专利名称：一种酶转化生产l-半胱氨酸的方法
一种酶转化妒L"半胱氨酸的旅
fe^领域本发明属于氮基酸的生产技术领域，涉及一种恶臭j段单胞菌(/^油mo,戸Mi ) 酶法转{鹏物^ L-半胱氨酸的方法。
背景技术：
L-半胱氨酸(L-cysteine)是构成蛋白质的20多种氨基酸中具有活性硫(巯基)的 氨基酸，目前已在医药、食品添加剂和化妆品中广泛应用。在医药方面，半胱氨,其衍生物可用 于肝脏药和解毒药、解热镇麟、溃疡治疗药、疲劳恢复剂、输舰综合錢酸制剂，特别是繊 药。在食品方面，半胱氨酸可用作面包发酵助剂。在化妆品方面主要用于繊精、防晒霜、养发精、 生勤JC。由于在大多,微生物体内，巯基来源于硫酸根离子，M^酸根离子可还原为某种硫化物， 因此柳隹用微生物发離制取L-半胱氨酸。我国对L-半胱氨酸的妒主要依靠毛发M;K解后提取 L-胱氨酸，然后将L-胱氨酸经化学或电解还原制备得到L-半胱氨酸，4发中胱氨酸，含鬆勺为14%， 国内目前毛勤乂角對去的最高收率约为4.5至5.5%。用毛发,制取L-半胱氮酸收率低，倉嫩高,水 解战呈产妇隹闻气体及大量废酸，环境污染严重；另外，由于卫生问题，从毛发提取的产品不符合 医药的l顿标准。而微生物酶法转化妒L半胱氨酸具有特异性强，妒工艺简单，副反应和畐U产 物少，对环境污染的禾號低靴点，将具剤艮好的发展前景。
发明内容本发明目的是解决现有技术中存在的收率低，旨继高，环境污染严重等问题，衝共一 种微生物酶法转皿物^ L"半胱氮酸的方法。
本发明JK共的一种以恶臭假单胞菌(Amfowomy p"/z'必)TS-1138全细胞为酶源，酶法转化 DL-2-氮基-A2噻i^lfr4羧酸(DL"2-Amino-A2lhiazoline4"Carboxylic Acid， DL-ATC)合成L-半胱 氨酸的方法，包括
A. 将恶臭假单胞菌TS-1138进行常规扩大培养
(恶臭假单胞菌(尸犯^b柳膨戸ft'必)TS1138曾于2006年11月在《生tJ^术通讯》第17 巻第6期和2007年2月在《河南工业大学對艮》第28巻第1期发表，测繊于天津禾根大学代谢 控制发酵研體，公众如有需要，可直接与该研究室麟。)
B. 将步骤A中获得的扩大培养的菌种接入产酶培养基进行培养产酶培养基中碳源含量应为 0. lF3(F。的干^t咅养基重，氮碳比N:C应介于1: 100^50: 100之间，无机盐含ffl^为0.1~10%， DL-ATC的添加量为0.1 %~0.9%。产酶培养基的初始PH6.0，培^MJt 25。C 33。C，振荡培养 或发,i歸12 36小时，接种量为O. 01^20% (V/V);在培养过程中流加氨水调节发辭咅养基 的PH6.2 7. 0;
C. 将步骤B培养到2(K24小时，离心分离菌体10min(4000r/min， 4°C)，弃去上清液，用pH7.4 的PBS缓冲液(磷自二钠-磷酸二氢钠-氯化钠缓冲液)反复洗涤菌体三次并 ，在pH 7.4的 PBS缓冲液中添加的湿菌体，帝恪,反/^万用细脱悬液，细胞浓度为100g/L 500g/L。
D. 将步骤C制备的细胤悬液，加入到底物溶液中，进行舰反应。其中底物溶液的浓度为0.05 % 5.0%，在0^小时加入，反应温度为3&^42°C，反应时间为2 12小时。8|{￡反应结束后，离 心分离菌体，社清液，采用酸式茚三酮法测定L-半胱氨齡量。
战B步产酶培养基中的碳源为糖，即葡箭糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，山梨糖；或甘油； 或低W醇，乙醇；碳源含 ^范围为10%~20%。
战B步产酶培养基中的氮源为氨或铵盐，即氯化铵，硫鹏安，碳^L铵，硝,；或有 机氮，即牛肉膏，蛋白胨，酵TO， 5^浆，尿素。
战B步产,咅养基中的无机盐为磷,，硫,，硫^M铁，氯化钠氨或硫^!孟。
在本发明实例中，采用酸式茚三酮法来测定L"半胱氨酸的含量，具体方法如下精确称取一定 量L-半胱氨酸标准品，溶于一定量0.05MHC1中，制备终浓度为500mg/l的标准母液，进一步用 蒸馏水将上述母液分别稀释为10， 20，……，100mg/l的标准溶液。取一定量的标准溶液或待测样 品溶液的稀释液0.2mL,加入02mL冰醋酸，再加入0.2 mL酸性茚三酮试剂，于沸水浴中反应IO min，然后立即在冷水中冷却，最后加入2.4mL酒精，使总体积为3mL。放置10min后，于560nm 下测定其吸皿，以浓度和吸皿纟魏嚇准曲线。S31该标准曲线计算出未知溶液中的半胱氨酸浓 度。
