专利名称：系统置换多聚酶链反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及多聚酶链反应PCR基因扩增技术的进一步发展，分子检测应用的一种新PCR途经，尤其是将基因检测PCR系统置换成数十套独立的DNA指示PCR系统轮换使用。
背景技术：
在1983年的一个晚上，K.B.Mullis不经意间创造了PCR的奇思妙想(The unusual originof the polymerase chain reaction，Sci，Am.26256，1990)，并经PE-Cetus公司许多改进而实用。随着从嗜热水细菌来源的热稳定DNA聚合酶的应用(Saiki R.K.，et.al，Science 239487-491，1988)，PCR技术逐渐成熟、高效、自动化。广泛应用于基因克隆、测序、分子检测等众多领域，奠定了现代分子生物学的坚实基础。并逐渐衍生了众多PCR应用技术及改良操作(Molecular Cloning，3rd Edit)。
随着人类等各种基因组测序的完成，并进入功能蛋白组时代，分子PCR检测应用越来越广泛，已渗透到生物学的每一个领域。尤其自1989年开始运用于临床检验以来，PCR以其简便、快速、灵敏的优势成为临床实验诊断学的技术热点，已应用于肝炎、肺部感染和性病等传染性疾病及遗传病、肿瘤、优生优育等领域。然而PCR的基因指数式扩增方式太过于灵敏，模板2的20次幂就大约扩增一百万倍。临床应用亟待解决扩增基因产物再污染的假阳性问题。目前一般通过单独的PCR实验室，紫外照射的超净工作台，使用一次性手套和一次性过滤Tip头来控制；进一步也可通过加尿嘧啶N-糖基化酶切割用dU代替dT的PCR产物中的尿嘧啶糖苷键来降解PCR产物防止再污染(Hartley J.L.et.al，1993 PCR Methods App1.3s10-s14)，但只能切割降解大部分PCR产物；这些措施对高灵敏度PCR而言难以完全有效。
发明内容
为了克服PCR检测易污染，假阳性高的不足。本发明提供一种系统置换多聚酶链反应(System Substitute Polymerase Chain Reaction，ssPCR)，通过置换PCR工作系统规避PCR扩增产物的再污染。
系统置换多聚酶链反应，其特征在于通过部分互补序列的杂交，将待测PCR的扩增转换成包括一套以上的指示PCR系统扩增，所述每套指示PCR系统扩增的是无关的指示模板与待测模板中不同区域保留序列所形成的杂交互补序列，所述指示模板的基因序列是与待测模板无关的基因序列(6-8base碱基以上连续相同为相关，反之无关)。
所述待测模板为双链DNA、单链RNA或DNA-RNA杂交双链，所述单链RNA包括mRNA，所述待测模板保留序列长度为20-200bp。
所述待测模板保留序列长度优选为30-50bp。
所述指示模板为双链DNA，序列长度为80-1000bp。
所述指示模板序列长度优选为80-150bp。
该反应还包括荧光分子信标，所述荧光分子信标序列与待测模板保留序列杂交或与指示模板序列杂交。
本发明根据现有的PCR系统，设计了一种新的多聚酶链反应途径即系统置换多聚酶链反应(ssPCR)(见图1)，该系统中包括有数十套指示PCR系统，以指示PCR系统来替换待测的PCR系统工作。系统置换多聚酶链反应的原理及操作如下以待测标本的基因为待测模板；选取一段无关的基因序列(约80-150bp)作为指示模板1，另一段无关序列为指示模板2，……以此类推指示模板3，指示模板4，……等等。待测模板除留一小段序列(30-50bp)作为杂交保留序列外绝大部分序列置换成指示模板序列。PCR扩增的只是指示模板全序列和待测模板保留的30-50bp的杂交序列。每套指示PCR系统选取待测模板不同区域作为保留序列，即每套指示PCR选取的保留序列是互不相同的。所以每套指示PCR系统的基因序列是完全各不相同、相互独立的。
待测模板根据长短不同选取一系列的长30-50bp的较保守没有立体结构的序列作为保留杂交序列，保留序列1对应指示模板1，保留序列2对应指示模板2，……以此类推，等等。每个保留序列又分成断开的左半部分L和右半部分R。右半部分R序列(以有意义链序列)3’末端加在指示模板5’端20bp序列前面合成指示模板扩增5’端引物，左半部序列(以反意义链序列)3’末端加在指示模板3’端20bp序列后面合成指示模板扩增3’端引物。以此对引物和用pfu酶扩增平末端的无关序列的指示模板生成两端包含部分待测模板保留序列的指示模板加尾DNA，并用PCR产物纯化柱纯化。
