一种口蹄疫抗原的制备方法

专利名称：：一种口蹄疫抗原的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备抗原的方法，尤其涉及一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达口蹄疫抗原的方法，属于基因工程领域。
背景技术：
：口蹄疫是由口蹄疫病毒(FoofflwJ-moW/zWn,FMDV)弓I起偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染率高而著称。该病一旦爆发将对发病国造成巨大的经济损失，世界各国对该病的研究极为重视，国际兽医局将其列为A类传染病之首。口蹄疫属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，有A、O、C、Asial、SAT1、SAT2禾BSAT3型7个血清型。目前我国口蹄疫的防制仍以预防为主。尽管传统疫苗在口蹄疫预防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵，免疫期短，疫苗制备过程中病毒逃逸等危险因素很难避免。因此，传统疫苗亟需加以改进，研制安全、高效的口蹄疫分子疫苗仍显得非常必要。随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达口蹄疫基因，可望达到大幅度提高口蹄疫抗原产量、降低生产成本的目的(ConneelyO.M.,BiotechnologyintheFeedIndustry,T.P.Lyons(Ed),AlltechTechnicalPublications.Nicholasville，KY.57-66,1992)。杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的a-干扰素以来(Smith,Mol.CellBiol.,3:2156-2165,1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国就有a-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22:355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21:223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23:104-108，1997)等多种。利用此系统来生产口蹄疫抗原的优点在于1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达10毫克级/虫的水平。因而可大大降低口蹄疫抗原的生产成本并使通过基因工程方法大规模生产口蹄疫抗原成为可能；2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为所表达的口蹄疫抗原具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性提供了保证。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达口蹄疫抗原的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种制备口蹄疫抗原的方法，包括将口蹄疫不同的基因组合分别克隆到杆状病毒运载载体中，获得转移载体；用所获得的转移载体转染杆状病毒进行DNA重组，获得重组杆状病毒；用重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行口蹄疫抗原表达；收获并纯化所表达的抗原。其中，所述的口蹄疫不同的基因组合优选自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5所示的碱基序列；所述的杆状病毒运载载体优选自AcRP23-/acZ，AcRP6-SC,AcUWl-/acZ,BacPAK6，BactoPac，Bacmid,BlucBacII(pETL)，p2Bac,p2Blue,p89B310,pAc360、pAc373，pAcAB3、pAcAB4，PAcAS3，pAcC129，pAcC4，DZI,pAcGP67，pAcIEl,pAcJPl,pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8,pAcMPl、pAcMP2，pAcRP23、pAcRP25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51，pAcVC2、pAcVC3,pAcYMl,pAcJcC5，pBacl、pBac2,pBlueBacIII，pBlueBacHis,pEV55、mXIV，pIEINeo,pJVETL,pJVNhel，pJVP10,pJVrsMAG，pMBac,pP10,pPAKl，pPBac,pSHONEX1.1,pSYNXIVVI+,pSYNVI+wp,pSYNXIVVI-,pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985，pVTBac,pBM030，pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，更优选为pVL1393。所构建的转移载体优选为pVL1393(P1-2A3C)、pVL1393(ORF)或pVL1393(VPl)。所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV、或TeNPV，优选为家蚕杆状病毒Bm-NPV-ZJ8;所述的重组杆状病毒优选为以下任意一种(1)家蚕核型多角体病毒rBmNPV(ORF)，其微生物保藏号是CGMCCNO.1980;保藏时间是2007年3月20H;保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；(2)家蚕核型多角体病毒rBmNPV(P1-2A3C)，其微生物保藏号是CGMCCN0.1979;保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；(3)家蚕核型多角体病毒rBmNPV(VPl)，其微生物保藏号是CGMCCN0.1975;保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。