专利名称：：高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因及其点突变方法
技术领域：
：本发明是关于一种高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因及其点突变方法，其是利用点突变方法将一聚木醣酶的基因的第41个氨基酸由天门冬酰胺〔aspamgine〕突变为天门冬胺酸〔asparticacid〕，以形成高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因。
背景技术：
：一般而言，聚木醣〔xylan〕大多存在于植物的结构性多醣中，其是具有保护植物的纤维质的功能，因此聚木醣对于人类开发植物资源时视为一种障碍。例如，在造纸过程中所形成的纸浆中，聚木醣将与植物的木质素粘附于植物的纤维质的表面，通常必须利用一氯化物对纸浆进行一漂白作业。在漂白作业完成后，氯化物所产生的化学副产物是具有毒性及致癌性，且将持久性〔persistent〕的累积〔bioaccumulating〕在自然环境内，进而对自然环境及生态造成严重影响。.在畜牧业上，当一饲料进入动物的消化系统时，由于祠料已含有纤维质及半纤维质，同时饲料的许多可被利用养分往往被本身的纤维质及半纤维质包覆着，因而阻绝养分受其它酵素作用或肠胃道吸收，进而影响动物的生长，且未经利用的养分，一旦排出动物体外后，必然形成一污染源，并造成环境品质的低落。因此，如何分解移除聚木醣是为业界相当重要的课题。一^殳而言，由于分离自瘤胃孩i生物(rumenmicroorganisms)的传统聚木醣酶是具有分解聚木醣的能力，因此可有效改善上述问题。就造纸业而言，聚木醣酶可分解纸浆中的半纤雄素而瓦解木质素与纤维素及半纤维素的连结，如此纸浆能释放出木质素，进而完成漂白作用。在食品加工业而言，除可分解果汁中的半纤维质外，更可用以射造一木寡糖作为各种食品原料。若应用在畜牧业时，则可将木寡糖添加至飼料内，利用聚木醣酶分解饲料中的聚木醣，以帮助养分容易被动物的消化系统吸收，进而改善或提高动物的营养吸收量。然而，基于上述传统聚木醣酶由于其对酸碱值的耐受性较差，因此无法广泛应用于各种产业，以致传统聚木醣酶的使用裕度低落。例如对于造纸业而言，其所需的聚木醣酶需要对于一碱性环境具有较高的耐受性，因此分离自瘤胃微生物的传统聚木醣酶无法应用于造纸业。点突变是常用来改善酵素特性的一种方式，一传统点突变方法如Joshietal.发表于J.Mol.Biol.(2000)299，255-279的HydrogenBondingandCatalysis:ANovelExplanationforHowaSingleAminoAcidSubstitutionCanChangethepHOptimumofaGlycosidase所示，其是将一Bacilluscirculans的聚木醣酶的第35个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸时，使得聚木醣酶的pKa值下降，进而提高聚木醣酶的耐酸性。传统点突变方法仅能提高聚木醣酶的耐酸特性，仍无法有效改善聚木醣酶的酸碱反应范围。.有鉴于此，本发明是利用一点突变方法将一聚木醣酶的基因的第41个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成一高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因。藉此，本发明确实可有效提高聚木醣酶的酸碱耐受性、酸碱反应范围及活性。
发明内容本发明的主要目的是提供一种高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，且高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的第41个氨基酸为天门冬胺酸，使得本发明具有在不降低反应活性下提高一聚木醣酶的酸石咸反应范围的功岁文。'本发明的次要目的是提供一种点突变方法，其是将一酵素的基因中的至少一氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成酵素的一突变基因，进而使得本发明具有提高酵素的酸碱反应范围及活性的功效。本发明的目的是这样实现的一种高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是聚木醣酶的突变基因的第41个氨基酸为天门冬胺酸。该高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的基因序列是含有序列识别编号3的序列。该聚木醣酶的突变基因的第21个氨基酸为天门冬胺酸，且该聚木醣酶的突变基因的基因序列是序列识别编号4所示。