待测模板一指示模板杂交连接酶反应指示模板PCR与纯化的待测标本杂交，如有阳性模板则通过其保留序列与指示模板加尾DNA两头末端序列杂交，使指示模板两侧5’末端和3’末端因结合待测模板杂交序列而相互首尾衔接，并经T4连接酶修复缺口而生成环状指示模板。而未杂交的双链指示模板PCR链的首尾平末端的连接效率较双链中单链的缺口修复效率低太多，并因加入过量的平端8-16bp无关序列的双链Oligo寡聚物而几乎全被抑制。结果只有阳性标本模板有杂交序列帮助的指示模板才能形成环状DNA，而阴性标本则只存在线性指示模板DNA。
环状指示模板反向PCR用指示模板正中间的序列作为工作指示PCR引物，向外延伸反向扩增环状模板，间接指示待测模板的存在与多少。而非环状模板DNA则反向中间断开而扩增不出。PCR产物用Agarose凝胶检测分析或荧光定量分析。
本发明系统置换多聚酶链反应可应用于基因点突变和大片段变异检测中。待测基因一小部分序列与指示模板加尾DNA两侧末端序列杂交并经T4连接酶使其首尾相连，再反向扩增指示模板，杂交必须序列互补匹配才能连接并扩增，通过设置指示模板DNA首尾两端的序列，适用检测基因的变异，包括基因点突变和大片段变异的检测。
操作流程(一)待测标本的纯化(1)DNA样本的纯化等量酚-氯仿抽提，商业DNA纯化柱纯化(详细步骤按Qiagen说明书进行)1)加100-200ul样本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提，漩涡振荡，台式离心机离心最高速5分钟。
2)上清100-200ul转移至新EP管中，加等量氯仿，振荡，离心。
3)上清加4倍的Qiagen结合缓冲液移至纯化柱，洗涤缓冲液洗柱两次，加50uldH2O洗脱收集纯化的样本。
(2)RNA样本的纯化异硫氰酸胍一步法提取总RNA(Chomczynski，P.et，al.1987 Anal.Biochem.Vol 162，156)。
样本于EP管中加1ml的Trizole(1ml 4M异硫氰酸胍，1ml酚，0.1ml 2M醋酸钠PH4.0)变性液裂解，强烈漩涡振荡或用针头反复抽吸，再加200ul氯仿振荡，离心5分钟，取上清加等量0.5ml异丙醇置-20℃2小时再离心沉淀，70％乙醇洗涤一次，加50ul DEPC处理的dH2O溶解。
Oligo(dT)顺磁珠纯化mRNA一般没有必要纯化mRNA，如需要更纯的模板，按Promega说明书进行。
(二)指示模板加尾DNA PCR的准备a)合成指示PCR引物5’端引物首先待测模板保留杂交序列右半部分有意义链15-25base，再加指示模板5’端最开始的20base有意义链序列。
3’端引物首先待测模板保留杂交序列左半部分反意义链15-25base，再加指示模板3’端最开始的20base反意义链序列。
b)PCR扩增指示模板并用商业PCR产物纯化柱纯化。
无关序列指示DNA1ul5’端指示引物Primer(5uM) 1ul3’端指示引物Primer(5uM) 1ul10×pfu buffer 5ul10mM dNTP 1ulpfu1uldH2O 40ul50ul95℃变性5分钟，25个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25个循环后72℃10分钟。
Qiagen PCR产物纯化试剂盒纯化。
(三)合成平端双链抑制Oligo寡聚物Blast search搜寻一段与待测模板和指示DNA都无关((4base碱基以上连续相同为相关，反之无关)的短序列，合成一段8-16base单链Oligo，再合成一段与之序列互补反意义链的8-16base单链Oligo，双链Oligo(100uM)混合，90℃加热5分钟，冷却至室温贮存。
(四)合成反向PCR引物取指示DNA正中间约40bp长的序列，右半部分20base长的有意义链序列作为5’端反向PCR引物，左半部分20base长的反意义链作为3’端反向PCR引物。
(五)待测标本与指示模板加尾DNA杂交纯化的待测样本 2ul纯化的指示模板加尾DNA10ulT4连接酶缓冲液 5ul抑制Oligo(100uM) 1uldH2O32ul50ul95℃变性5分钟再55℃10分钟。
(六)连接酶反应取上述(五)杂交反应液50ul加T4连接酶1ul，16℃温育10分钟-2小时。
(七)反向PCR杂交连接酶反应液2ul(或纯化待测样本1ul+指示模板加尾DNA 9ul)
5’端反向引物Primer 1ul3’端反向引物Primer 1ul10mM dNTP 1ul10×Taq buffer 5ulTaq 1uldH2O 39ul/30ul50ul94℃变性5分钟，20-30个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25个循环后72℃10分钟。
