专利名称：一种乳清酸核苷-5＇-磷酸脱羧酶基因及其蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因w"3，具体地说是圆红 冬孢酵母的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因的克隆、重组载体构建，以及在 基因工程研究中的应用。
背景技术：
生命体是由核酸、蛋白质等生物大分子组成的有机体。其中，核苷酸 是核酸的组成单位，在体内分布广泛并具有多种生物学功能。核苷酸的正 常生物合成是生命特征维持的前提，在没有补救途径的情况下，核苷酸生 物合成异常或中止将会导致生命体生命特征的丧失。
Al^^^一乳清苷酸證脱羧,，尿苷酸UTP 合虱酖^ "~^0MP (圃) 丽P ~^CTP
如上图所示，酵母嘧啶核苷酸的从头生物合成以谷氨酰胺为原料，经多歩 生物催化生成乳清苷酸(OMP)，再由OMP脱羧酶催化脱羧生成尿苷酸 (UMP)，后者进一步转化生成尿苷三磷酸(UTP)和胞苷三磷酸(CTP) (Flynn PJ, Reece RJ. Activation of transcription by metabolic intermediates of the pyrimidine biosynthetic pathway. Mo/. Ce〃肠/. 1999, 19(1): 882-888; Jund R, Lacroute F. Regulation of orotidylic acid pyrophosphorylase in 5"acc/^rawyces cewv/Wae. /5a"e"W. 1972, 109(1): 196-202)。酵4的OMP 脱羧酶(URA3)通常由Mra3基因编码，是嘧啶生物合成所必需的酶；若 OMP脱羧酶功能缺失，嘧啶生物合成途径将中断，在没有外源尿嘧啶补给 条件下酵母无法存活。
乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因Wra3做为一种选择性标记基因，常 用于酿酒酵母、假丝酵母、克鲁维酵母和裂殖酵母等酵母菌的遗传操作或 遗传操作系统的构建(Alani E, Cao L, Kleckner N. A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains. Genetics 1987, 116: 541—545; Francois F, Chapeland-Leclerc F, Villard J， et al. Development of an integrative transformation system for the opportunistic pathogenic yeast using URA3 as a selection marker. Yeast 2004, 21(2): 95-106; Ngan WY, Nga BH, Pridmore D, et al. Transformation of EWowyces伸w/Zger based on its gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase. Gene 2000, 254(1-2): 7-103 ; Hirashima K, Iwakil T, Takegawa K, et al.A simple and effective chromosome modification method for large-scale deletion of genome sequences and identification of essential genes in fission yeast. 7Vwc/e/c力c油i^ea/r/ , 2006,34(2): ell)。如Invitrogen公司(美国，加利福尼亚州)推出的载体pYES2/CT 和pYC2/CT均携带酿酒酵母野生型"ra3基因序列；而该公司用于蛋白质表 达的工程菌株INVScl则不能正常产生乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶，具有尿 嘧啶营养缺陷的表型(www.invitrogen.com)。
一般来讲，通过部分或全部缺失"ra3基因可构建乳清酸核苷-5'-磷酸脱 羧酶功能缺失的工程菌株，即尿嘧啶营养缺陷型菌株；而"ra3基因连接到 载体的适当位置后，就可以作为负向选择标记基因进行遗传操作(NganWY, Nga BH, Pridmore D， et al. Transformation of五"tio，cas based on its
gene for orotidine-5'—phosphate decarboxylase. Gene 2000, 254(1—2): 7-103)， ^ 用于向尿嘧啶营养缺陷型菌株中引入新基因，构建各种工程菌株。而且， 工程菌株构建时不要求载体携带的"ra3基因来源于相同微生物种属。
圆红冬孢酵母AS 2.1389是一种生产油脂能力很强的酵母菌，其胞内油 脂可达到菌体干重的70%以上(Li Y, Zhao Z, Bai F. High-density cultivation of oleaginous yeast朋ot/osporW謂Y4 in fed-batch culture. Enzyme Microb. Technol. 2007, 41(3): 312-317)。当前圆红冬孢酵母遗传背景不清楚， 缺乏相应的遗传操作系统。关于圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基 因的信息尚没有公开报道。
发明内容
