专利名称：由玉米浆发酵-酶催化法合成7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的制作方法
技术领域：
本发明属于生物酶工程技术领域，涉及制备和提纯7-氨基-3-脱乙酰氧基头 孢垸酸(7-ADCA)的生物合成方法。
背景技术：
头孢菌素类抗生素是P-内酰胺抗生素的重要一种。起初，是由产黄支顶孢 (Acremonium chrysogenum)天然产生。近年来，主要通过人工合成法来获取。 7_氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是合成头孢菌素类抗生素的关键母核， 通过人工合成方法来制取7-ADCA，再进一步合成头孢氨苄、头孢拉定、头孢克 罗、头孢他美酯和头孢羟氨苄等多种头孢素类抗生素。7-ADCA的合成方法主要 有化学合成法、半合成法和生物合成法。
目前，化学合成和半合成法仍是合成7-ADCA主要方法EP0169144 (1986) 介绍，以青霉素G钾为原料，经过氧化、酰化、扩环、水解和裂解等反应过程 而制得7-ADCA。 CN1201795A介绍，以青霉素钾盐为原料，经氧化、硅酯化、环 裂、分子重排、环合、水解和再裂解等反应合成7-ADCA。由于化学合成法的步 骤复杂、反应条件要求高，特别是裂解等过程采用了较高的温度，使得产品质 量差和成本高，也带来环保的问题，因此，人们又采用了化学与生物合成相结 合的半合成法。将化学合成的裂解等反应过程改为酶催化法，这样可以使化学 合成中的一些不利反应得到一定程度的改进。如张玉祥等，"7-氨基去乙酰氧基 头孢烷酸的合成研究"(中国抗生素杂志，2000， 25巻，178-180);曲红梅等， "从青霉素G生产7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸"(中国医药工业杂志，2000， 8 巻)。
生物合成法是近年发展起来的制备7-ADCA的方法，又有两重方法。其一， 是以青霉素G钾为原料，使用扩环酶和酰化酶催化法制取7-ADCA，如，CN1807581A 介绍，产黄青霉菌及其在生产7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的应用。另一种是 发酵法，以青霉素为原料，经过发酵法实母A扩环，经酰基转移酶裂解等过程制 备7-ADCA。如，CN1840687A介绍，将耷霉素、水、发酵酶、营养液等，放在一起发酵，用有机溶剂萃取，再经裂解、脱色和结晶等过程制取7-ADCA。CN1840687A 介绍，7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸的发酵直通生产方法，是以青霉素为原料， 与水、发酵消泡剂、发酵酶、营养液一起发酵，再经萃取、裂解、脱色和结晶 等过程而制取7-ADCA。各种方法几乎都是用青霉素G钾为原料，采用各种方法 合成7-ADCA。
如今，化学法合成7-ADCA,已经逐步被淘汰。半合成法、生物合成法已经被 普遍采用，特别是发酵法是被普遍看好的新方法。国内也已经引进了半合成法 和生物合成法，还都是以青霉素G钾为原料，生产成本比较高，同时，关键的 固定化酶等还主要依赖进口，而发酵法的工艺技术还没有达到工业化的水平。
在现代化生物工程领域中，膜分离技术的应用越来越受到关注，因为膜分离 设备，可以很好地将大分子和小分子物质分离开，而且作为催化剂的大分子物 质(酶分子)和细胞的活性损失较小，可以进行反复使用。膜分离技术还可以 应用到酶催化反应后的废水处理，可以用很低的成本，达到很好的处理效果。 膜分离技术操作简单，成本低，容易实现连续化操作。这为发酵法制备7-ADCA 提供了强有力的援助，说明该技术的工业化应用时机己经成熟。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵-酶催化法合成7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢 烷酸的方法以玉米浆为原料，用带棒链霉菌(Str印tomyces clavuligerus) 的扩环酶基因，对玉米浆进行菌株转化，使其在培养基中发酵，并在培养基中 加入苯乙酸，玉米浆经扩环和与苯乙酸作用后，生成苯乙酰基-7-ADCA。用乙酸 丁酯萃取发酵液，得到苯乙酰基-7-ADCA的萃取溶液。用水反萃取上述溶液，又 得到苯乙酰基-7-ADCA的水溶液。在该水溶液中加入酰基转移酶和营养液构成酶 反应培养基，在适宜的工艺条件下，苯乙酰基-7-ADCA经脱苯乙酰基侧链，而得 到7-ADCA。
采用发酵-酶催化的生物合成法，包括种子培养基的培养、发酵培养基的培 养、酶反应培养基的培养、有机溶剂萃取、水反萃取、酶催化脱酰基、萃取结 品和重结晶等过程。其中，种子培养基的培养过程，就是扩环菌的转录和发酵 过程。本发明通过下述方法实现的
