专利名称：异戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术在改造抗生素组分中的应用。
背景技术：
异戊酰螺旋霉素I是本研究室利用基因工程技术构建的必特螺旋霉素(原名为生技霉素)产生菌所产生的一个组分[“生技霉素的制造方法”，专利号ZL97104440.6]、[“必特螺旋霉素高产菌株的获得”，专利号ZL 02148771.5]。必特螺旋霉素目前即将完成第III期临床实验。实验结果表明，在治疗呼吸道感染等疾病方面，显示了较好的临床疗效和安全性。
除异戊酰螺旋霉素I组分外，必特螺旋霉素成品中还包含异戊酰II和III组分，同时还含有少量4”丁酰基、丙酰基、乙酰基的衍生物及少量的螺旋霉素I、II、III(总含量应不超过5％)。目前现行的必特螺旋霉素成品质量标准中，规定其含有9个组分，4”酰化螺旋霉素总含量为80％，其中异戊酰螺旋霉素(I、II、III)3个组分的总含量为65％。而在必特螺旋霉素发酵液中还存在较大比例的螺旋霉素I、II、III，尤其II和III组分相对较多。必特螺旋霉素发酵液中的螺旋霉素主要依赖化学提取工艺将其清除。因此，抗生素发酵产品的多组分问题，给药品质量标准的制定以及发酵工艺和提取过程监控，经常带来很大的困难和挑战。所以，在不影响生物学活性的前提下，获得单一组分生产菌种，已成为抗生素研究和生产面临的重要课题。
必特螺旋霉素是以螺旋霉素为母核，利用基因工程技术在其4”位-羟基进行异戊酰基化所产生的。而螺旋霉素产生菌通常产生SPI、II、III三个组分，即内酯环3位分别为羟基(SP I)、乙酰基(SP II)和丙酰基(SP III)，结构式如图A所示。SP I、SP II、SP III三个组分的生物学活性基本一致。螺旋霉素产生菌产生SPI、II、III三个组分的生化机理，是由3-O-酰基转移酶催化内酯环3-O-羟基所致。本研究室曾在获得螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因序列(专利申请号200610087230.1，SEQ ID No.1)基础上，通过基因阻断技术，获得了主要产生螺旋霉素组分I的菌种。但是，仅仅产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的菌种，迄今尚未见到相关报道。
螺旋霉素结构本发明的目的在于，借鉴上述成果，在必特螺旋霉素产生菌中通过破坏编码3-O-酰基转移酶基因，以获得产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的基因工程菌。
发明内容
根据已经获得的3-O-酰基转移酶基因及其两翼序列，在3-O-酰基转移酶基因序列中可以破坏该基因的任意区段设计1个引物，并插入4个任意设计的酶切位点，经PCR获得两个1.0kb左右的同源臂，酶切后将两个同源臂互连，另外两侧与能转入必特螺旋霉素产生菌的载体相连接，以必特螺旋霉素产生菌(ZL02148771.5，菌种保藏号CGMCC No.0304)总DNA为模板，经PCR分别扩增两个与3-O-酰基转移酶基因同源片段，并以相应酶切位点插入具有选择性标记的链霉菌/大肠杆菌穿羧质粒载体，也可在两个同源基因中插入和使用质粒不同的选择性标记片段，构建重组质粒。将所构建的重组质粒转入必特螺旋霉素基因工程菌，以质粒上携带的选择性标记筛选转化子，根据转化子展现的选择性标记差异和PCR验证，获取因同源基因双交换而使3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌，称之为BT3-O-ATΔ变株。该基因工程菌在一定条件下，经发酵培养和产物的初步化学提取以及HPLC检测其发酵产物，证明本发明提供了产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的基因工程菌。
发明效果本发明利用基因工程技术将原必特螺旋霉素基因工程菌中的3-O酰基转移酶基因实施破坏，获得了只产生异戊酰螺旋霉素组分I的菌种。该菌种的获得，，使得必特螺旋霉素类抗生素发酵液中的多组分状况获得明显单一化，这将有助于简化生产过程发酵工艺的调控，实现提取过程的优化，提高收率，降低能耗和生产成本，为推进必特螺旋霉素类抗生素的产业化创造良好条件。
图1.用于3-O-酰基转移酶基因破坏的重组质粒pKCL1-4的构建及同源双交换其中Apramycin(阿普霉素抗性标记)；GTG和TGA表示3-O-酰基转移酶基因阅读框的起始和终止密码子；a，b，c，d为PCR反应所设计的引物。
图2.染色体基因组PCR产物电泳(确证3-O-酰基转移酶基因的破坏)其中1.基因工程菌BT3-O-ATΔ变株；2.必特螺旋霉素产生菌原株；3.DNA分子量标记III。
图3.基因工程菌BT3-O-ATΔ变株发酵产物HPLC的检测其中A.必特螺旋霉素提取品(对照)；B.必特螺旋霉素产生菌原株；C.基因工程菌BT3-O-ATΔ变株。
I-异戊酰螺旋霉素I；II-异戊酰螺旋霉素II；III-异戊酰螺旋霉素III；SI-螺旋霉素I；SII-螺旋霉素II；SIII-螺旋霉素III；纵坐标-HPLC分析中紫外吸收百分比(abs)；横坐标-分钟(min)。