本发明涉及自圆红冬孢酵母分离得到的一种乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶 基因wra3及其编码蛋白和重组载体；具体来说，是一种来源于圆红冬孢酵 母AS 2.0389的乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶新基因Rt-t/ra3的克隆和生物功能 分析，以及该基因在构建重组载体和构建基因工程菌株领域的应用。
为实验上述目的，本发明采用的技术方案为
结合利用简并聚合酶链式反应(PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE) 的方法，以圆红冬孢酵母AS 2.0389总RNA为模板，经RT-PCR得到乳清 酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因Rt-wra3，其cDNA具有如序列表SEQIDNO: 1 所示序列，其基因组DNA具有如序列表SEQIDNO: 3所示序列。
本发明提出的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因Rt-wra3编码的蛋白，其 氨基酸具有如序列表SEQIDNO: 2所示序列。
本发明利用分子克隆方法构建获得新型重组酵母/大肠杆菌穿梭载体 pYES2/CT-Rt-ura3，简要过程如下经无限制性酶切克隆法(RF cloning) 操作，将Rt-"ra3基因的开放阅读框(ORF)完全置换酿酒酵母/大肠杆菌穿 梭载体pYES2/CT所携带"ra3基因的ORF。可以用于补偿营养缺陷型酿酒 酵母菌BY4741的嘧啶生物合成途径，使构建的工程菌在不含尿嘧啶的人工 培养基中正常生长。将Rt-wra3基因用做一种营养缺陷型标记基因或反选择 标记基因，可构建新的酵母遗传操作系统及新的重组工程菌株。
本发明根据已获得的"ra3的DNA序列(如序列表SEQ ID NO: 3所 示)，利用PCR介导的基因一步灭活法构建圆红冬孢酵母营养缺陷型菌株。其操作过程为-
1. 本发明所选择的圆红冬孢酵母AS 2.1389，购自中国普通微生物菌种 保藏中心(CGMCC)。根据NCBI已公布的来源于其它物种的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶保守氨基酸序列(图7)，设计一对简并引物用于扩增圆红冬孢 酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因片段。以圆红冬孢酵母总RNA (图 1)为模板，经RT-PCR分别得到简并PCR产物(图2A)， 5'-RACE产物(图 2B)， 3'-RACE产物(图2C)，和全长cDNA扩增产物(图2D)。所有PCR 产物克隆于pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，转化￡. co//DH5a感受态 细胞(参照分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学 出版社出版)。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取、PCR鉴定 和测序分析。测序结果表明获得一种亲if的wra3基因，命名为Rt-wra3，其 cDNA如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
2. 以圆红冬孢酵母AS 2.1389的基因组DNA为模板，根据获得的圆红 冬孢酵母cDNA序列设计两条引物ura3-fUll-sense和ura3-fUll-anti，按照常 规方法进行PCR扩增(参照分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄 培堂等译，科学出版社出版)，得到Rt-"ra3基因对应的基因组DNA产物， 大小约为1.0kb (图3)，其序列如序列表中SEQIDNO: 3所示。
3. 利用Rt-wra3基因信息设计两条引物ura3-RF-sense和ura3-RF-anti， 参,照文献方《去(Van den Ent, F.， Lowe, J.， 2006. RF cloning: A restriction-free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67, 67-74)，构建重组载体pYES2/CT-Rt-ura3 (图4和图5)。重组载体 pYES2/CT-Rt-ura3电击转化酿酒酵母BY4741 (购自ATCC，为全基因组测 序完成酿酒酵母菌株S288c的营养缺陷菌株，基因型a; /eWAO; wra3A。感受态细胞获得重组菌株。
4. 携带有载体pYES2/CT-Rt-ura3的重组酿酒酵母BY4741菌株进行功 能性表达分析，表明Rt-"m3可以补偿URA3营养缺陷，重建酿酒酵母 BY4741嘧啶生物合成途径，菌株在在不含尿嘧啶的SD培养基上正常生长
(图6)。
5. 参照文献(Baudin A, Ozier-Kalogeropoulos O, Denouel A, et al. A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res， 1993， 21(14): 3329-3330)所述PCR介导的基因 一步灭活法构建圆红冬孢酵母营养缺陷型菌株。参考Rt-"ra3的DNA序列
(如序列表SEQIDNO: 3所示)，设计两对引物，通过两轮PCR扩增获得 两端各携带90 bp左右同源重组臂的"ra3基因敲除盒，通过连续敲除方法 转化圆红冬孢酵母感受态细胞，经筛选获得URA3营养缺陷型圆红冬孢酵 母菌株。
6. 本发明中，构建工程菌株所利用的转化方法包括以下步骤
a.接单菌落到YEPD (YPD)培养基中，28 。C或30 。C振荡培养(12-16h);
b. 按1:50-1:100比例将过夜培养液转接至新鲜YEPD (YPD)培养基 中，28 。C或30 。C振荡培养至OD6o。为1.2-1.5左右，以下所有操作置冰上 进行； 一
