专利名称：用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒，进一步涉及一种使用该种试剂盒快速检测创伤弧菌的方法。
背景技术：
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种广泛分布于海洋与盐湖中的嗜盐性革兰氏阴性致病菌。该菌是引起食源性疾病的主要病原之一，人通过进食生牡蛎等海产品经胃肠道黏膜或破损的皮肤接触海水而感染该菌，可引起原发性败血症、下肢创伤感染，出现疱性皮肤损害、皮肤淤斑坏死、蜂窝组织炎等，同时伴高热、低血压、休克，最终发展为感染性休克、多器官衰竭甚至死亡，致死率可高达70％，是食品安全和水产品进出口重要的微生物检疫对象。创伤弧菌也是鱼、虾、贝类等的重要病原菌，可引起鱼类皮肤溃烂病和败血症、养殖对虾的红腿病和烂鳃病以及贝类脓疱病等，给水产养殖业带来严重的经济损失，也是水产养殖病害检验检疫的重要对象。
以往检测创伤弧菌主要有三种办法1.生化鉴定法，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；2.酶联免疫吸附法(ELISA法)，该法具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该法较前两种方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未见用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒及方法报道。
发明的内容本发明的目的是提供一种快速、特异性强、灵敏度高且成本低的用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法检测创伤弧菌的试剂盒，并提供一种使用该试剂盒快速检测创伤弧菌的方法，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始的茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的有两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的一种用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒，其试剂包括(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500uM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、2-4mM硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.2uM上游内引物(vul-FIP)、0.8-1.2uM下游内引物(vul-BIP)、0.2-0.3uM上游外引物(vul-F3)、0.2-0.3uM下游外引物(vul-B3)和1-1.5M甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾(KCl)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、20mM硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；上游内引物(vul-FIP)为tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcacggcagttg；下游内引物(vul-BIP)为acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcccaat；上游外引物(vul-F3)为tggttcggttaacggctg；下游外引物(vul-B3)为gccatcaacatagcggctaa；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8个活性单位(8U/uL)；(3)显色剂C为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23uL的最佳组成为2.5uL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游内引物(vul-FIP)、1.0uL 20uM下游内引物(vul-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(vul-F3)、0.25uL20uM下游外引物(vul-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜碱和4uL ddH2O(灭菌双蒸水)。
使用上述环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒检测创伤弧菌的方法，依次包括下列步骤(1)细菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；
C.加入100-150uL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴10-15分钟；D.用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA；(2)创伤弧菌的环介导等温扩增A.在装有23uLLAMP反应液A的反应管中加入1uL待检模板DNA，于恒温金属浴上95℃放置3-5分钟，立即置于冰上1-3分钟；B.在反应管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒温金属浴上60-65℃放置45-90分钟；D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5分钟后取出；(3)显色检测在每个反应管中加入1uL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检细菌不是创伤弧菌，如颜色变为绿色，则说明样品为创伤弧菌。
本发明的优点本发明建立了创伤弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，本试剂盒根据创伤弧菌的基因保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，以保证检测不同来源创伤弧菌株的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于创伤弧菌的检测，特别适合于基层医疗机构以及养殖现场应用。
具体实施例方式
下列实例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。
按下列配方制作创伤弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒(1)LAMP反应液A2.5uL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游内引物(vul-FIP)、1.0uL 20uM下游内引物(vul-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(vul-F3)、0.25uL 20uM下游外引物(vul-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜碱和4uL ddH2O(灭菌双蒸水)。
(2)Bst DNA聚合酶B浓度为8U/uL。
(3)显色剂C10％的SYBR GREEN I。
按照以下程序进行检测
(1)细菌DNA的提取A.取1.0mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机12000转/分离心5分钟，弃上清液；B.加入1.0mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5分钟，弃上清液；C.加入100uL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴10分钟；D.用台式离心机12000转/分离心10分钟，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。
(2)创伤弧菌的环介导等温扩增A.在装有23uLLAMP反应液A的反应管中加入1uL待检模板DNA，于恒温金属浴上95℃放置5分钟，立即置于冰上1分钟；B.在反应管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒温金属浴上65℃放置1小时；D.将金属浴调到80℃中止反应，3分钟后取出。
(3)显色检测在反应管中加入1uL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检细菌不是创伤弧菌，如颜色变为绿色，则说明样品为创伤弧菌。
本法快速、特异性强、灵敏度高且成本低。
权利要求
1.一种用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒，其试剂包括(1)环介导等温扩增反应液A含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500uM dNTP、2-4mM硫酸镁、0.8-1.2uM上游内引物、0.8-1.2uM下游内引物、0.2-0.3uM上游外引物、0.2-0.3uM下游外引物和1-1.5M甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；上游内引物为tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcacggcagttg；下游内引物为acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcccaat；上游外引物为tggttcggttaacggctg；下游外引物为gccatcaacatagcggctaa；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8个活性单位；(3)显色剂C为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
2.根据权利要求1中所述用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒，其特征是环介导等温扩增反应液A每管23uL的组成为2.5uL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mMdNTP、1.0uL 20uM上游内引物、1.0uL 20uM下游内引物、0.25uL 20uM上游外引物、0.25uL20uM下游外引物、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜碱和4uL ddH2O。
3.一种使用权利要求1或2中所述的用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒检测创伤弧菌的方法，依次包括下列步骤(1)细菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；C.加入100-150uL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴10-15分钟；D.用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。(2)创伤弧菌的环介导等温扩增A.在装有23uLLAMP反应液A的反应管中加入1uL待检模板DNA，于恒温金属浴上95℃放置3-5分钟，立即置于冰上1-3分钟；B.在反应管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒温金属浴上60-65℃放置45-90分钟；D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5分钟后取出；(3)显色检测在每个反应管中加入1uL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检细菌不是创伤弧菌，如颜色变为绿色，则说明样品为创伤弧菌。
全文摘要
涉及一种用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒及方法，试剂盒包括环介导等温扩增反应液A、Bst DNA聚合酶B、显色剂C；其中反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcac-ggcagttg、下游内引物acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcc-caat、上游外引物tggttcggttaacggctg、下游外引物gccatcaacatagcggctaa和1－1.5M甜菜碱；检测方法包括细菌DNA的提取、环介导等温扩增、显色检测等。其优点是快速、特异性强、灵敏度高且成本低。
文档编号C12P19/00GK101020927SQ20071002710
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月9日 优先权日2007年3月9日
发明者任春华, 胡超群, 王青柏, 罗鹏 申请人:中国科学院南海海洋研究所