所述的昆虫宿主选自包括家蚕(Bombyxmori)、野蚕(Bombyxmandarina)、蓖麻蚕(Philosamiacynthiaricim)、樟蚕(Dictyoplocajapanica)、樗蚕(Philosamiacynthiapryeri)、柞蚕(Antheraeapernyi)、日本柞蚕(Antheraeayamamai)、野天蚕(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographacaliforica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(Mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(Spodopteralittoralis)、秋粘虫(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、行军虫(Thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、美国棉铃虫(Heliothiszea)、烟青虫(Heliothisassulta)、'烟草夜虫我(Heliothisvirescens)、东方茅占虫(Pseudaletiaseparata)、舞毒蛾(Lymantriadispar)等；更优选为家蚕(Bombyxmori)。所述的感染是指重组杆状病毒通过口食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体(更优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种l-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含口蹄疫抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆)；其中，所述的蛹体为l-2天的早期嫩蛹。本发明采用基因重组技术，将来源于口蹄疫病毒的不同基因组合，包括P1-2A3C、ORF、VP1构建到各种杆状病毒运载载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUWl-lacZ，BacPAK6，BactoPac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIEl，pAcJPl，pAcMLF2、7、8，pAcMPl、2，pAcRP23、25，pAc證4，pAcsMAG，pAcUWl、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYMl，pAcJcC5，pBacl、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhel，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAKl，pPBac，pSHONEX1.1，pSYNXIVVI+，pSYNVI+wp，pSYNXIVVI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，使口蹄疫病毒不同的基因组合，包括ORF、P1-2A3C、VP1基因在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外(invivo/invitro)重组，将口蹄疫病毒不同的基因组合，包括P1-2A3C、ORF、VP1整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒。重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染l-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为l-2天的早期嫩蛹)，表达生产口蹄疫病毒抗原。本发明中最优选的一个技术方案是将SEQIDNO:l(P1-2A3C)、SEQIDNO:3(ORF)或SEQIDNO:5(VP1)所示的碱基序列插入到运载载体pVL1393上，再通过体内重组将全长P1-2A3C、ORF、VP1基因转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带口蹄疫不同基因组合的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)。将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)。当rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)在蚕体内复制时，ORF、P1-2A3C、VP1在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达，产生口蹄疫抗原。在感染3-6天(最佳为5天)后收集含口蹄疫抗原的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，每毫升蚕血淋巴可产生IO毫克以上的口蹄疫抗原，杀灭感染性病原后，经过蛋白纯化后便得到安全、高效的口蹄疫抗原，此种抗原可用于制备疫苗。本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产口蹄疫抗原，其生产成本显著低于传统的制备口蹄疫抗原方法(例如通过细胞繁殖病毒制备口蹄疫抗原)，无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于家蚕已经我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。总体而言，本发明方法可以大幅度降低口蹄疫抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。图l、口蹄疫病毒P1-2A3C在家蚕幼虫中的表达。图2、口蹄疫病毒P1-2A3C在家蚕蛹中的表达。图3、口蹄疫病毒全长ORF在家蚕幼虫中的表达。图4、口蹄疫病毒全长ORF在家蚕蛹中的表达。图5、口蹄疫病毒VP1在家蚕幼虫中的表达。图6、口蹄疫病毒VP1在家蚕蛹中的表达。具体实施方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。试验材料1.大肠杆菌株E.coliTG1和DHsa购自Promega公司；运载载体pVL1393(购自Invitrogen公司)、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8由中国农业科学院生物技术研究所保存；口蹄疫病毒由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫国家参考实验室保存；抗原检测试剂盒由中国农业科学院兰州兽医研究所制备，家蚕品种JY1由中国农业科学院生物技术研究所保存。2.酶与试剂限制性内切酶、连接酶为Promega公司产品。3.生化试剂IPTG、X-Gal为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、T4DNA连接酶、RNA酶、ProteinaseK、胎牛血清及其他试剂购于Invitrogen公司，细胞培养基TC-100购于Sigma公司。4.培养基大肠杆菌培养基为LB(l。/。蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0);家蚕细胞培养基为TC-IOO。5.口蹄疫病毒基因不同组合表达产物的动物实验在中国农业科学院兰州兽医研究所动物隔离实验室进行。实施例1口蹄疫抗原的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验1、P1-2A、3C基因的克隆和序列分析1.1目的基因的获得设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出口蹄疫病毒抗原蛋白P1-2A基因与非结构蛋白3C基因。所设计的抗原蛋白P1-2A基因和非结构蛋白3C基因的扩增引物为，P1-2A上游5，-ATAGGATCCACCATGGGAGCCGGGCAATCCAGCC陽3，,Bfl/wHl酶切位点P1-2A下游5，-CGCGAATTCTGACATGTCCTCCTGCATCTGGTTG-3，。￡coRI酶切位点3C上游5，-GCGGAATTCAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGT-3'。￡coRI酶切位点3C下游5，-ATAAGATCTCTACTCGTGGTGTGGTTCGGGAT-3'Bg/n酶切位点从口蹄疫病毒细胞培养液中提取总RNA。将提取的总RNA用01igo(dT)183物在AMV反转录酶的作用下，42。C反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下表lPCR反应条件<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反应过程94。C变性10分钟；94。Cl分钟，58。Cl分钟，72。C8分钟，共30个循环。最后延伸反应10分钟。1.2.PCR产物的纯化将PCR扩增的P1-2A、3C基因产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出约2.4kb、0.7kb的片段。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5ml小离心管中，加入3倍(v/w)体积的6MNal，37。C将凝胶溶解后，加入10pl玻璃奶(Glassmilk)，混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm离心5秒钟，再用NewWash溶液洗三次，每次均将沉淀弹起，并离心。最后将沉淀晾干后加入30nlO.lxTEBuffer溶解DNA，离心后去沉淀，取上清作进一步分析。1.3.酶切与连接反应酶切反应纯化后的P1-2A用S薩HI和五coRI双酶切分析，反应总体积为50^d，其中纯化的PCR产物lOpl，10x酶相应缓冲液5pl，两种酶各为lpl，无菌水补足体积。37。C反应2小时以上。将转移质粒pGEM-3Z作同样酶切反应。反应结束后于65T灭活10分钟。连接反应连接总体积15pl，PCR产物8^，载体1^d，5xT4DNA连接缓冲液3pl，T4DNA连接酶lpl，无菌水补足体积，1214。C连接过夜。用相同的方法酶切3C、pGEM-3Z，并进行连接反应。1.4.大肠杆菌的遗传转化用75mMCaCl2制备大肠杆菌TG1感受态细胞。取步骤3中制备的连接混合物5^1，加到200pl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42。C热激2分钟，迅速置于冰上12分钟，加入已温育至37°C的LB培养基500pl，37°C培养1小时，取100200^涂布于含100^ig/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37。C倒置培养过夜。1.5.质粒DNA的制备(1)从转化的LB平板上挑取单个菌落，接种于3ml含100pg/mlAmp的LB培养基中，37。C培养过夜。(2)取1.5ml菌液于小离心管中，3500rpm离心4min，去上清。(3)加入SolutionI150|iil，混匀后置于冰上15min。(4)加入SolutionII300pl，氯仿150pl，轻轻混匀后静置5min。(5)加入SolutionIII450pl，混匀后置于冰上15min。(6)11000g离心10min，上清移入新管。(7)加入异丙醇450)il，混匀后置于4°C15min。(8)11000g离心6min，去上清。(9)加入TER250pl，混匀后置于37°C20min。(10)加入PPtBuffer300350pl，混匀后静置15min。(11)llOOOg离心6min，去上清。(12)加入75%乙醇400^1。(13)11000g离心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1xTEBuffer40^1溶解，于-20。C保存。1.6.重组子的鉴定用5amHI/五coRI双酶切1.5中制备的质粒DNA，电泳后出现约2.4kb、0.7kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒pGEM-3Z(P1-2A)。用五coRI/Sg/11酶切1.5中制备的质粒DNA，电泳后出现0.7kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒pGEM-3Z(3C)。将重组质粒pGEM-3Z(P1-2A)、pGEM-3Z(3C)进行双向测序。P1-2A3C基因序列及氨基酸序列分别见SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。2、转移载体pVL1393(P1-2A3C)的构建将1.6中所制备的质粒pGEM-3Z(P1-2A)用5，HI和五coRI双酶切，用1.2中的方法纯化P1-2A基因片段，与经5amHI和五coRI双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TGl，筛选得到重组转移载体pVL1393(P1-2A)。将1.6中制备的质粒pGEM-3Z(3C)用五coRI和Sg/II双酶切，按1.2的方法纯化3C基因片段，与经五coRI和万g/II双酶切的杆状病毒转移质粒pVL1393(P1-2A)连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393(P1-2A3C)。3、家蚕核多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制备按GIBCO公司产品说明配制lxTC-100培养基，用2NNaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10%胎牛血清，27。C下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8感染对数生长期的细胞约50ml，感染复数为1，34天后收集病毒感染液，离心(5000rpmx10min)，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris12.1g，EDTA33.6g，KC114.