c. 3000-5000 rpm离心5 min，收集菌体；
d. 用等体积(起始菌液体积)的0。C的超纯水洗涤，3000-5000 rpm离 心5min，收集菌体；
一 e.用1/2体积(起始菌液体积)的0 t:的超纯水洗涤，3000-5000 rpm 离心5 min， 收集菌体；
f. 用10 ml 1 M山梨醇洗涤1次，3000-5000 rpm离心5 min，收集菌体， 用10 ml 1 M山梨醇再洗涤1次，3000-5000 rpm离心5 min，收集菌体，菌 体沉淀悬浮于l/6体积1M山梨醇中，取100W细胞和小于5^体积(5-10 吗)的DNA混合，加入到预冷至0 °C的电转杯中；
g. 电击参数0°C， 1.5kv， 200Q， 25(iF，电击时间4.5-10毫秒；
h. 立刻加入1 ml 1 M山梨醇，30 。C温浴1 h;
i. 取200 ^电转液涂不含尿嘧啶的SD选择平板或G418/SD选择平板。 本发明的优点和有益效果
本发明涉及的Rt-w"3基因来源于高产油脂酵母菌圆红冬孢酵母AS 2.1389，其胞内油脂可达到菌体干重的70%以上。如前所述，当前圆红冬孢 酵母遗传背景不清楚，缺乏相应遗传操作系统。因此，Rt-"ra3基因可作为 自身来源的营养标记基因或反选择标记基因，用于构建圆红冬孢酵母遗传 操作系统，或用于其菌株改良。通过建立圆红冬孢酵母营养缺陷型宿主菌， 为后续遗传操作奠定基础，并可进一步借助代谢工程方法提高油脂发酵的 生产强度，增加其利用廉价碳源的能力，降低生产成本，提高微生物油脂 技术的竞争力。同时，携带Rt-wra3基因的载体pYES2/CT-Rt-ura3也可应 用在其它真核微生物的基因工程操作中。
图1为圆红冬孢酵母AS 2.1389总RNA电泳结果。
图2为圆红冬孢酵母AS 2.1389来源的Rt-wra3基因简并PCR结果 (A)、 5'-RACE结果(B)、 3'-RACE结果(C)和Rt-"ra3全长cDNA扩 增结果(D)。
1:目的基因；M: DNA分子量标准(购自北京舟鼎国)。
图3为圆红冬孢酵母AS 2.1389 ura3的基因扩增产物。1:目的基因； M: DNA分子量标准(购自北京舟鼎国)。
图4为含有Rt-wra3基因的重组穿梭载体pYES2/CT-Rt-ura3的RF克隆
扩增结果。1:目的基因；M: DNA分子量标准(购自北京舟鼎国)。
图5为含有Rt-wra3基因的重组穿梭载体pYES2/CT-Rt-ura3的构建流 程图。
图6为穿梭载体pYES2/CT-Rt-ura3的酿酒酵母BY4741重组菌株在不含尿嘧啶的SD培养基上培养2天后出现的转化子菌落。证明圆红冬孢酵母
AS 2.1389来源的Rt-wra3基因产物可以补偿酿酒酵母BY4741的URA3营
养缺陷，具有乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶的功能。
图7为NCBI已公布的来源于6种不同物种的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧 酶的氨基酸序列比对结果，黑色方框内序列表示用于设计简并引物的保守 氨基酸序列。
图8为圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶URA3的结构模型，其 表明三维结构正确。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不 以任何形式限制本发明。
实施例l:圆红冬孢酵母AS 2.1389总RNA的提取
将新鲜圆红冬孢酵母兄tora/ozW^ AS 2.1389由斜面接种到50 ml YEPD 液体培养基中，于30 "C摇床培养12 h，再以1:25的体积比例将菌液分别转 接到100 ml YEPD液体培养基中，于30 。C摇床培养12 h达对数生长期。在 4。C下，4000 rpm离心5 min，收集菌体，用液氮迅速冷冻菌体，研磨破壁。 使用TaKaRa公司RNAiso试剂盒，并按照其标准步骤提取总RNA。
RNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可 见清晰的两条带(图1)。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得 OD26()/OD28()=2.03，表明总RNA质量很好。总RNA样品冻存于-80 °C，备 用。
实施例2:反转录合成圆红冬孢酵母AS 2.1389 cDNA第一链和简并PCR
以圆红冬孢酵母i . AS 2.1389总RNA为模板，反转录合成
cDNA第一链。首先，将1.0 |il RNA (约2吗)，1.0 (il引物SMART IV: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3'和1.0 jil 弓l物CDSlII/3': 5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (T)腦N-3'， 2.0plDEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TaKaRa公司)，加入 到PCR管中混匀，于72。C保温2min，立即置于冰上冷却2 min，将2.0 pl 5x first strand buffer, 1.0 [il DTT (20 mM)， 1.0 |il dNTP (10 mM)， 1.0 |il powerscript reverse transcriptase (Clontech公司)力卩入至U体系中，混匀。于 42。C延伸反应60min，最后4。C结束反应，存于-2(TC，备用。