1、 种子培养基的培养将带棒链霉菌(Str印tomyces clavuligerus)的 扩环酶基因，接种于种子培养基中，经调培养基的pH值，消毒后，放于旋转摇 床，控制一定的温度、转速和培养时间，即可收获种子培养基。
种子培养基的组成(g/1)为葡萄糖15 25; (NH》2S0 20~30; KH.iU 0.2-1.0;乳糖30 60; CaCO:, 5~10;玉米浆10~30;棉子粉5~20。另外，加入 0.1~0.3的发酵粉，可以获得更快的发酵速度。
带棒链霉菌与培养基的用量比例为1: 150~300;接种表达量为106~101()分 生孢子/ml;在消毒前，要严格调培养基的pH，其范围为5 6;培养温度控制在 20~30°C，最适宜温度为25 28'C;培养时间为48~72小时；旋转摇床的转速为 220转/分。
2、 发酵培养基的培养将种子培养基，接种于发酵培养基中，经调培养基 的pH值，消毒后，控制转速、培养温度和培养时间，即可收获发酵培养基。
发酵培养基的组成(g/1)为葡萄糖10 15; (NH4) 2S04 12~20; KH2P04 0.3-0.80;乳糖50-70; CaC03 6~10;玉米浆15-25;棉子粉10~20。以1: 10 在发酵液中加入15%的苯乙酸溶液。另外，加入O. 1~0.2的发酵粉，可以获得更 快的发酵速度。
种子培养基的接种量为发酵培养基的3% 8%;在消毒前，要严格调培养基 的pH，其范围为5.5 6.5;培养温度控制在22 3(TC，最适宜温度为25~27°C; 培养时间为144-192小时；转速为30转/分。
3、有机溶剂萃取发酵液收获后，调溶液pH2.3 4.6，使用有机溶剂萃取 发酵液，按照体积比有机溶剂发酵液=1: 10~20加入有机溶剂，得到含苯 乙酰基-7-ADCA的有机溶萃取溶液。萃取液可以使用活性炭脱色。所使用的 有机溶剂可以是乙酸丁酯、醋酸乙酯，或二甲垸。
4、 水反萃取以水为溶剂萃取上述有机萃取液，用水有机萃取液=5 10:
1，反萃取上述脱色后的有机萃取液。所得水相可以直接进入下一工段一酶催
化脱苯乙酰基。萃取前需要调pH7.4 8.9。所使用的碱为氢氧化钾水溶液，其 浓度为15 25%。
5、 酶反应培养基的培养和酶滟化脱苯乙酰基将上述水反萃取液，用丄5% 氨氣化评溶液，调pl16. 5 7.r〕，加入(g'/l):葡萄糖，10 20: (NH4) 2S04， 5 15; KH2P04， 0. 1 0. 7;乳糖，10 20; CaC0" 2 5;酰基转移酶，0. 1 0. 3。 在消毒前，培养基pH为6.2 6.9。将该培养基密闭，在35"C 45'C、 30转/ 分下生化反应48 72小时。
6、萃取结晶和重结晶酶催化反应液收获后，调pH2.5 5.0，用有机溶 剂萃取反应液。将有机萃取液冷却结晶，得到7-ADCA粗品，再经有机溶剂重 结晶得到7-ADCA产品。有机溶剂可以是乙酸丁酯、乙酸乙酯、二氯甲烷，其 使用量为酶催化液有机溶剂二l: 5 20。重结晶使用乙酸乙酯+石油醚，按体 积比l: 4混合使用。
具体实施例方式
实例1
种子培养基的培养将lml带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的 扩环霉株以108分生孢子/ml，接种于下列组成的种子培养基中(g/1):葡萄糖 23; (NH4) 2S04 25; KH2P04 0.7;乳糖50; CaC03 6;玉米浆10;棉子粉10; 加水100ml。在消毒前，调培养基pH为5.3。将种子培养基密闭，在25。C、 220 转/分旋转摇床振荡培养48小时。
发酵培养基的培养将培养好的种子培养基，按5%的接种量转种发酵培养 基中(g/1):葡萄糖10; (NH》2S04 16; KH2P(^ 0.5;乳糖60; CaC03 9;玉
米浆20;棉子粉15;其它为水。消毒前，调培养基pH为6.2。接种后，以l:
10在发酵液中加入15%的苯乙酸溶液，在25。C、 30转/分下培养168小时，每 隔一天补充一次蒸发掉的水。
有机溶剂萃取发酵液收获后，用过滤机除去丝菌状体，在滤液中加入乙
酸丁酯(1: 15)萃取其中的苯乙酰基-7-ADCA。所得萃取液颜色比较深，可加
入药用活性炭进行脱色。
水反萃取用8: 1的水反萃取上述脱色后的有机萃取液。所得水相可以直 接进入下一工段一酶催化脱苯乙酰基。
酶催化脱苯乙酰基将上述水反萃取液，用15%氢氧化钾溶液，调pH6.5 7.5，加入酶反应培养基中(g/1):葡萄糖16;(NH》2S〔、9; ,0+0.47; 乳糖30; CaCO, 5;酰基转移酶O. 2。消毒前，调培养基pH为6.8。在35°C 45°C、 30转/分下反应48小时。萃取结晶和重结晶待生化反应结束后，用过滤机除去酰基转移酶，在滤
液中加入乙酸丁酯(1: 25)萃取其中的7-ADCA。所得萃取液颜色比较深，可加
入药用活性炭进行脱色。将萃取液冷却结晶，得到粗品，再经重结晶得到成品