如果此步骤(七)再加入1ul耐热连接酶和抑制Oligo，可省去步骤(五)，(六)杂交连接酶反应。
(八)PCR产物分析1.5％琼酯糖凝胶agarose电泳分析或在反向PCR液中加1ul荧光分子信标，荧光PCR扩增实时检测。
本发明系统置换多聚酶链反应(ssPCR)优点(1)能避免PCR扩增产物的再污染，待测标本的有限几次PCR转换成数十套互不相同的指示PCR系统轮换使用。一套污染了就换一套工作。
(2)简化RNA分子检测，RNA不需要逆转录成cDNA就可直接置换成指示DNA扩增工作，特别适合大量RNA病毒的分子检测。
(3)尤其适合基因突变遗传病检测，因为标本保留序列与指示模板加尾DNA杂交的缺口两侧要完全匹配才能修复。如果指示模板加尾DNA 5’端和3’端设置为突变序列就只能扩增突变了的基因。较检测基因突变的连接酶链反应LCR技术更灵敏、简便。
(4)较Southern和Northern Blot分子杂交灵敏、简便将分子标记探针杂交检测转换成指示PCR，扩增更灵敏，省去了电泳、转移等操作，更简便。
图1本发明系统置换多聚酶链反应示意图(1)待测模板示意图左侧长直线代表模板，粗线为有意义链或RNA，细线为反意义链。
(2)指示模板右图上断开的双环代表一套指示模板加尾DNA，包括环线代表的一段与待测基因无关的序列和两端的与待测模板互补的保留序列(短直线部分)。
(3)左侧代表阳性反应待测模板与指示模板加尾DNA序列杂交后经T4连接修复缺口，形成环状指示DNA，并被反向PCR扩增。
(4)右侧代表阴性反应缺口指示DNA被过量平端双链Oligo竞争抑制，不能被T4连接酶环化，没有扩增。
图2本发明在乙型肝炎HBsAg基因检测中的扩增结果其中，1为阴性对照，2为阳性，其余为标本。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例.乙型肝炎HBsAg基因检测(1)临床11例标本DNA的纯化(按Qiagen说明书进行)1)加100-200ul样本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提，漩涡振荡，台式离心机离心最高速5分钟。
2)上清100-200ul转移至新EP管中，加等量氯仿，振荡，离心。
3)上清加4倍的Qiagen结合缓冲液移至纯化柱，洗涤缓冲液洗柱两次，加50ul dH2O洗脱收集纯化的样本。
(2)指示模板加尾DNA PCR的准备1)选取乙型肝炎病毒HBs Ag aa124-138基因序列5’-gc acg att cct gct caa gga acc tct atg ttt ccc tct tg-3’3’-cg tgc taa ggt cga gtt cct tg-5’作为保留序列。
2)选取血吸虫谷氨酸S转移酶GST基因起始100bp序列5’-cctatac taggttattg gaaaattaag ggccttgtgc aacccactcg acttcttttg gaatatcttg aagaaaaata tgaagagcatttgtatgagc gcg-3’作为指示模板序列。
3)合成指示模板5’端引物待测模板保留序列右半部分有意义链18base加指示模板5’端最开始的18base有意义链序列。
5’-c tct atg ttt ccc tct tg cctatac taggttattg g-3’4)合成指示模板3’端引物待测模板保留序列左半部分反意义链22base加指示模板3’端最开始的19base反意义链序列。
5’-gt acc ttg agc tgg aat cgt gc cgc gctcatacaa atgctc-3’
5)PCR扩增指示加尾模板并用商业PCR产物纯化柱纯化。
pGEX-2T质粒(0.5ug/ul)1ul5’端指示引物Primer(5uM) 1ul3’端指示引物Primer(5uM) 1ul10×pfu buffer 5ul10mM dNTP1ulpfu 1uldH2O40ul50ul95℃变性5分钟，25个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25个循环后72℃10分钟。
PCR产物50ul加4倍的200ul Qiagen结合缓冲液移至纯化柱，洗涤缓冲液洗柱两次，加50ul dH2O洗脱收集纯化的指示PCR DNA。
(3)合成平端双链抑制Oligo寡聚物取一段与待测模板和指示DNA都无关的人造短序列5’-GCGGTACCGG-3’，合成一段单链Oligo，再合成一段与之序列互补反意义链的5’-CCGGTACCGC-3’单链Oligo，双链Oligo(100uM)混合，90℃加热5分钟，冷却至室温贮存。