设计合成两条简并引物 ura3-sense: 5 '-TT(CT)GA(AG)GA(CT)(AC)G(AGCT)AA(AG)TT(CT)GC國3'和ura3-anti: 5'-CCA(AGCT)CC(AGCT)GC(CT)(CT)T(CT)TG(AG)TA-3'，以反转录合成的 cDNA第一链为模板，进行部分ura3基因的PCR扩增，10x PCR缓冲液(大 连TakaRa) 5.0 |il， dNTPs (10 mM, TaKaRa) 1.0 pl， ura3-sense引物(50 mmol/1) 1.0 jil， ura3-anti引物(50mmol/l) 1 ul， 酶(大连TakaRa) 0.5 ^d，合成的cDNA第一链模板1.0 ^， ddH20 40.5 |il，于94 。C保温3 min，
7然后于94 °C 30 s ， 57 °C 45 s， 72 °C 1 min， 35个循环，72 °C 10 min， 4 °C 结束反应。扩增产物进行1% (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到 540bp左右的条带(图2A)，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国)， 按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照TaKaRa公司提供的方 法克隆到pMD18-T载体，转化入E co/ZDH5a感受态细胞，其中感受态细 胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译， 科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。 重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，序列结果经Blastn分析，证实为乳清 酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因wra3的部分序列。 实施例3:圆红冬孢酵母AS 2.1389 wra3全长cDNA获得
1. 根据实施例2中克隆得到的wra3 cDNA中间序列设计引物5'-NUP: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' 禾卩 ura3-GSP-anti: 5'-ATGCCCCGACCGACGATGATAACG-3'，以实施例2中合成的cDNA第 一链为模板，参照Clontech公司提供的BD SMART RACE cDNA Amplification kit操作手册(www.bdbiosciences.com)进行5'-RACE， f导妾廿 约0.9 kb的PCR产物(图2B ); 设计引物ura3-GSP-sense: 5'-GGCACACATCACCAACGCCCACCT-3'禾卩CDSIII/3'PCR primer (实施例 2)，以实施例2中合成的cDNA第一链为模板，参照Clontech公司提供的 BDSMARTRACEcDNAAmplificationkit操作手册
(www.bdbiosciences.com)进行3，-RACE，得到约0.6 kb的PCR产物(图 2C)。 PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤回收、克隆到pMD18-T载体， 并进行测序分析，表明获得了正确的wra3 cDNA的5'端和3'端序列。
2. 根据步骤1中克隆得到的wra3 cDNA两端序列设计引物 ura3画fUll-sense: 5'-ATGCCGTCCATCACGACCCGCACCT-3'禾卩ura3-fUll-anti: 5'-TCACTGCCTCAGCCTGCTCTCGTAC-3'，以实施例2中得到的cDNA第 一链为模板，进行PCR扩增，得到约0.8 kb的PCR产物(图2D)。 PCR 扩增产物按照实施例2的操作步骤IH收、克隆到pMD18-T载体，并进行测 序得到如序列表SEQ ID NO: 1所示的序列。
序列号1 (SEQIDNO: 1) 序列长度840 bp 序列类型cDNA
来源圆红冬孢酵母(i /zo<ias:;7W7.(i/MW torw/o/tfes)
来源菌株特征分类地位担子菌门，高产油脂菌株，胞内油脂最高达 细胞干重的70% 。 序列特征
表示特征的记号有正确的读码框 决定位置起始、终止密码子决定特征的方法实验
存在位置ATG， 1位；TGA， 838位；正义链引物3'端序列，1-26 位；反义链引物3，端序列互补链位置，816-840位。
3.上述步骤2所得序列全长840bp，编码蛋白质具有如序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。该蛋白质含有279个氨基酸残基，无信号肽 序列，无N糖基化修饰序列N-X-T/S，分子量31kDa，含34个碱性氨基酸 残基(K,R) ， 38个强酸性氨基酸残基(D,E) ， 96个疏水性氨基酸残基 (A，I, L,F, W, V) ， 58个极性氨基酸(N, C, Q, S, T， Y)。利用DNAstar MegAlign将该氨基酸序列与几种酵母来源的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶的 氨基酸序列进行比较，发现具有58%-63%的序列同源性。结果表明获得了 圆红冬孢酵母AS 2.1389乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因wra3的全长cDNA 编码区序列。
序列号2 (SEQIDNO: 2) 序列长度279 AA 序列类型氨基酸
来源圆红冬孢酵母(AWos戸W画to油to)
来源菌株特征分类地位担子菌门，高产油脂菌株，胞内油脂最高达 细胞干重的70%。
序列特征无信号肽序列，无N糖基化修饰序列N-X-T/S。
实施例4:圆红冬孢酵母AS 2.1389 wra3的基因组DNA的获取