该聚木醣酶的基因是利用一个载体进行生产，以形成一个第一重组质体。该载体为一个pET系统。该第一重组质体混合一个dNTP、一个li冲溶液、一个顺向欲突变端引子、一个反向欲突变端引子及一个聚合物进行聚合酶连锁反应，以形成含有高酸石威反应范围的聚木醣酶的突变基因的一个第二重组质体。该顺向欲突变端引子是具有序列识别编号l的基因序列，且该反向欲突变端引子是具有序列识别编号2的基因序列，其中，序列识别编号1为5'GGTGGTGGTCAAGACCAACATAAAGGTG3',序列识别编号2为5'CACCTTTATGTTGGTCTTGACCACCACC3'。.该高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因是经由基因重组技术整合于一个质体或一个染色体内。该聚木醣酶的基因是分离自一个瘤胃微生物的一个混合菌抹，且该聚木醣酶的基因的基因序列是登录于基因数据库中，登录号码为AY941119。本发明还提供一种点突变方法，其特征是将一个酵素的一个基因中的至少一个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成该酵素的一个突变基因。该酵素为一个聚木醣酶，且该氨基酸为聚木醣酶的基因的第41个氨基酸。该高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的基因序列是含有序列识别编号3的序列。本发明的主要优点是根据本发明的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因及其点突变方法，其是属将一聚木醣酶的基因的第41个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成一高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因。利用点突变方法改造聚木醣酶的基因的第41个氨基酸，以达成由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，如此可有效提高聚木醣酶的酸碱耐受性、酸碱反应范围及活性。下面结合较佳实施例和附图进一步说明。图1:本发明的实施例1的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因及其点突变方法的制备流程示意图。图2:本发明的实施例1的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的基因序列示意图〔序列识别编号3,SEQIDNO:3〕。图3:本发明的实施例1的野生型聚木醣酶的SDS-PAGE分析示意图。图4:本发明的实施例1的突变型聚木醣酶的SDS-PAGE分析示意图。图5:本发明的实施例1的野生型聚木醣酶及突变型木醣酶的相对酵素活性(％)对pH值的变化示意图。图6:本发明的实施例1的突变型聚木醣酶于pHll的碱性环境下的相对酵素活性(％)对置放时间〔小时〕的变化示意图。图7:本发明的实施例2的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的基'因序列示意图〔序列识别编号4,SEQIDNO:4〕。具体实施例方式为让本发明的上述目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明的较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下实施例1请参阅图1所示，本发明的实施例1主要是利用一点突变方法将一聚木醣酶的基因的第41个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成一高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变J^因。更详言之，本发明是经由下列步骤以利用点突变方法进一步形成高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因第一步骤Sl是将聚木醣酶的基因利用一载体进行生产，以形成一第一重组质体，再将第一重组质体转形入一胜任细胞〔competentcell〕中，进一步形成一野生型表达载体；第二步骤S2是将第一重组质体混合一dNTP、一緩沖溶液〔reactionbuffer〕、一顺向欲突变端引子〔forwardprimer〕、一反向欲突变端引子〔reverseprimer〕及一聚合酶[polymerase]进行一聚合酶连锁反应〔polymerasechainreaction〕，以形成含有高酸石咸反应范围的聚木醣酶的突变基因的一第二重组质体，再将第二重组质体转形入胜任细胞中以形成一突变型表达载体。