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50pg/ml，50°C保温2小时，再加入35%的Sarkorsel至终浓度为1%，继续于50。C保温2小时，分别用等体积的苯酚、苯酚氯仿(1:1)氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3MNaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，一20。C放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心IO分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100plTEBuffer中，放4。C保存备用。4、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)的构建和获得4.1重组杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)的构建接种大约lxl(^细胞于15ct^培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1|Lig家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2pg重组转移质粒pVL1393(P1-2A3C)DNA和5pl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60pl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27°C培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300plFBS。27。C恒温培养45天，收集上清液用于重组病毒的筛选。4.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)的筛选和纯化接种适量细胞(约7080%)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取lml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。270C感染1小时后，吸去感染液，将2%低融点琼脂糖凝胶于60°(:水浴中融化，冷至40。C与40。C预热的2xTC—100培养基(含20XFBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27°C倒置培养35天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过23轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)(其微生物保藏号是CGMCCN0.1979)。4.3重组病毒rBmNPV(P1-2A3C)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(P1-2A3C)。4.4重组病毒的鉴定利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150/d，加入150/xl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20^1(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20/xl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为5，-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3'5'-TTACAr,cATCTrTCTTTccArTrTTrTr;AAT-:v取上述病毒基因组DNAl/xl进行PCR扩增，反应条件为94。C变性5min、94°Clmin、58。Clmin、72°Clmin，30个循环，最后72°C延伸5min。取15/il反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。5、P1-2A3C基因在家蚕中的表达本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕，每头蚕接种约1.0xl()SrBmNP(P1-2A3C)，4-5天后收集发病蚕血淋巴，-20°〇冻存以进行双抗体夹心￡1^18八法检领"96孔酶标板用兔抗口蹄疫阳性血清包被，4。C过夜。脱脂奶粉封闭后，将口蹄疫阳性抗原、感染rBmNPV(P1-2A3C)家蚕收获的蚕血、感染Bm-NPV—ZJ8的家蚕收获的蚕血做2倍梯度稀释。37。C作用lh后，洗涤，加入豚鼠抗FMDV阳性血清，37。C作用lh。洗涤后加入HRP-兔抗豚鼠IgG，37°C作用lh。加入底物OPD-H202，于37匸作用15min，用终止液结束反应，于入492nm处测定OD值。结果如图l所示从感染rBmNPV(P1-2A3C)的家蚕中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。6、P1-2A3C基因在家蚕蛹体中表达本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，饷食后48h选择平均体重相同的家蚕，每头蚕蛹接种约1.0xl()SrBmNPV(P1-2A3C)，4-5天后收集发病蚕蛹血淋巴，-20°C冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。结果如图2所示从感染rBmNPV(P1-2A3C)的家蚕蛹中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原的OD值变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。7、口蹄疫抗原的纯化称取Sephadex干凝胶，溶胀处理后装于玻璃色谱柱中，以洗脱液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/LNaCl，pH8.0)洗至基线稳定。分别将上述5和6中所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片。取上述样品上样，取适量洗脱液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脱液，收集至第一峰下降，将所收集的蛋白洗脱液合并，得纯化的口蹄疫抗原。8、动物免疫实验及病毒攻击保护实验将收集的纯化抗原与等体积油佐剂混合。