61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781
1 MPSITTRTYA ERAAKHPVPV AKQLLDICDR KKTNLCVSVD VTSKAGLLRI 51 AEAAGPYCCC IKTHIDIVED FDRDLVQQLQ ALADKHDFLI WEDRKFADIG 101 STVRLQYSSG IYKIASW扁TNAHLVPGEG ILTGLASVGL PLGRGLLLLA
201 EGADYVIMTP GVGLDSKGDG MGQQYRTPDE VIRESGCDVIIVGRGIYGGG 251 DGNPNEEIVK QCKRYQEAGW KAYEDRLRQ1. 按照"精编分子生物学实验指南(第四版)(奥斯伯等著，颜子颖等
译，科学出版社出版)"描述方法提取圆红冬孢酵母AS 2.1389的基因组 DNA，紫夕卜/可见光光谱分析测得样品OD26o/OD28『1.88，表明基因组DNA 质量很好。冻存于-2(TC，备用。
2. 以圆红冬孢酵母AS 2.1389的基因组DNA为模板，利用实施例3歩 骤2的两条引物ura3-foll-sense和ura3-fbll-anti，按照常规方法进行PCR扩 增，得到约l.Okb的PCR (图3)。 PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤 回收、克隆到pMD18-T载体，并进行测序，得到如序列表SEQ ID NO: 3 所示的DNA序列。该序列长度为1017bp，与wra3的cDNA序列对比，发 现存在3个内含子，分别为5'端第187位到第251位碱基，5'端第364位 到第419位碱基，5'端第728位到第783位碱基。结果表明获得了圆红冬孢 酵母AS 2.1389乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因"ra3的基因组DNA。
序列号3 (SEQIDNO: 3)
序列长度
序列类型DNA
来源圆红冬孢酵母(i /iocfos; onWwm ton/fo^es;)
来源菌株特征分类地位担子菌门，高产油脂菌株，胞内油脂最高达
细胞干重的70%。
序列特征
外显子(exon)和内含子(intron)、起始密码子和终止密码子 存在位置ATG， 1位；TGA， 1017位；正义链引物3，端序列，1-26 位；反义链引物3，端序列互补链位置，993 — 1017位。3个内含子位置分别 为5'端第187位到第251位碱基，5'端第364位到第419位碱基，5'端第 728位到第783位碱基。实施例5:构建重组载体pYES2/CT-Rt-ura3
参照文献方法(Van den Ent, F.， Lowe, J., 2006. RF cloning: A restriction-free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67， 67—74 )， 设计RF克隆引物um3-RF-sense: 5 '-CCTGCAGGAAACGAAGATAAATC ATatgccgtacatcacgacccgcacct-3' 和 ura3-RF-anti:
5 '-TGCATTTACTTATAATACAGTTTTTtcactgcctcagcctgtcctcgtac-3'(其中大 写字母部分序列与pYES2/CT载体中原有的wra3 ORF两侧的序列互补，小 写字母部分序列与圆红冬孢酵母AS 2.1389乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶，因 Rt-wra3互补)，构建重组载体pYES2/CT-Rt-ura3，构建流程如图5所示。
1. PCR反应体系I及流程10x PCR缓冲液(大连TaKaRa) 5.0 |il， dNTPs (大连TaKaRa) 1.0 |il， ura3-RF-sense引物(10 mmol/1) 1.0 pl， ura3-RF-anti引物(10 mmol/l)l ul， Jb《酶(大连TaKaRa) 0.5 [il，携带Rt-i/ra3 的T國ura3载体(50ng/(_d) 2.0 pi， ddH20 39.5 j^l，于94。C保温3min， 然 后于94 °C 30 s ， 57 °C 45 s， 72 °C 1 min， 35个循环，72 °C 10 min， 4 °C结 束反应。
2. 反应体系II及流程模板(pYES2/CT，购自Invitrogen公司，200 ng/ul) 1 |il，上述步骤1产物8 fxl， 10xPCR缓冲液(大连TaKaRa) 5.0 |il， ddH20 33|al，将以上成分混匀加样至PCR管中，于95。C保温2min，待混 合物降到室温时置于冰上，加入1.5 pi dNTPs (大连TaKaRa), 1.5 pi pfli DNA 聚合酶(北京鼎国)，于68 °C 5min， 95 °C 1 min， 55 °C 1.5 min， 68 °C 18 min， 35个循环，4 °C结束反应，得到约7 kb左右的PCR产物(图4)。
3. 上述步骤2的PCR产物用Z)pw I (购自New England Biolabs) 1 |il 于37 "C消化1小时，取5 |il电击转化E co//DH5a感受态细胞(按标准方 法制备)，电击转化参数2200-2500 V， 400 Q， 25 ^F。挑选Amp抗性转 化子进行增菌培养、质粒提取和测序分析。结果显示，圆红冬孢酵母AS 2.1389 Rt-wra3 ORF序列正确替换pYES2/CT原有的wra3 ORF序列。新质 粒命名为pYES2/CT-Rt-ura3 。
实施例6:酿酒酵母基因工程菌株构建