本发明的优点和积极效果通常在由謝崔化法进行的反应中，^S对酶作用有两个方面一 方面，反应温度升高，,反，率加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白热变性1加快， 酶易失活， 一般不能重复使用；而固定化的方法步骤比较繁杂，而且或多或少对酶活力有一定影 响。而本发明方法以恶臭假单胞菌TS-1138细胞为酶源，酶法转tt^物DLATC得到L-半胱氨酸 7K溶液。该方法直接利用细胞为酶源直接催化底物，取缔了固定化酶的方法，并舰斷氐,反 应驢，提高酶的稳定性，在,反应过程中流加底物DL"ATC，使酶可重复{顿，提高了酶源 细胞的利用效率和L"半胱氨酸的产量。
具條驗式
实施例l:恶臭假单胞菌TS1138菌悬液的帝恪
从亲賴羊斜面上挑取一环恶臭假单胞菌TS-1138的菌苔接A^有30mL种子培养基(葡萄糖 30g/L， DL-ATO3H205g/L，酵娜15g/L，蛋白胨10g/L，尿素3g/L， MnS04-H20 lg/L， K2HP04-3H20 3g/L， MgSQr7H2O0.5g/L， FeSOr7H2O0.01g^， NaC11.5g/L， pH7.5， 0.1MPal5min)的500mL 三角瓶中，8层纱布封口，于旋转式摇床190r/min， 29。C振荡培养14h后，以10%接种量将种子培 养物接A^"30mL产,咅养基(葡萄糖30g/L， DLATC .3恥4g/L，就浆3g/L，尿素3g/L， MnSQrH20 lg/L， K2HP04'3H20 3.0g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， FeS04.7H20 0.01g/L， NaC13 g/L， pH7.5, 0.1MPal5min)的500mL三角瓶中，8层纱布封口，于旋转式摇床170r/min， 29。C振荡培 养22h后，离心分离菌体10min(4000r/min， 4°C)，弃去上清液，用pH 7.4的PBS缓冲液反复洗涤 菌体三次并塞悬，在pH 7.4的PBS缓冲液中添加的湿菌体，制备謝足反舰用细胤悬液，细胞浓 度为350g/L。
实施例2:以恶臭假单胞^TS1138摇瓶培养，在42。C进行,反应^I^半胱氨酸 在100ml三角瓶中加入0.6。/。的DL-ATC溶液(含有0.6%DLATC 0.6%K2HPO4， pH7.5至8.0) 20ml，再加AJ^实施例l的TS-1138细脱悬液10ml，混匀。42。C恒温，反您.5小时后，用酸式茚 三酮法测定半胱氨酸的含量为1.6 5g/t。
实施例3:以恶臭假单胞菌TS1138摇瓶培养，在38。C进行謝足反应生产L半胱氨酸 在100ml三角瓶中加入0.6。/。的DL-ATC溶液(含有0.6。/。DL-ATC， 0.6%K2HPO4， pH7.5至 8.0) 20ml，再加入i^实施例l的TS墨1138细脱悬液10ml，混匀。38。C恒温，反应3小时后，用 酸式茚三酮法测定半胱氨酸的含量为1.60g/l。
实施例4:以恶臭假单胞菌TS1138摇瓶培养，在38。C流加底物进行,反应生产L半胱氨酸 在100 ml三角瓶中加入0.6%的DLATC溶液(含有0.6% DL~ATC， 0.6% K2HP04， pH 7.5至 8.0) 20ml,再加Ai^实施例l的TS-1138细胞悬液20ml，混匀。38。C恒温，分别于,反应3h 和6h时加入10ml含DL"ATC0.18g与0.24g的底物溶液，使底物溶液中ATC的量基本维持在0.6% 左右，隨反应9小时后，用麟茚三酮法测定半胱氨酸的含量为5.70g/1。
实施例5:以恶臭假单胞菌TS1138在5L罐培养，在42。C进行,反应生产L半胱氨酸 从飾羊斜面上挑取一环恶臭环假单胞菌TS-1138的菌苔接入种子培养基中，种子培养基及种子 培养斜牛均同实施例1，以10%的接种量(种子培养液300mL)，将斜虫灭好的产酶培养基(葡萄糖 50g/L， DL-ATC -3H20 5g/L，就浆3g/L，尿素3g/L， MnS04.H20 lg/L， K2HP04-3H20 3g/L， MgSO4.7H2O0.5g/L， FeS04.7H20 0.01g/L， NaC13g/L， pH7.0' O.lMPa 15min)火焰接种方式接 入5L自动控制发,中，5L发,中装液量3L，離控制29。C，自动流加氨水控制pH在6.7左 右，通风量200L/h，初始搅拌織200r/min，舰流加泡敌消泡。当赚低于5g/L时流加浓度为 60g/L的葡萄糖液。
