT6CTTATATAGGTTTT6AAi:CAA6TGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAQATGATTOATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATATTGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTArAACAAAAAAX3TTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAG0CAAAATATGTTTATG6AA6TCCTTTCCAGCTTCUVrAAGGftTTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAaCAAGAAOGAGTATOGAACTTATAaAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTOAAGTTATCTATCCAATAATGCA6GTTAATCAGAGTCATTATGATGGCGTTGATGTT0CAGTT0GAGGGATGGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATG旭TTCTTCAAAAGTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGOGCTAAGATAAAGAAAGCCCAGCTGQAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGOAGATAGCTAAATACTATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAaCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTA<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>tRNA或RS注释用于将间甲氧基苯丙氨酸并入蛋白质中的突变合成酶((Me1-8)RS用于将间甲氧基苯丙氨酸并入蛋白质中的突变合成酶((Me2-7)RS用于将间甲氧基苯丙氨酸并入蛋白质中的突变合成酶(OMe4—1)RS用于将间甲氧基苯丙氨酸并入蛋白质中的突变合成酶(OMe4-8)RS200680019580.2<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>权利要求1.一种组合物，其包括假单胞菌种或自其获得的菌株中的翻译系统，所述翻译系统包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS在所述翻译系统中优先使具有至少一个非天然氨基酸的所述O-tRNA氨基酰基化且所述O-tRNA识别至少一个选择密码子。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述翻译系统包括自假单胞菌种或其菌株获得的活体外翻译系统。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述翻译系统包括假单胞菌种或其菌株的细胞提取物。4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述0-tRNA包括包含选自由SEQIDN0:l-3组成的群组的聚核苷酸序列和其互补聚核苷酸序列的核酸。5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述O-RS包括选自由以下多肽组成的群组的多肽包括选自由SEQIDNO:4-34组成的群组的氨基酸序列的多肽；由包括选自由SEQIDNO:35-66组成的群组的聚核苷酸序列和其互补聚核苷酸序列的核酸编码的多肽。6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一个非天然氨基酸选自由以下各物组成的群组O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-0-乙酰基-GlcNAc(3-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸；酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；经垸基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤基、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸酯、硼(III)酸酯、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸，或其任何组合；具有可光活化交联剂的氨基酸；自旋标记氨基酸；荧光氨基酸；具有新颖官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；结合金属的氨基酸；含金属氨基酸；放射性氨基酸；光笼蔽和/或可光异构化氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮基氨基酸；包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸；经重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基酸；具有延长侧链的氨基酸；含有有毒基团的氨基酸；经糖取代的氨基酸，例如，经糖取代的丝氨酸等等；碳键联含糖氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含a-羟基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；a，a二取代氨基酸；p-氨基酸；以及除脯氨酸之外的环状氨基酸。7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一个选择密码子为无义密码子、稀有密码子或四碱基密码子。8.根据权利要求l所述的组合物，其中所述至少一个选择密码子为琥珀密码子。9.一种用于在假单胞菌翻译系统中产生至少一种包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质的方法，所述方法包括向所述翻译系统提供至少一种包括至少一个选择密码子的核酸，其中所述核酸编码所述至少一种蛋白质；向所述翻译系统提供正交tRNA(O-tRNA)，其中所述O-tRNA在所述翻译系统中起作用且其中所述O-tRNA识别所述至少一个选择密码子；向所述翻译系统提供正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS在所述翻译系统中优先使具有所述至少一个非天然氨基酸的所述O-tRNA氨基酰基化；且向所述翻译系统提供所述至少一个非天然氨基酸，从而在所述翻译系统中产生包括所述至少一个非天然氨基酸的所述至少一种蛋白质。10.—种由权利要求9的方法产生的包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质，其中所述蛋白质是以细胞依赖性方式经处理和修饰。11.根据权利要求IO所述的蛋白质，其中所述蛋白质与选自由以下各物组成的群组的治疗性蛋白质同源细胞因子、生长因子、生长因子受体、干扰素、白细胞介素、炎性分子、致癌基因产物、肽激素、信号转导分子、类固醇激素受体、转录活化因子、转录抑制因子、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、人类生长激素、上皮中性粒细胞活化肽-78、GROa/MGSA、GRO卩、GRO、MIP-la、MIP-1卩、MCP-1、肝细胞生长因子、类胰岛素生长因子、白血病抑制因子、抑瘤素M、PD-ECSF、PDGF、多效生长因子、SCF、c-kit配体、VEGF、G-CSF、IL-1、IL-2、IL-8、IGF-I、IGF-II、FGF(成纤维细胞生长因子)、PDGF、TNF、TGF-a、TGF-p、EGF(表皮生长因子)、KGF(角质化细胞生长因子)、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明质素/CD44、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。12.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述蛋白质与选自由以下各物组成的群组的治疗性蛋白质同源(X-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白(Apolipoprotein)、载脂蛋白(Apoprotein)、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C化学趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC化学趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-la、单核细胞炎性蛋白-lp、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、C-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、GROa/MGSA、GROp、GRO、MIP-la、MIP-lp、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、刺猬蛋白(Hedgehogprotein)、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素、IFN-a、IFN-p、IFN-y、白细胞介素、IL-1、IL陽2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12、角质化细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子(Neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、骨形成蛋白、致癌基因产物、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人类生长激素、多效生长因子、蛋白A、蛋白G、致热外毒素A、B或C、松弛素、肾素、SCF、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素al、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、TGF-a、TGF-(3、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子a、肿瘤坏死因子P、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。13.—种假单胞菌细胞，其包括(a)用于自所述细胞内的一种或一种以上碳源产生非天然氨基酸的生物合成路径系统；以及(b)包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统，其中所述O-RS优先使具有所述非天然氨基酸的所述O-tRNA氨基酰基化且所述O-tRNA回应选择密码子而将所述非天然氨基酸并入蛋白质中。14.根据权利要求13所述的细胞，其中所述选择密码子包括无义密码子、四碱基密码子、赭石密码子、蛋白石密码子或琥珀密码子。15.根据权利要求13所述的细胞，其中所述生物合成路径系统产生足够并入多肽中的量的非天然编码氨基酸。全文摘要本发明提供通过假单胞菌种(Pseudomonasspecies)和自其获得的菌株将非天然编码氨基酸在活体内并入多肽中的方法和组合物。本发明也提供包含由假单胞菌种和自其获得的菌株产生的具有非天然编码氨基酸的蛋白质的组合物。文档编号C12N1/21GK101238143SQ200680019580公开日2008年8月6日申请日期2006年6月2日优先权日2005年6月3日发明者丘霍松申请人:Ambrx公司