将pYES2/CT-Rt-ura3电击转化营养缺陷型酿酒酵母BY4741 (Maf a; ^"2Z^; me〃5A0; wra3A0，购自ATCC，编号ATCC 201388)感 受态细胞，取200 jil转化液涂布不含尿嘧啶的SD培养基(0.67%YNB， 2% 葡萄糖，0.005%组氨酸，0.005%蛋氨酸，0.01%亮氨酸，2%琼脂粉。参考 Invitrogen公司pYES2/CT产品手册配制)，30 。C倒置培养2天，得到约50 个生长正常的转化子菌落(图6)。在相同条件下未经转化的酿酒酵母 BY4741菌液涂布在不含尿嘧啶的SD培养基上，没有菌落形成。实验表明， 携带质粒pYES2/CT-Rt-ura3的酿酒酵母BY4741获得了新表型，属于基因工程菌株。
实验结果还表明，Rt-i/ra3基因产物可以补偿酿酒酵母BY4741的URA3
营养缺陷，重建嘧啶生物合成途径，生长培养基中无需外加尿嘧啶，从而 验证了 Rt-Wra3基因的生物学功能。
实施例7:圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶URA3的结构表征
参考Invitrogen公司pYES2/CT产品手册和分子克隆实验指南第三版
(萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)纯化得到圆红冬孢酵母 乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶JJRA3。纯化后的重组OMPdecase的结晶是在4 "C用悬滴结晶法获得的。采用Hampton Research公司的Kit I和Kit II试剂 盒及稀疏矩阵采样法，摸索获得可基本满足高分辨率的结构解析要求的晶 体。最终的结晶条件重组URA3蛋白溶液浓度10mg/ml， 0.1 MHepes(pH 7.0)、 10% (w/v)异丙醇和20% (w/v)聚乙二醇4000做为促进剂，温度4 °C 。 用多波长反常散射法(MAD)确定位相，MAD数据在ADSC Quantum-4R CCD探测器上收集，所有数据用DPS软件包进行统一，用CCP4软件包进 行坐标修正与处理。模型用XtalView 4.0软件在Silicon Graphics OCTANE 上构建和校正，用REFMAC程序进行精化。圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶晶体属于空间群P2口口7，晶格常数为a=90.1 A， 6=116.2 A， c=117.0 A，根据衍射数据得到三维结构模型见图8。 实施例8:圆红冬孢酵母营养缺陷型菌株构建及应用
参考文献(Baudin A, Ozier-Kalogeropoulos O, Denouel A, et al. A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res, 1993, 21(14): 3329-3330)所述PCR介导的基因一步灭活 法构建圆红冬孢酵母营养缺陷型菌株。
1. 设计合成两条引物 ， Ura3-disruption-upl : 5'-ctgggcgcacatcaccaacgcccacttg:gtccccggcgaCGTACGCTGCAGGTCGAC-3'
(大写字母部分为pFA6-kanMax4同源序列，小写字母部分与Rt-wra3基因 组DNA序列一致，其中下划线部分与引物Ura3-disruption-up90下划线序列 一致 ) 禾口 Ura3-disruption-down 1 : 5'-
taccccgaxxgacgatgataacgtcgcagccggactcgcg- ATCGATGAATTCGAGCTCG-3'
(大写字母部分为pFA6-kanMax4同源序列，小写字母部分与Rt-wra3基因 组DNA序列一致，双下划线部分序列与引物Ura3-disruption-down90双下 划线序列一致)。以pFA6-kanMax4 DNA质粒为模板，以Ura3-disruption-upl 和Ura3-disruption-downl为引物，PCR扩增两端带有45 bp左右同源重臂序 列的wra3-基因敲除盒I。 PCR体系(100 10xPCR缓冲液10.0 |il， dNTPs 2.0^1，上游引物(20mmol/l) 2.0 |il，下游引物(20 mmol/1) 2.0(^1， Taq 酶1.0 (il，模板1.0 [xl， ddH20 82 (il。反应条件94 °C 5 min， 95 °C 30 s， 60 °C 30 s， 72 °C 1.5 min， 30个循环，72 °C 10 min， 4 。C结束反应。PCR 产物按实施例2的步骤回收，得到wra3-基因敲除盒I，保存于-20 °C，备用。2. 以上步骤1的PCR反应产物为模板，以Ura3-disruption-up卯
划线部分序列与Ura3-disruption-upstreaml下划线序列 一 致)和 Ura3-disruption-do wn90 : igcflc阮^ga^gKc"ce"aggg《gcc一gccgccgccgtogfllaccccgaccgacgatgat (双下 划线部分序列与Ura3-disruption-downl双下划线序列一致)为引物，扩增 两端带有^Obp左右同源重臂序列的Mra3-基因敲除盒II。PCR体系(100pl): 10xPCR缓冲液10.0 |al， dNTPs 2.0 pl，上游引物(20 mmo1/1) 2.0 pl，下 游引物(20mmo1/1) 2.0^1， Taq酶1.0 [il，模板1.0pl， ddH20 82|il。反应 条件94 °C 5 min， 95 °C 30 s， 60 °C 30 s， 72 °C 1.5 min， 30个循环，72 °C 10min， 4°C结束反应。PCR产物按实施例2的歩骤回收，得到wm3-基因 敲除盒II，保存于-2(TC，备用。