发,养22小时后，取5L罐培养的细fcL，浓缩五倍至400ml，加入到含有0.6。/。的DL-ATC溶 液(含有0.6。/。DL"ATC, 0.6%K2HPO4， pH7.5至8.0) 800ml的5L自动控制发,中，混匀。42°C 恒温，反^15小时后，用酸式茚三酮法测定半胱氨酸的含量为1.81g/L
实施例6:以以恶臭假单胞^TS1138在5L罐培养，在38t:流加底物进行,反应^L"半胱氨
酸
在5L自动控制发,中力口入0.6%的DLATC溶液(含有0.6%DL-ATC， 0.6% K2HP04， pH7.5 至8.0) 800 ml，再加入上述实施例5的TS-1138细脱悬液400ml，混匀。38。C恒温，在,反应 3h时加入30ml含DL"ATC4.8g的底物溶液，i醜物溶液中ATC的量基本维持在0.6%左右，■ 反应6小时后，用酸式茚三酮法测定半胱氨酸的含量为2.95g/l。
权利要求
1、本发明提供的一种利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138酶法转化DL-2-氨基-Δ2噻唑啉-4羧酸(DL-2-Amino-Δ2thiazoline-4-Carboxylic Acid，DL-ATC)合成L-半胱氨酸的生产工艺，包括A.将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138进行常规扩大培养B.将步骤A中获得的扩大培养的菌种接入产酶培养基进行培养产酶培养基中碳源含量应为0.1％～30％的干基培养基重，氮碳比N∶C应介于1∶100～50∶100之间，无机盐含量应为0.1～10％，DL-ATC的添加量为0.1％～0.9％。产酶培养基的初始PH6.0～9.0，培养温度25℃～33℃，振荡培养或发酵罐培养12～36小时，接种量为0.01％～20％(V/V)；在培养过程中流加氨水调节发酵培养基的PH6.2～7.0；C.将步骤B培养到20～24小时，离心分离菌体10min(4000r/min，4℃)，弃去上清液，用pH 7.4的PBS缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠-氯化钠缓冲液)反复洗涤菌体三次并重悬，在pH 7.4的PBS缓冲液中添加的湿菌体，制备酶促反应所用细胞悬液，细胞浓度为100g/L～500g/L。D.将步骤C制备的细胞悬液，加入到底物(DL-ATC)溶液中，进行酶促反应。其中底物溶液的浓度为0.05％～5.0％，在0～9小时加入，反应温度为36～42℃，反应时间为2～12小时。酶促反应结束后，离心分离菌体，取上清液，采用酸式茚三酮法测定L-半胱氨酸含量。
2、 根据权利要求1所述的生产工艺,其特征在于B步产酶培养基中的碳源为糖， 即葡萄糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，山梨糖；或甘油；或低分子醇，乙醇；碳源含量最适 范围为10%~20%。
3、 根据权利要求1所述的生产工艺,其特征在于B步产酶培养基中的氮源为氨或 铵盐，即氯化铵，硫酸铵，碳酸氢铵，硝酸铵；或有机氮，即牛肉膏，蛋白胨，酵母粉, 玉米浆，尿素。
4、 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于B步产酶培养基中的无机盐为磷 酸钾，硫酸镁，硫酸亚铁，氯化钠氨或硫酸锰。
全文摘要
本发明公开了一种微生物酶法转化生产L-半胱氨酸的工艺。以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138为供试菌种，经扩大培养和产酶培养后，以全细胞为酶源，酶法转化DL-2-氨基-Δ2噻唑啉-4羧酸(简称DL-ATC)，其中底物溶液的浓度为0.05％～5.0％，在0～9小时加入，反应温度为36～42℃，反应时间为2～12小时。本发明工艺简单，生产原料成本低，耗能少，无污染。
文档编号C12P13/12GK101348809SQ20071005819
公开日2009年1月21日 申请日期2007年7月18日 优先权日2007年7月18日
发明者刘淑云, 徐庆阳, 怀丽华, 宁 陈, 雷 马 申请人:天津科技大学