由于聚合酶连锁反应可大量复制聚木醣酶的基因，且顺向及反向欲突变端引子内各具有一突变位置，使得聚合酶连锁反应于复制聚木醣酶的基因时可产生高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因。因此，通过控制顺向及反向欲突变端引子，便可进一步使聚木醣酶的基因的第41个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因。请再参阅图l所示，本发明的实施例1的第一步骤Si是将聚木醣酶的基因利用载体进行生产，以形成第一重组质体，再将第一重组质体转形入胜任细胞中，进一步形成野生型表达载体。更详言之，野生型的聚木醣酶的基因的基因序列是登录于基因数据库中〔登录号码为AY941119〕，其来源是选择分离自未分离纯化的瘤胃微生物〔mmenmicroorganisms〕。载体是选择但不受限于一pET系统。pET系统的操作方式如下野生型的聚木醣酶的基因原保存于一质体〔plasmid〕中，以形成含有聚木醣酶的基因的一重组质体，质体是选择为一pGEX5X-l〔AmershamPharmacia,Sweden〕。再将重组质体转形入一第一微生物，并接种于含有一抗生素的一培养液中。第一微生物是选择为一大肠杆菌DH5a〔E.coliDH5a〕，培养液是选才爭为一含抗生素的Luria-Bertanibroth培养液，抗生素是选4奪为一氨比西林〔ampicillin〕，且氨比西林的浓度是选择为100jLig/mL。接着，选择于37"C下培养16小时后，较佳是选择以一小量质体纯化套组〔mini-MplasmidDNAExtractionSystem,Viogene,Taiwan〕进4亍质体纯4匕，以获得纯化后的重组质体。再利用二限制酶对纯化后的重组质体进行截切后，即可回收含有聚木醣酶的基因的DNA片段。二限制酶是选择为一BamHI及一NotI。于一第一质体利用二限制酶进行截切后，再经由一连接酶〔ligase〕使含有聚木醣酶的基因的DNA片段与截切后的第一质体进行一粘接反应〔ligation〕，以形成含有聚木醣酶的基因的第一重组质体。第一质体是选择为一pET21C〔Novagen,USA〕，且连接酶是选择为一T4连接酶〔T4ligase，Roche，Germany〕。如此，即可结束pET系统的操作。再将第一重组质体转形入胜任细胞中，并以一定序方式确认DNA片段，胜任细胞是选择为大肠杆菌DH5a,如此便完成第一步骤S1。请再参阅图1所示，本发明的实施例1的第二步骤S2是将第一重组质体混合dNTP、緩冲溶液、顺向欲突变端引子、反向i炎突变端引子及聚合酶进行聚合酶连锁反应，以形成含有高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的第二重组质体，再将第二重组质体转形入胜任细胞中以形成突变型表达载体。更详言之，选4奪于一200pL的薄壁离心管中加入第一重组质体、dNTP、緩冲溶液、顺向欲突变端引子、反向欲突变端引子及聚合酶。第一重组质体的加入量是为50ng,dNTP是由一dATP、一dTTP、一dCTP及一dGTP所组成，且dATP、dTTP、dCTP及dGTP的浓度皆是选择为360pM,緩冲溶液是选择为5pL的10Xreactionbuffer,顺向及反向欲突变端引子的最终浓度是选择为300nM,且顺向欲突变端引子的基因序列〔序列识别编号1,SEQIDNO:1〕及反向欲突变端引子的基因序列〔序列识别编号2,SEQIDNO:2〕如表一所示，其中顺向及反向欲突变端引子的基因序列标示有底线的位置是为突变位置。聚合酶是选择为0.75liL〔3.75units〕的ExpandlongtemplateDNApolymerase〔Roche,Germany〕。最后，选4奪力口入一蒸4留水以调整总体积至50pL。经短暂离心后，将聚合酶放入一聚合酶连锁反应机器，聚合酶连锁反应机器是选4奪为AppliedBiosystems，2700，USA。表一、顺向及反向欲突变端引子的基因序列顺向欲突变端引子序列识别编号15'GGTGGTGGTCAAGACCAACATAAAGGTG3'反向欲突变端引子序列识别编号25'CACCTTTATGTTGGTCTTGACCACCACC3'请再参阅图1及图2所示，聚合酶连锁反应是先以一高温使聚木醣酶的基因的两股分离〔denature〕，顺向及反向欲突变端引子将与单股的聚木醣酶的基因緩冷配对〔annealing〕，顺向及反向欲突变端引子各自界定一欲复制DNA片段的两端，再经由聚合酶自顺向及反向欲突变端引子延伸合成欲复制DNA片段[extension〕。因此，聚合酶连锁反应机器首先是选择设定为95°C，3分钟；再以95°C,45秒〔denature〕；55°C,1分钟〔a雄aling〕；68°C,9分钟〔extension〕做为1个循环，重复完成20个循环后，接着是55。C，l分钟；68。