取3ml/头颈部肌肉免疫牛。实验组免疫5头牛，设立2头牛的对照组。在注射疫苗前，采用世界动物卫生组织标准方法液相阻断ELISA法对侯选牛进行抗体水平的检测，挑选其效价低于1/8的牛在兰州兽医研究所的隔离动物房进行实验收集免疫后21d的牛血清，采用液相阻断ELISA法检测牛血清中的抗FMDV抗体水平，所有的实验动物都取得了较高的抗体水平。采用10,000BIDm)的同源病毒接种牛舌，连续观测10d，检测唇部及四蹄发病情况，实验组的5头动物获得了全部保护，而对照组动物全部发病。实施例2口蹄疫抗原的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验1、口蹄疫病毒全长ORF的克隆和序列分析设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出口蹄疫病毒全长ORF(SEQIDNO:3)。所设计的扩增全长ORF的扩增引物为，ORF:5，-GCGACTAGTACCATGGAATTCACACTTCACAACGGTGAG-3'，酶切位点ORF:5，-ATAGCGGCCGCAGGGATTATGCGTCACCGCACAC-3'。7VWI酶切位点从口蹄疫病毒细胞培养液中提取总RNA。将提取的总RNA用Oligo(dT)is引物在AMV反转录酶的作用下，42'C反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>PCR反应过程94。C变性10分钟；94。Cl分钟，58°C1分钟，72。C8分钟，共30个循环。最后延伸反应10分钟。2、转移载体pVL1393(ORF)的构建将中扩增得到的ORF按实施例1中1.2的方法纯化，用^el和WWI双酶切后，与经^d和双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393(ORF)。将重组质粒pVL1393(ORF)进行双向测序。ORF基因序列及氨基酸序列分别见SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。3、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)的构建和获得3.1、重组杆状病毒rBmNPV(ORF)的构建接种大约lxloe细胞于15cn^培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1pg家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2pg重组转移质粒pVL1393(ORF)DNA和5nl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60pl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27。C培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300plFBS。27。C恒温培养45天，收集上清液用于重组病毒的筛选。3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)的筛选和纯化接种适量细胞(约7080%)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取lml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27T感染l小时后，吸去感染液，将2%低融点琼脂糖凝胶于60°(:水浴中融化，冷至40°C与40°C预热的2xTC—100培养基(含20%FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27°C倒置培养35天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过23轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)(其微生物保藏号是CGMCCNO.1980)。3.3重组病毒rBmNPV(ORF)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(ORF)。3.4重组病毒的鉴定利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150^1，加入150/d(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20^1(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20/xl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为5'-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3,5，-TTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3'取上述病毒基因组DNAl/d进行PCR扩增，反应条件为94。C变性5min、94QClmin、55°Clmin、72°Clmin，30个循环，最后72°C延伸5min。取15/xl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。4、ORF在家蚕中的表达本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕，每头蚕接种约1.0x105rBmNPV(ORF)，4-5天后收集发病蚕血淋巴，-20"冻存以进行双抗体夹心￡1^18八法检测。96孔酶标板用兔抗FMDV阳性血清包被，4t:过夜。脱脂奶粉封闭后，将FMDV抗原、感染rBmNPV(ORF)家蚕收获的蚕血、感染Bm-NPV—ZJ8的家蚕收获的蚕血做2倍梯度稀释。37t:作用lh后，洗涤，加入豚鼠抗FMDV阳性血清，37。C作用lh。洗涤后加入HRP-兔抗豚鼠IgG，37。C作用lh。加入底物OPD-H202，于37。C作用15min，用终止液结束反应，于入492nm处测定OD值。结果如图3所示从感染rBmNPV(ORF)的家蚕中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原的OD值变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的10倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。5、ORF在家蚕蛹体中表达本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，饷食后48h选择平均体重相同的蚕蛹，每头蚕蛹接种约1.0xl()SpfUrBmNPV(ORF)，4-5天后收集发病蚕蛹血淋巴，-20°C冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。