3. 取10昭(^ 10 pl体积)纯化好的"ra3-基因敲除盒I1 ，电击转化圆 红冬孢酵母AS 2.1389感受态细胞，转化液涂布含200 pg/ml G418的无尿嘧 啶的CM固体培养基(0.67%YNB， 2%葡萄糖，200 jig/ml G418， 2%琼脂 粉)平板，3(TC倒置培养4天，得到约70个转化子菌落。
4. 挑选步骤3所得转化子单菌落，在YEPD液体培养基上进行增菌培 养，制备感受态细胞，备用。取10jig (S10fil体积)纯化好的wm3-基因 敲除盒II，电击转化新制备的感受态细胞，转化液涂布含5'-FOA (5'-氟乳 清酸，购自上海金和生物技术有限公司)和G418的CM固体培养基
(0.67%YNB， 2%葡萄糖，0.1%5，-FOA， 0.0012%尿嘧啶，200 jig/ml G418， 2%琼脂粉)平板，3(TC倒置培养5天，出现约30个转化子菌落。
5. 挑选步骤4所得转化子单菌落，在YEPD液体培养基上进行增菌培 养，菌株正常生长。将同一转化子菌落接种在不含尿嘧啶的SD培养基上， 没有菌落形成。可见转化子获得了新表型，即尿嘧啶营养缺陷型。因此， 成功构建了圆红冬孢酵母AS 2.1389的尿嘧啶营养缺陷型工程菌株。
6. 尿嘧啶营养缺陷型圆红冬孢酵母工程菌株在含有5，-FOA的培养基 (0.1%5，-FOA，葡萄糖70g/L， (NH4)2SO40.1 g/L，酵母粉0.75 g/L， KH2
PO40.4g/L ， MgS04.7H20 1.5g/L， pH6.0)中正常生长，28-30。C发酵96h 后收集菌体，胞内油脂含量达到65 wt%。而圆红冬孢酵母AS 2.1389对照 菌则在含有5'-FOA的限氮培养基中无法生长。因此，该工程菌可以用于发 酵生产油脂。
实施例9:圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶URA3的应用
乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶URA3催化转化乳清苷酸(OMP)合成尿苷 酸UMP。
乱清吝醋 URA3 >尿苷酸 0MP . 匿参考文献(Floyd E E and Jones M E， Isolation and characterization of the
orotidine 5,-monophosphate decarboxylase domain of the multifunctional
protein uridine 5,-monophosphate synthase. J. Biol. Chem. 1985, 260:
9443-9451)方法，反应4件2.0 mM乳清苷酸(OMP)， 20 mM Tris-HCI，
2.0mMDTT， O.lmMEDTA， pH7.4，总体积1.0ml。向上述溶液中加入
URA3至终浓度0.8 nM，在37 "C孵育3 h，尿苷酸(UMP)浓度达到1.6 mM。
结果显示，OMP的转化率达到80%。所以，圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-
磷酸脱羧酶URA3用于制备尿嘧啶。
同时，提示圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶URA3还可用于转
化5'-氟乳清酸(5'-FOA)制备5'-氟尿嘧啶(5'-FU， 一种抗肿瘤药物)。
URA3 "。、、
5-氟乳清酸- S-氟尿。密叉
14乳清酸核苷.ST25
SEQUENCE LISTING <110〉中国科学院大连化学物理研究所 <120> —种乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因及其蛋白和应用 <130> <160〉 3
<170> Patentln version 3. 1
<210〉 1
〈211〉 840
〈212〉 DNA
<213> 圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
〈220〉
<221> CDS
<222〉 (1)..(837)
<223〉
<400> 1
atg ccg tec ate acg acc cgc acc tac gcc gaa egg get gcc aag cac 48 Met Pro Ser lie Thr Thr Arg Thr Tyr Ala Glu Arg Ala Ala Lys His 15 10 15
ccc gtc ccg gtc gca aag cag ttg etc gac ate tgc gac cgc aaa aag 96 Pro Val Pro Val Ala Lys Gin Leu Leu Asp lie Cys Asp Arg Lys Lys 20 25 30
acc aac etc tgc gtt tea gtc gac gtg acg age aag gcg ggc ctg etc 144 Thr Asn Leu Cys Val Ser Val Asp Val Thr Ser Lys Ma Gly Leu Leu 35 40 45
agg ate gca gag get gcc ggc ccg tac tgc tgc tgc ate aag acc cac 192 Arg lie Ala Glu Ala Ala Giy Pro Tyr Cys Cys Cys lie Lys Thr His 50 55 60
ate gac ate gtc gag gac ttt gac egg gat etc gtt cag caa ctg cag 240 lie Asp lie Val Glu Asp Phe Asp Arg Asp Leu Val Gin Gin Leu Gin 65 70 75 80
get etc gca gac aag cac gat. ttt ctg att tgg gag gac cgc aag ttt 288 Ala Leu Ala Asp Lys His Asp Phe Leu lie Trp Giu Asp Arg Lys Phe 8^ 90 95