C,15分钟，最后降温于4。C中以形成一聚合酶连锁反应产物，如此即完成聚合酶连锁反应。经由聚合酶连锁反应便可形成含有高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的第二重组质体。4妻着取出聚合酶连锁反应产物20pL并加入一限制酵素以切割聚合酶连锁反应产物中未经突变的第一重组质体。限制酵素是选择为l(aL的DpnI，并选择于37。C下作用l小时后，再选择于65。C下反应IO分钟，将第二重组质体转形至第一微生物，以形成突变型表达载体。将突变型表达载体培养于含有抗生素的培养液中以进行筛选，最后选择挑选3个转形成功的菌落并以定序方式确认第二重组质体，如此便完成第二步骤S2。由于顺向及反向欲突变端引子各具有突变位置，因此经由聚合酶连锁反应进行复制，于过程中便可产生出含有高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的第二重组质体，如此便可使聚木醣酶的基因的第41个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因。聚木醣酶的突变基因的基因序列是含有如图2所示〔序列识别编号3,SEQIDNO:3〕的序列。图2中，以框线标记的区域即为聚木醣酶的突变基因的第41个氨基酸，其为天门冬胺酸。本发明为验证聚木醣酶的基因与高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的差异，本实施例另经由聚木醣酶的基因及高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因分别生产一野生型聚木醣酶及一突变型聚木醣酶，并进一步测量其酵素活性、酵素最适反应酸碱值及耐碱性，以验证本发明的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因确实具有提高聚木醣酶的石威耐受性、酸石咸反应范围及活性的功岁丈。请参阅图3及图4所示，首先抽出野生型表达载体中的第一重组质体并转形入一第二微生物中以形成含有聚木醣酶的基因的一生长载体，第二微生物是选择为一大肠杆菌BL21〔DE3〕。接着，将生长载体选择接种于5mL含有抗生素的培养液中以形成一菌液，并选#^于37°C及225rpm条件下震荡培养16小时。于菌液培养完成后，再选择将每5mL的菌液接种于500mL的含有抗生素的培养液中，并选4奪以37。C及180rpm条件下震荡培养，当菌液的OD,值达0.6-0.8时选择加入一IPTG〔isopropyl-卩-D-thiogalactoside〕于培养基中以作为一诱导剂，IPTG的最终浓度是选择为lmM。于IPTG诱导4小时后，便可生成野生型聚木醣酶，接着选4奪以4000g的条件离心20分钟后，将菌液中的一菌体沈降。将菌体收集并选择回溶于一柠檬酸緩冲溶液〔citricacidbuffer〕中，柠檬酸緩沖溶液为pH6且其浓度为50mM。接着选择加入一PMSF〔phenylmethylsulfonylfluoride〕及一leupeptin讦乍为一蛋白酶^卩制剂，以避免第二微生物中的蛋白酶将所形成的野生型聚木醣酶分解。PMSF的最终浓度是选择为0.5mM，且leupeptin的最终浓度是选择为lug/mL。接着，利用超音波将菌体破菌后便形成一粗酵素液，选择亍10000g的条件下离心30分钟以分离粗酵素液。进一步将粗酵素液选4奪依序以一CM阳离子管柱〔CM-Sepharosecolumn〕及一Ni-NTA亲合性管柱进行纯化，以取得纯化后的野生型聚木醣酶，最后将纯化后的野生型聚木醣酶进行透析，以去除多余盐类并置换柠檬酸緩冲溶液。如此便可取得野生型聚木醣酶以进行后续的测试。突变型聚木醣酶的制备方法与上述野生型聚木醣酶的制备方法相同，其差异仅在于将"抽出野生型表达载体中的第一重组质体"改变为"抽出突变型表达载体中的第二重组质体，，，经上述方式操作后即可取得突变型聚木醣酶。请再参阅图3及图4所示，将野生型及突变型聚木醣酶以SDS-PAGE作进一步的分析，以确认野生型及突变型聚木醣酶的纯化状态及分子量。其中第la及lb道是为一标准蛋白质的分子量标记；第2a道是为第一重组质体所形成的粗酵素液；第3a道是为经过CM阳离子管柱纯化后的野生型聚木醣酶；第4a道是为经过Ni-NTA管柱纯化的野生型聚木醣酶；第2b道是为第二重组质体所形成的粗酵素液；第3b道是为经过CM阳离子管柱纯化后的突变型聚木醣酶；第4b道是为经过Ni-NTA管柱纯化的突变型聚木醣酶。由第4a及4b道可得知野生型及突变型聚木醣酶的分子量皆约为34KDa。请参阅表二所示，分别测定野生型及突变型聚木醣酶于不同纯化阶段的酵素活性以比较两者间的酵素活性差异。首先，取5ng的野生型聚木醣酶加入一受质液中，受质液是选择含有20mg/mL的可溶性重组麦的聚木醣〔solubleoatspeltxylan〕的一緩冲液，緩冲液是选4奪为50mM的柠檬酸緩冲溶液，且其pH值是为6.5。