结果如图4所示从感感染rBmNPV(ORF)的蚕蛹中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的10倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。6、抗原纯化称取Sephadex干凝胶，溶胀处理后装于玻璃色谱柱中，以洗脱液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/LNaCl，pH8.0)洗至基线稳定。分别将4和5所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片。取上述样品上样，取适量洗脱液，流速0.3ml/min,以5min/管收集蛋白洗脱液,收集至第一峰下降，合并蛋白洗脱液，得纯化抗原。7、动物免疫实验及病毒攻击保护实验将6所收集的纯化抗原与等体积油佐剂混合。取3ml/头颈部肌肉免疫牛。实验组免疫5头牛，设立2头牛的对照组。在注射疫苗前，采用世界动物卫生组织标准方法液相阻断ELISA法对侯选牛进行抗体水平的检测，挑选其效价低于1/8的牛在兰州兽医研究所的隔离动物房进行实验。收集免疫后21d的牛血清，采用液相阻断ELISA法检测牛血清中的抗FMDV抗体水平，所有的实验动物都取得了较高的抗体水平。采用10，000BIDm)的同源病毒接种牛舌，连续观测10d，检测唇部及四蹄发病情况，实验组的5头动物获得了4头保护，而对照组动物全部发病。实施例3口蹄疫抗原的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验1、FMDVVP1基因的克隆和序列分析设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出口蹄疫病毒VP1基因。所设计的扩增VP1基因的扩增引物为，VP1上游5，-ATAGGATCCACCATGGCCACCACTACCGGCGAGTCAG-3，,万amHl酶切位点VP1下游5，-CGCGAATTCTTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3，。￡coRI酶切位点从口蹄疫病毒细胞培养液中提取总RNA。将提取的总RNA用01igo(dT^弓物在AMV反转录酶的作用下，42'C反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下表3PCR反应条件加入物体积灭菌ddH2033pi10XPCRBuffer5^12.5MmdNTP4^125MmMgCl23pi5'引物1pi3'引物1pi模板DNA2piTaq酶1(alTotal50piPCR反应过程94。C变性IO分钟；94°C1分钟，58。C1分，72°C1分钟，共30个循环。最后延伸反应10分钟。2、转移载体pVL1393(VP1)的构建按实施例1中1.2的方法纯化1所获得VP1基因片段，用SamHI和五coRI双酶切后，与经同样双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TGl，筛选得到重组转移载pVL1393(VP1)。将重组质粒pVL1393(VP1)进行双向测序。VP1基因序列及氨基酸序列分别见SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。3、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(VP1)的构建和获得3.1重组杆状病毒rBmNPV(VP1)的构建接种大约lxl(^细胞于15cmH咅养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，力口1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1jug家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2pg重组转移质粒pVL1393(VP1)DNA和5pl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60nl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27。C培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300plFBS。27。C恒温培养45天，收集上清液用于重组病毒的筛选。3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(VP1)的筛选和纯化接种适量细胞(约7080%)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取lml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27。C感染l小时后，吸去感染液，将2%低融点琼脂糖凝胶于60°(:水浴中融化，冷至40°C与40°C预热的2xTC—100培养基(含20%FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27°C倒置培养35天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过23轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(VP1)(其微生物保藏号是CGMCCN0.1975)。3.3重组病毒rBmNPV(VP1)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(VP1)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(VPl)。3.4重组病毒的鉴定利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150/il，加入150|id(O.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20pl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20Ad的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为5，画GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3'5，-TTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3'取上述病毒基因组DNAl/d进行PCR扩增，反应条件为94。C变性5min、94°Clmin、55。