(4)合成反向PCR引物取GST起始100bp指示DNA正中间的序列5’-gtgc aacccactcg acttcttttg gaatatcttg-3’3’-cacg ttgggtgagc tgaag-5’右半部分19base长的有意义链序列作为5’端反向PCR引物5’-cttcttttg gaatatcttg-3’；左半部分19base长的反意义链作为3’端反向PCR引物5’-gaagt cgagtgggtt gcac-3’。
(5)待测标本与指示模板加尾DNA杂交纯化的待测乙型肝炎样本 2ul纯化的指示模板加尾DNA10ulT4连接酶缓冲液 5ul抑制Oligo(100uM) 1uldH2O32ul50ul95℃变性5分钟再55℃10分钟。
(6)连接酶反应取上述(5)杂交反应液50ul加T4连接酶1ul，16℃温育2小时。
(7)反向PCR杂交连接酶反应液2ul5’端反向引物Primer 1ul3’端反向引物Primer 1ul10mM dNTP 1ul10×Taq buffer 5ulTaq 1uldH2O 39ul50ul94℃变性5分钟，30个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25个循环后72℃10分钟。
(8)PCR产物分析PCR产物经1.8％琼酯糖凝胶agarose电泳分析，结果见附图2，实验结果为3，6，9，11，12，13号标本阳性扩增。
实验对照取上述11例临床血液标本，经科华公司ELISA抗体检测试剂盒检测6例抗HBs Ag抗体阳性，5例阴性，结果见表1。1号为阴性对照，2号为阳性对照。其余为实验标本。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 0.005 1.853 1.241 0.012 0.025 2.213 0.053 0.004 0.876 0.022 0.785 0.941B 1.235 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000从上述实验结果看，附图2与附表一ELISA检测结果一致。
权利要求
1.系统置换多聚酶链反应，其特征在于通过部分互补序列的杂交，将待测PCR的扩增转换成包括一套以上的指示PCR系统的扩增，所述每套指示PCR系统扩增的是无关的指示模板与待测模板中不同区域保留序列所形成的杂交互补序列，所述指示模板的基因序列是与待测模板无关的基因序列。
2.根据权利要求1所述的系统置换多聚酶链反应，所述待测模板为双链DNA、单链RNA或DNA-RNA杂交双链，所述单链RNA包括mRNA，所述待测模板保留序列长度为20-200bp。
3.根据权利要求2所述的系统置换多聚酶链反应，所述待测模板保留序列长度为30-50bp。
4.根据权利要求1所述的系统置换多聚酶链反应，所述指示模板为双链DNA，序列长度为80-1000bp。
5.根据权利要求4所述的系统置换多聚酶链反应，所述指示模板序列长度为80-150bp。
6.根据权利要求1所述的系统置换多聚酶链反应，其特征在于该反应还包括荧光分子信标，所述荧光分子信标序列与待测模板保留序列杂交或与指示模板序列杂交。
7.权利要求1-6任一所述系统置换多聚酶链反应在基因点突变和大片段变异检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种“系统置换多聚酶链反应”，其特征在于待测PCR系统置换成一套以上的指示PCR系统，所述每套指示PCR系统扩增的是无关的指示模板与待测模板中不同区保留的一小部分杂交序列，所述指示模板的基因序列是与待测模板无关不同源的序列。将待测标本PCR转换成数十套互不干扰独立的指示PCR系统轮换使用，一套污染了就换一套工作，避免PCR产物的再污染。指示DNA既可与待测DNA杂交也可与待测RNA杂交直接扩增，适用于RNA标本的直接检测，而且杂交匹配依赖性修复扩增使其适合基因突变遗传病的检测。与荧光分子信标(Molecular beacon)联用还适用于待测模板的定量测定。
文档编号C12Q1/68GK101063159SQ200710107828
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月17日 优先权日2007年5月17日
发明者江洪, 江必胜, 廖同兵 申请人:北京万达因生物医学技术有限责任公司 被以下专利引用 (3),