在混合均匀后，选择置放于5(TC,反应10分钟，使野生型聚木醣酶分解受质液中的聚木醣。接着，利用一DNS〔dinitrosalicylicacid〕法定量还原受质液中剩余的聚木醣的量，以进一步求得酵素活性〔U/mg〕。每单位活性〔U〕是为每分钟可催化lpmole的基质的活性。野生型聚木醣酶的浓度是选择以一BCA蛋白质定量套组〔PierceLtd.USA〕进行定量。突变型聚木醣酶的酵素活性测试的操作方法与上述野生型聚木醣酶的酵素活性测试的操作方法相同。结杲显示纯化后的突变型聚木醣酶的酵素活性略大于纯化后的野生型聚木醣酶的酵素活性。如此，可得知本发明的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因并不会降低其酵素活性。.表二、野生型及突变型聚木醣酶的酵素活性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>请参阅图5所示，为了解野生型及突变型聚木醣酶于不同酸碱值环境下的相对酵素活性变化，因此对野生型及突变型聚木醣酶做一酵素最适反应酸碱值测试。选择将5ng的野生型聚木醣酶加入295pL的受质液中，受质液是为含有20mg/mL的可溶性重组麦的聚木醣的緩沖液。緩冲溶液是可选择为一甘胺酸緩冲液〔glycinebuffer〕，pH值是于2至3.5之间；緩沖液是选择为柠檬酸緩沖液，pH值是于3至6.5之间；緩冲液是选择为一磷酸盐緩沖液〔phosphatebuffer〕，pH值是于6至7.5之间；緩冲液是选择为一三羟曱基氨基甲烷緩沖液〔Trisbuffer〕，pH值是于7至10之间；緩冲液是选择为一CAPS緩沖液，pH值是于10至11之间。混合均匀后，野生型聚木醣酶分别选择于一适当温度下反应IO分钟，再以DNS法测定还原受质液中剩余的聚木醣的量并估算酵素活性。其中，酵素最适反应酸碱值测试是以pH6.5为基准，以进一步估算其它酸碱值的相对酵素活性。突变型聚木醣酶的酵素最适反应酸碱值测试的操作方法是与野生型聚木醣酶相同。如第4图所示，相对于最适反应酸碱值所呈现的活性，突变型聚木醣酶在pH2进行反应时仍可维持60%以上的反应活性，而相同条件下，野生型聚木醣酶仅具有20%的反应活性；在pHll的反应条件下，突变型聚木醣酶仍可维持90%以上而野生型聚木醣酶仅能维持80%左右的反应活性。可得知突变型聚木醣酶不论于酸性环境或碱性环境中，其相对酵素活性皆较野生型聚木醣酶的相对酵素活性高。如此可验证本发明确实具有提高聚木醣酶的酸碱耐受性、酸碱反应活性及范围的功效。请参阅图6所示，为了解突变型聚木醣酶于一碱性环境下的相对酵素活性对置放时间〔小时〕的变化，因此对突变型聚木醣酶做一酵素耐碱性测试。其是将突变型聚木醣酶在室温下置放于pHll的碱性环境下，并于不同置放时间选择取5ng〔lng/fiL〕的突变型聚木醣酶与295pL的受质液混合。接着选择于一适当温度及一适当pH值下置放IO分钟后，以DNS法测定还原受质液中剩余的聚木醣的量并估算酵素活性。可得知突变型聚木醣酶于置放时间30分钟可保有80%以上的相对醉素活性；于置放时间4小时可保有70%以上的相对酵素活性；于置放时间6至24小时依然保有55%以上的相对酵素活性。因此，可验证本发明的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因及其点突变方法确实具有提高聚木醣酶的耐碱性的功效。实施例2请参阅图2及图7所示，本发明的实施例2的聚木醣酶的突变基因的基因序列是含有如图7所示〔序列识别编号4，SEQIDNO:4〕的序列。图7中，以框线标记的区域即为发生突变的位置，其为序列识别编号4的第21个氨基酸，且是天门冬胺酸。其中，由于序列识别编号.4是为序列识别编号3中第21至200个氨基酸所形成的基因序列。进而可了解，虽突变的位置相对于序列识别编号3及序列识别编号4的位置不同，然而，突变的氨基酸的位置为实质相同。也因此可发现含有如序列识别编号4的基因序列的聚木醣酶的突变基因亦具有提高聚木醣酶的酸碱耐受性、酸碱反应范围及活性的效果。因此，可得知利用本发明的点突变方法是可将一酵素的基因中的至少一氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成酵素的突变基因并提高酵素的酸碱反应范围与耐碱性。酵素是可选择为一氧化还原酵素、一转移酵素、一水解酵素、一脂解酵素、一异构酵素或一合成酵素。水解酵素是可选择为聚木醣酶。.此外，本发明的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因亦可经由基因重组技术整合于一质体或一染色体内形成一重组体，以作为进一步的应用；亦可将重组体经由基因工程处理进入一细胞中，以作为进一步的应用。