专利名称：：一种长期保藏微生物菌种的方法
技术领域：
：本发明涉及微生物菌种保藏方法，主要涉及酵母菌、芽胞杆菌、曲霉菌种的长期保藏方法。
背景技术：
：目前微生物菌种通常采用斜面定期移植保藏法、液体石蜡保藏法、冷冻干燥、液氮超低温保藏、-8(TC低温冷冻保藏。低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变，延长菌种保藏时间的目的。斜面定期移植保藏法通常是釆用在带棉塞的玻璃试管内，用少于l/3管的无菌的固体培养基摆成斜面，中央划线的接种方法，在28-30。C培养2-3天后，置于冰箱内4。C保藏，这种方法是用于微生物菌种的主要保藏方法，优点是操作简单，缺点是斜面培养基与空气接触面大，脱水较快，一般在半年内就会干缩；棉塞容易吸水变潮，容易导致菌种染菌；保藏温度较高，酵母菌种仍有一定的代谢活动，可进行繁殖，为了防止菌种死亡，通常3-4个月就应该传代转管；加大了菌种保藏的工作量；由于菌种传代频繁，菌种变异频率较高，需要对菌种定期的分离复壮，给菌种的保藏带来较高的技术要求和较大的工作量。液体石蜡保藏法是定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡覆盖下，菌种的生物代谢受到抑制，细胞老化被推迟。此方法可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，也可防止因培养基的水分蒸发而引起的菌体死亡，达到延长菌种保藏时间的目的。该方法优点是菌种保藏时间长，一般2-10年不等。缺点是只适应于不能分解液体石蜡的微生物菌种的保藏；菌种保藏时必须用试管架竖直摆放，保藏占用的空间较大，保藏场所应保持干燥，防止棉塞污染；整个操作比较繁瑣。冷冻干燥法是将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。氮超低温保藏是将菌种保藏在-196C的液态氮，或在-15(TC的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-13(TC以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。-80。C低温冷冻保藏是将菌种保藏在-8(TC冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。上述三种方法都能较好地保藏微生物菌种，保藏周期长，变异频率低，缺点是操作复杂，技术含量高，设备投入高，运行成本高，只适合专业保藏机构使用，不适合生产企业使用。
发明内容本发明目的是针对上述保藏方法所存在的缺陷，提供一种适用于生产企业，保藏时间长又操作简单实用、菌种质量稳定可靠，保藏成本低的微生物菌种保藏方法。本发明所述微生物菌种保藏方法如下1、培养基的制备培养基的重量配比玉米面40-70%，麸皮5-30%，豆粕粉15_35%,料水配比为1:0.8-1.2。2、培养基分装与灭菌按上述配量将培养基物料与水混合，分装于试管中，通常试管中装量为1/3-2/3，塞好棉塞，高压灭菌，1.0-1.2atm，30-45min,取出趁热摇散，冷却备用；3、接种与培养在无菌条件下接入1-2环菌种(0.1-0.2ml)，用接种针搅匀，松散水平放入培养箱中26-3(TC培养2-3天。4、干燥与保藏在40-45匸条件下干燥2-3天，使物料水份控制在<6%,用牛皮纸包好，放至冰箱中l-4t:冷藏或-16~-2(TC冷冻保存，保藏期达到35年。5、菌种复苏方法将所保藏试管中的物料颗粒，在无菌条件下转入到新鲜斜面培养基上数粒,放到培养箱中进行适温培养即可。本发明优选的培养基重量配比为玉米面50~60%,麸皮15~20%，豆粕粉25~30°/。，料水配比1:0.g~1.0。本发明首先选择适当的培养基及培养条件让微生物在培养物中生长，然后在较温和的条件下将菌种脱水干燥，由于菌种细胞中含水量很低，可放入冰箱中冷藏或冷冻保藏。此方法是将斜面试管保藏、冷冻干燥保藏、和低温保藏结合起来的一种保藏方法。本法保藏微生物菌种，4'C冷藏可保藏3-4年，-18°C冷冻可保藏4-5年。此方法设备投入少，在普通的冰箱就能实现菌种长期保藏，实用性强，具有操作简单、稳定可靠、成本低廉、保藏期长的特点。具体实施方式实施例1培养基的配制玉米面60%，麸皮15%，豆粕粉25%，料水比1:0.85。将原料按上述比例混合，加入定量的水，分装于试管中，通常试管中装量为1/3,塞好棉塞，高压灭菌，1.2atm，3045min，取出趁热摇散，冷却备用。在无菌条件下接入1-2环菌种(0.l-0.2ml),所保藏的菌种如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>用接种针搅匀，松散水平放入培养箱中28-3(TC培养2-3天。在40-45。C条件下干燥2-3天，检测试管中菌种的细胞数。用牛皮纸包好,放至冰箱中4'C冷藏保存和-18'C冷冻保存。菌种保藏初始细胞数测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>-18'C冷冻保藏结果-181:条件下不同年限菌种保藏存活率(％)单位年<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于该保藏方法如下a)培养基的重量配比玉米面40~70%，麸皮5~30%,豆粕粉15~35%,料水配比1:0.8-1.2;b)培养基分装灭菌按上述配量培养基物料与水混合，分装入试管，高压蒸汽灭菌l,2atm，3045min，冷却备用；c)接种培养于无菌条件下接入1~2环菌种(0.1~0.2ml)，于培养箱中2630。C培养23天；d)干燥保藏在4045。C条件下干燥2~3天，使水份控制在<6%，包装置于冰箱中于14'C或-16'C-20'C保藏期达到3~5年。2、按照权利要求l所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征是用该方法保藏的菌种有酵母菌、芽胞杆菌、曲霉菌种。3、按照树种要求l所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征是培养基的重量配比选择为玉米面50~60%，麸皮15~20%，豆粕粉25~30%，料水配比1:0.g~1.0。全文摘要本发明涉及微生物菌种保藏方法，主要涉及酵母菌、芽胞杆菌、曲霉菌种的长期保藏方法。培养基的重量配比玉米面40～70％，麸皮5～30％，豆粕粉15～35％，料水配比1∶0.8～1.2；培养基分装灭菌按上述配量培养基物料与水混合，分装入试管，高压蒸汽灭菌1.2atm，30～45min，冷却备用；接种培养于无菌条件下接入1～2环菌种(0.1～0.2ml)，于培养箱中26～30℃培养2～3天；干燥保藏在40～45℃条件下干燥2～3天，使水份控制在≤6％，包装置于冰箱中于1～4℃或-16℃～-20℃保藏期达到3～5年。此方法设备投入少，在普通的冰箱就能实现菌种长期保藏，实用性强，具有操作简单、稳定可靠、成本低廉、保藏期长的特点。文档编号C12N1/00GK101121919SQ20071001230公开日2008年2月13日申请日期2007年7月27日优先权日2007年7月27日发明者张庆华,王艳华,赵新海申请人:辽宁省微生物科学研究院