实施方案以下实施例仅为帮助本领域技术人员进一步理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>重组载体pKCL1-4的构建根据本研究室已经获得的3-O-酰基转移酶基因及其两翼序列[NCBIDQ642742]设计两对引物，并插入相应的酶切位点(引物在染色体上的相对位置如图1所示)L1上游引物(a)GCGAAGCTTTGCCCTGGCAATTGCAGTGTCAGHindIII下游引物(b)GCGTCTAGAGCCGAACGTGACGATGTGCAGCGXbaIL2上游引物(c)GTCTCTAGACAGTGGTCCTTCGCCTTCTATCTXbaI下游引物(d)GACGGATCCTCGTCGCGCAGCAGGTCGTTGAGBamHI进行常规PCR扩增，获得与3-O-酰基转移酶基因两个部分同源的片段(左臂L1，1.0kb；右臂L2，1.0kb)。L1两端携带HindIII和XbaI酶切位点，L2两端携带XbaI和BamHI位点。将L1、L2片段和温敏型链霉菌/大肠杆菌穿梭质粒pKC1139(携带阿普霉素-Apramycin，Am抗性标记)以相应的酶切位点进行连接，获得重组载体pKCL1-4(构建过程见图1)。
<实施例2>必特螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌株构建必特螺旋霉素产生菌在斜面培养基[王以光等，生物工程学报，1992年8(1)1-14]上28℃培养7-10天，按照文献[D.A.Hopwood等Geneticmanipulation of Streptomyces，A Laboratory Manual，Norwich；JohnInnesFoundation UK，1985]描述的方法制备原生质体，将pKCL1-4通过原生质体转化方法，导入必特螺旋霉素产生菌中，以Am抗性作为选择性标记获得转化子；经无抗性平板在37℃条件下培养传代、单菌落分离，获得了Am敏感菌株(称为BT3-O-ATΔ变株)。
提取变株和原株基因组DNA为模板，以引物a和d配对，进行PCR扩增和产物的电泳鉴定。由于必特螺旋霉素原株中的3-O-酰基转移酶基因组与载体携带的L1和L2片段发生了同源双交换，使BT3-O-ATΔ变株中3-O-酰基转移酶基因在阅读框架内删除了612bp的序列，因此，BT3-O-ATΔ变株PCR产物约为2.0kb，比原株(约2.6kb)小0.6kb(结果见图2)，表明必特螺旋霉素原株中3-O-酰基转移酶基因的部分序列已被删除和破坏。所获得的变株即为必特螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌株。
<实施例3>必特螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌株发酵产物的HPLC检测BT3-O-ATΔ变株的发酵培养及产物初步提取按照文献[王以光等，生物工程学报，1992年8(1)1-14]进行。发酵液初步提取液挥发干后，以少量甲醇溶解，采用岛津LC-10ATvp液相色谱议，二级管阵列检测器，色谱柱为KromasilC184.5*150mm，流动相为甲醇/1％磷酸二氢钠溶液(53/47)，流速为1mL/min。以必特螺旋霉素纯品为对照，以必特螺旋霉素主要组分的保留时间为标准[姜威等中国抗生素杂志.2002，27(7)387-391]，取5ul发酵液，经初步提取的样品进行HPLC检测。发酵主要产物所占比例的HPLC定量分析结果见图4和表1。
表1 BT3-O-ATΔ变株发酵主要产物的HPLC检测
HPLC分析结果表明，原株发酵产生异戊酰螺旋霉素I为3.29％，螺旋霉素II和III所占总组分比例约为40.15％；本发明获得的BT3-O-ATΔ变株不产生螺旋霉素II、III和异戊酰螺旋霉素II、III。BT3-O-ATΔ变株所产生的异戊酰螺旋霉素I占总组分的比例约为23.47％；螺旋霉素I占总组分的比例为32.39％。这一结果充分证明，必特螺旋霉素原株中3-O-酰基转移酶基因已经完全破坏。本发明获得了4”位酰化螺旋霉素中以产生异戊酰螺旋霉素I为主组份的基因工程菌。
权利要求
1.异戊酰螺旋霉素I基因工程菌株的构建，其特征是在必特螺旋霉素产生菌中通过破坏编码3-O-酰基转移酶基因，以获得产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是以3-O-酰基转移酶基因序列为模板，在3-O-酰基转移酶基因序列中可以破坏该基因的任意区段设计4个引物，并插入4个任意设计的酶切位点，经PCR获得两个1.0kb左右的同源臂，酶切后将两个同源臂互连，另外两侧与能转入必特螺旋霉素产生菌的载体相连接，获得重组载体，并转入必特螺旋霉素产生菌，以载体上的选择性标记挑取转化子，通过筛选抗性标记和PCR验证，获得3-O-酰基转移酶基因被破坏的变株，经发酵及对产物提取后HPLC分析，证明所获变株为主要产生异戊酰螺旋霉素组分I的菌种。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术在改造抗生素组分中的应用，具体来讲，是对必特螺旋霉素产生菌中参与产生组分II和III相关的3－O－酰基转移酶基因实施阻断和破坏，通过同源基因双交换获得产生4″位异戊酰螺旋霉素I为主组份的基因工程菌，该菌株的获得十分有利于今后生产工艺的简化、生产成本的降低和质量标准的制定与控制。
文档编号C12P19/62GK101054553SQ20071009050
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月9日 优先权日2007年4月9日
发明者武临专, 王以光, 马春燕, 赫卫清, 周红霞 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所