如上所述，相较于传统点突变方法及传统聚木醣酶，由于传统聚木醣酶对酸碱值的耐受性较差，因此无法广泛应用于各种产业，以致传统聚木醣酶的使用裕度低落。反观，本发明利用点突变方法将聚木醣酶的基因的第41.个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因。藉此，本发明确实可有效提高.聚木醣酶的酸碱耐受性、酸石威反应范围及活性。权利要求1、一种高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是聚木醣酶的突变基因的第41个氨基酸为天门冬胺酸。2、根据权利要求1所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是该高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的基因序列是含有序列识别编号3的序列。3、一种高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是该聚木醣酶的突变基因的第21个氨基酸为天门冬胺酸，且该聚木醣酶的突变基因的基因序列是序列识别编号4所示。4、根据权利要求1、2或3的其中之一所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是该聚木醣酶的基因是利用一个载体进行生产，以形成一个第一重组质体。5、根据权利要求4所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是该载体为一个pET系统。6、根据权利要求4所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是该第一重组质体混合一个dNTP、一个缓冲溶液、一个顺向欲突变端引子、一个反向欲突变端引子及一个聚合物酶进行聚合酶连锁反应，以形成含有高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的一个第二重组质体。7、根据权利要求6所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是该顺向欲突变端引子是具有序列识别编号l的基因序列，且该反向欲突变端引子是具有序列识别编号2的基因序列，其中，序列识别编号1为5'GGTGGTGGTCAAGACCAACATAAAGGTG3',序列识别编号2为5'CACCTTTATGTTGGTCTTGACCACCACC3'。8、根据权利要求1、2或3的其中之一所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是该高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因是经由基因重组技术整合于一个质体或一个染色体内。9、根据权利要求1所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因，其特征是该聚木醣酶的基因是分离自一个瘤胃微生物的一个混合菌抹，且该聚木醣酶的基因的基因序列是登录于基因数据库中，登录号码为AY94119。10、一种高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的点突变方法，其特征是将一个酵素的一个基因中的至少一个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成该酵素的一个突变基因。11、根据权利要求IO所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的点突变方法，其特征是该酵素为一个聚木醣酶，且该氨基酸为聚木醣酶的基因的第41个氨基酸。12、根据权利要求11所述的高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的点突变方法，其特征是该高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因的基因序列是含有序列识别编号3的序列。全文摘要一种高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因及其点突变方法，其是利用点突变方法将一聚木醣酶的基因的第41个氨基酸由天门冬酰胺突变为天门冬胺酸，以形成高酸碱反应范围的聚木醣酶的突变基因。藉此，可有效提高聚木醣酶的酸碱耐受性、酸碱反应范围及活性。文档编号C12N9/24GK101289668SQ20071009023公开日2008年10月22日申请日期2007年4月16日优先权日2007年4月16日发明者江育全,郑雪玲,陈又嘉申请人:屏东科技大学