(mp. 232. 3 233. 8°C;含量99.3%;表达量5. 38g/l)。 实例2
种子培养基的培养将将带棒链霉菌(Str印tomycesclavuligerus)的扩 环霉株以109分生孢子/1111，接种于下列组成的种子培养基中(g/l):葡萄糖， 20; (NH4)2S04， 18; KH2P04， 0.5;乳糖，30; CaCO:,， 5;玉米浆，15; Pha歷media (棉子粉)，12;其它为水。在消毒前，培养基pH为5.3。将种子培养基密闭， 在27。C、 220转/分下孵育42小时。
发酵培养基的培养将上述种子培养基，按l: 18的体积比，接种到下列 组成的生产培养基中(g/l):葡萄糖，15; (NH4)2S04， 11; KH2P04， 0.6;乳糖，
23; CaCO:,， 6;玉米浆，25; Pharmamedia (棉子粉)，10;其它为水。在消毒 前，培养基pH为6.5。用将种子培养基接种后，在发酵液中加入15°/。的苯乙酸 溶液l: 15。密闭，在25'C、 30转/分下培育144小时，每隔一天补充一次蒸 发掉的水。
有机溶剂萃取发酵结束后，用过滤机除去丝菌状体，在滤液中加入乙酸 丁酯(1: 22)萃取其中的苯乙酰基-7-ADCA。所得萃取液颜色比较深，可加入 药用活性炭进行脱色。
水反萃取用10: 1的水反萃取上述脱色后的有机萃取液。所得水相可以
直接进入下一工段一酶催化脱苯乙酰基。
酶催化脱苯乙酰基将上述水反萃取液，用15%氢氧化钾溶液，调pH6.9，
加入(g/l):葡萄糖，12; (MU m， 9; KH2P04， 0.35;乳糖，10; CaCO:,， 3;
Pharmamedia (棉子粉)，5;酰基转移酶，0.3。在消毒前，培养基pH为6. 3。 将该培养基密闭，在35'C 45。C、 30转/分下生化反应528小时。
萃取结晶和重结晶待生化反应结束后，用过滤机除去酰基转移酶，在滤
液中加入乙酸丁酯(1: 20)萃取其中的7-ADCA。所得萃取液颜色比较深，可 加入药用活性炭进行脱色。将萃取液冷却结晶，得到粗品，再经重结晶得到成 品(mp. 232. 5 233.8。C;含量99.2%;表达量6. 26g/l)。
权利要求
1、一种由玉米浆发酵-酶催化法合成7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)的方法，包括(1)用带有扩环酶基因的棒状链霉菌，对玉米浆进行菌株转化，在培养基中发酵实现扩环，并与加入培养基中的苯乙酸作用，生成苯乙酰基-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸。(2)通过有机溶剂萃取和水反萃取，获得苯乙酰基-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的水溶液。(3)在水反萃取的溶液中加入乙酰转移酶，脱除侧链制得7-氨基-3-乙酰氧基头孢烷酸。(4)使用有机溶剂萃取酶催化脱酰后的水溶液，经结晶和重结晶获得7-ADCA。
2、 根据权利要求1的方法，其中(1)扩环酶来自带棒链霉菌(Str印tomyces clavuligerus)。
3、 根据权利要求1的方法，其中(2)步的有机溶剂是'.乙酸丁酯，或乙酸 乙酯，或二氯甲垸。萃取为pH2.3 4.6的酸性溶液，有机溶剂与发酵液 的体积比为h 5 15。水反萃取为pH7. 4 8. 9的碱性溶液，水与生化反 应液的体积比为10 5: 1。
4、 根据权利要求1的方法，其中(3)中乙酰转移酶为IPA-750，是通过培 养大肠杆菌基因工程菌和固定化菌。
5、 根据权利要求l的方法，其中(4)步使用的有机溶剂是乙酸丁酯，或 乙酸乙酯，或二甲垸。重结晶使用的为组合有机溶剂乙酸乙酯+石油醚，配比为1: 3 5。
全文摘要
用带有扩环酶基因的棒状链酶菌，对玉米浆进行菌株转化，使玉米浆在培养基中发酵扩环，并与加入培养基中的苯乙酸作用，生成苯乙酰基-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸。通过有机溶剂萃取和水反萃取，获得苯乙酰基-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的水溶液。在该水溶液中加入乙酰转移酶和营养成分构成酶反应培养基，并在适宜的条件下完成生化反应，脱除侧链制得7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸。
文档编号C12P33/00GK101285089SQ20071002134
公开日2008年10月15日 申请日期2007年4月9日 优先权日2007年4月9日
发明者周伟军, 周平江, 李桂根, 李维泉, 健 王, 王友志, 王圣良, 王玉成, 王理想, 王静康, 晓 胡, 红 赵, 路一飞 申请人:徐州瑞赛科技实业有限公司