Clmin、72°Clmin，30个循环，最后72°C延伸5min。取15/il反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。4、VP1在家蚕中的表达本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。铜食后48h选择平均体重相同的家蚕，每头蚕接种约1.0xlO、BmNPV(VP1)，4-5天后收集发病蚕血淋巴，-201冻存以进行双抗体夹心￡^8入法检测。结果如图5所示从感染rBmNPV(VP1)的家蚕中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律阳性与对照传统细胞苗病毒抗原变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。5、VP1基因在家蚕蛹体中表达本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，饷食后48h选择平均体重相同的蚕蛹，每头蚕蛹接种约1.0xl()SrBmNPV(VP1)，4-5天后收集发病蚕血淋巴，-20°(3冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。结果如图6所示从感染rBmNPV(ORF)的家蚕中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。6、抗原纯化称取Sephadex干凝胶，溶胀处理后装于玻璃色谱柱中，以洗脱液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/LNaCl，pH8.0)洗至基线稳定。分别将4和5所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片。取上述样品上样，取适量洗脱液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脱液,收集至第一峰下降，合并蛋白洗脱液，得纯化抗原。7、动物免疫实验及病毒攻击保护实验将4或5收集的蚕血淋巴经超声波破碎，弃细胞碎片后，与等体积油佐剂混合。取3ml/头颈部肌肉免疫牛。实验组免疫5头牛，设立2头牛的对照组。在注射疫苗前，采用世界动物卫生组织标准方法液相阻断ELISA法对侯选牛进行抗体水平的检测，挑选其效价低于1/8的牛在兰州兽医研究所的隔离动物房进行实验收集免疫后21d的牛血清，采用液相阻断ELISA法检测牛血清中的抗口蹄疫抗体水平，所有的实验动物都取得了较高的抗体水平。采用10，000BID5c的同源病毒接种牛舌，连续观测10d，检测唇部及四蹄发病情况，实验组的5头动物有4头得到保护，而对照组动物全部发病。序列表<110〉中国农业科学院兰州兽医研究所中国农业科学院生物技术研究所〈120〉一种口蹄疫抗原的制备方法<130>P0278〈160〉6<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211〉3024<212〉醒〈213〉Foot-and-mouthdiseasevirus〈220〉<221〉CDS<222>(1).■(3024)〈223〉〈400〉1ggagccgggcaatecageccggcgactgggteacagaaccagteaggc48GlyAlaGlyGinSerSerProAlaThrGlySerGinAsnGinSerGly151015aacactggaageateateaacaactactacatgcagcaataccagaac%AsnThrGlySerlielieAsnAsnTyrTyrMetGinGinTyrGinAsn202530tecatggacacacaacttggagacaacgetattageggaggctecaac144SerMetAspThrGinLeuGlyAspAsnAlalieSerGlyGlySerAsn354045gaaggttecactgacaccacctecacacacacaaacactacccaaaac192GluGlySerThrAspThrThrSerThrHisThrAsnThrThrGinAsn505560aacgattggttctcgcgcctggetagttecgccttcageggactgttc240AsnAspTrpPheSerArgLeuAlaSerSerAlaPheSerGiyLeuPhe65707580ggcgcgcttctggetgacaagaaaacggaagaaacaactttgcttgaa288GlyAlaLeuLeuAlaAspLysLysThrGluGluThrThrLeuLeuGlu859095gaccgcatecttaccaccaggaacggccacacgacgtcgacgacccag336AspArglieLeuThrThrArgAsnGlyHisThrThrSerThrThrGin10010^110tcgagegttggcgtgacatacggttacgetgtggetgaggacgcggta謝SerSerValGlyValThrTyrGlyTyrAlaValAlaGluAspAlaVal115120125teaggacctaacaccteaggtetcgagacccgtgttcaacaagcggag432SerGlyProAsnThrSerGlyLeuGluThrArgValGinGinAlaGlu130135140eggttcttcaaaaagcacttgtttgattggacaccgaatttggetttt480ArgPhePheLysLysHisLeuPheAspTrpThrProAsnLeuAlaPhe145150155160ggatactgtcactacctggaaetccccactgagcacaaaggtgtgtat528GlyTyrCysHisTyrLeuGluLeuProThrGluHisLysMyVaiTyr165170175ggcagtetcatggactegtacgcctacatgagaaacgggtgggacata576GlySerLeuMetAspSerTyrAlaTyrMetArgAsnGlyTrpAsplie180185190gaggtgactgetgttggaaaccagttcaacggcggttgtetccttgtt624GluValThrAlaValGlyAsnGinPheAsnGlyGlyCysLeuLeuVal195200205gcacttgtgccagagctgaagagecttgacacteggcagaaataccaa672AlaLeuValProGluLeuLysSerLeuAspThrArgGinLysTyrGin210215220ctgacccttttcccccatcagttcateaacccacgcaccaacatgacg720LeuThrLeuPheProHisGinPhelieAsnProArgThrAsnMetThr225230235240gcccacateaacgtgccctttataggtgttaacaggtatgaccagtac768AlaHislieAsnValProPhelieGlyValAsnArgTyrAspGinTyr245250255atgetccacaaaccgtggacgcttgttgtgatggtggtggccccaetc816MetLeuHisLysProTrpThrLeuValValMetValValAlaProLeu260265270actgtcaagactggtggctctgaacagateaaggtctacatgaatgca864ThrValLysThrGlyGlySerGluGinlieLysValTyrMetAsnAla275280285gcaccgacctacgtacacgtggcaggggagetcccctegaaagagggg912AlaProThrTyrValHisValAlaGlyGluLeuProSerLysGluGly290295300atagt"tcccgttgcgtgtgcggacggttacggtaacatggtgaccacg%0lieValProValAlaCysAlaAspGlyTyrGlyAsnMetValThrThr305310315320gacccgaaaactgccgacccagtgtacgggaaagtgttcaaccccccc1008AspProLysThrAlaAspProValTyrGlyLys々aiPheAsnProPro325330335eggacgaatetccccgggcgcttcacaaacttccttgatgtcgcggag1056ArgThrAsnLeuProGlyArgPheThrAsnPheLeuAspValAlaGlu340345350gcgtgtccaacct"tcetccgcttcggagaagtaccatttgtgaagacg1104AlaCysProThrPheLeuArgPheGlyGluValProPheValLysThr355360365gtgaactctggtgaccgtttgetagccaagtttgatgtctegetcget1152ValAsnSerGlyAspArgLeuLeu人laLysPhe人sp々alSerLeuAla370375380gcgggccatatgtecaacacctacttggetggtctggcgcagtactac1200AlaGlyHisMetSerAsnThrTyrLeuAlaGlyLeuAlaGinTyrTyr385390395400acacagtacagtggtaccatgaatgttcacttcatgttcaccgggccc1248ThrGinTyrSerGlyThrMetAsnValHisPheMetPheThrGlyPro405410415acggatgccaaggcceggtacatggtggcctacattcctcccggcatg1296ThrAspAlaLysAlaArgTyrMetValAlaTyrlieProProGlyMet420425430acaccgcccacagaccctgagcgcgccgcccactgtatecactecgagThrProProThrAspProGluArgAlaAlaHisCyslieHisSerGlu4354404451344tgggacactggtetaaactecaaattcaccttttecataccctacetcTrpAspThrGlyLeuAsnSerLysPheThrPheSerlieProTyrLeu4504554601392tctgetgetgactacgcatacaccgcctctgacacggcggagaccacaSerAlaAlaAspTyrAlaTyrThrAlaSerAspThrAlaGluThrThr4654704754801440agtgtgcaaggatgggtgtgcatetaccagateacccacggcaaggetSerValGinGlyTrpValCyslieTyrGinlieThrHisGlyLysAla4854904951488gaaggagacgcactggtcgtttctgtcagegccggcaaagactttgagGluGlyAspAlaLeuValValSerValSerAlaGlyLysAspPheGlu5005055101536tttcgcctgcccgttgacgcgcgceggcaaaccaccactaccggcgagPheArgLeuProValAspAlaArgArgGinThrThrThrThrGlyGlu5155205251584teagcagacccggtaacaaccacggtcgagaactacggaggagaaactSerAlaAspProValThrThrThrValGluAsnTyrGlyGlyGluThr5305355401632cagacagccaggeggct"tcacactgatgttgccttcgttcttgacaggGinThrAlaArgArgLeuHisThrAspValAlaPheValLeuAspArg5455505555601680tttgtgaaaetcactgcacccaagaacattcagacccttgacetcatgPheValLysLeuThrAlaProLysAsnlieGinThrLeu人spLeuMet'5655705751728caaattcccteacacacgctggttggagcactgctgeggtctgcgacgGinlieProSerHisThrLeuValGlyAlaLeuLeuArgSerAlaThr5805855901776tactacttcteagacctggaggttgcgattgtccacacaggcccgateTyrTyrPheSerAspLeuGluValAlalieValHisThrGlyProlie5956006051824acctgggtgcccaacggctegcccaaggatgetetagacaaccagaccThrTrpValProAsnGlySerProLysAspAlaLeuAspAsnGinThr6106156201872aacccaactgcctaccagaagcaacctgtcacccgcttggcgetccccAsnProThrAlaTyrGinLysGinProValThrArgLeu大laLeuPro6256306356401920tacaccgccccccatcgtgtgctggcgacagtgtacaacgggaagacgTyrThrAlaProHisArgValLeuAlaThrValTyrAsnGlyLysThr6456506551968acgtacggggaaacaaccgcgeggcgtggcgatacggcggcccttgcaThrTyrGlyGluThrThrAlaArgArgGlyAspThrAlaAlaLeuAla6606656702016caaagactgagtgggeggctgcccaccteatttaactacggcgetgtaGinArgLeuSerGlyArgLeuProThrSerPheAsnTyrMyAla寸al67568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