gcc gac ate ggc age acc gtt egg ctg cag tac teg tec ggt ate tac 336 Ala Asp lie Giy Ser Thr Val Arg Leu Gin Tyr Ser Ser Gly lie Tyr 100 105 110
aag ate gca tec tgg gcg cac ate acc aac gcc cac ttg gtc ccc ggc 384 Lys lie Ala Ser Trp Ala His lie Thr Asn Ala His Leu Val Pro Gly115
120
乳清酸核苷.ST25 125
gag ggc atx ctg acg ggc etc gca txc gtc ggt ctg ccc ctt ggc cgc 432 Glu Gly lie Leu Thr Gly Leu Ala Ser Val Gly Leu Pro Leu Gly Arg 130 135 140
ggt etc ctg ctt etc gcc gag atg age gcc aag ggc aac etc gcg act 480 Gly Leu Leu Leu Leu Ala 6lu Met Ser Ala Lys My Asn Leu Ala Thr 145 150 155 160
ggc gag tac acg gcc aag aat gtc gag gcg gcg agg egg cat cct gaa 528 Gly Glu Tyr Thr Ala Lys Asn Val Glu Ala Ala Arg Arg His Pro Glu 165 170 175
ttc gtg atg ggc tt:c gtt gcg alg egg agg gtg ga_c gag egg gaa gag 576 Phe Val Met Gly Phe Val Ala Met Arg Arg Val Asp Glu Arg Glu Glu 180 185 190
acg get ggc ggt gU gcg ccg ggg gaa ggg gcc gac tac gtc ate atg 固 Thr Ala Gly Gly Val Ala Pro Gly Glu Gly Ala Asp Tyr Val lie Met 195 200 205
acg ccc ggc gtc gga etc gac teg aag ggc gac ggc atg ggc cag cag 672 Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Ser Lys Gly Asp Gly Met Gly Gin Gin 210 215 220
tac cgt aca ccc gac gag gtc ate cgc gag txc ggc tgc gac gtt ate 720 Tyr Arg Thr Pro Asp Glu Val lie Arg Glu Ser Gly Cys Asp Val lie 225 230 235 240
ate gtc ggt egg ggt ate tac ggc ggc ggc gac ggc aac cct aac gaa 768 lie Val Gly Arg Gly lie Tyr Gly Gly Gly Asp Gly Asn Pro Asn Glu 245 250 255
ga_g ate gtc aag cag tgc aag egg tat cag gag gcg ggc tgg aag gcg 謹 Glu lie "1 Lys Gin Cys Lys Arg Tyr Gin Glu Ala Gly Trp Lys Ala 260 265 270
tac gag gac agg ctg agg cag tga 詣 Tyr Glu Asp Arg Leu Arg Gin 275
〈210〉 2
<211> 279
<212> PRT
<213> 圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
<400> 2
Met Pro Ser lie Thr Thr Arg Thr Tyr 1 5
Ala Glu Arg Ala Ala 10
Lys His 15
Pro Val Pro Val Ala Lys Gin Leu Leu Asp lie Cys Asp Arg Lys Lys 20 25 30
Thr Asn Leu Cys Val Ser Val Asp Val Thr Ser Lys Ala Gly Leu Leu 35 40 45
Arg lie Ala Glu Ala Ala Gly Pro Tyr Cys Cys Cys lie Lys Thr His 50 55 60
lie Asp lie Val Glu Asp Phe Asp Arg Asp Leu Val Gin Gin Leu Gin
65
70 75
80乳清酸核苷.ST25
Ala Leu Ala Asp Lys His Asp Phe Leu lie Trp Glu Asp Arg Lys Phe
85
90
95
Ala Asp lie Gly Ser Thr Val Arg Leu Gin Tyr Ser Ser Gly lie Tyr 100 105 110
Lys lie Ala Ser Trp Ala His lie Thr Asn Ala His Leu Val Pro Gly 115 120 125
Glu Gly lie Leu Thr Gly Leu Ala Ser Val Gly Leu Pro Leu Gly Arg 130 135 140
Gly Leu Leu Leu Leu Ala Glu Met Ser Ala Lys Gly Asn Leu Ala Thr
145
150
155
160
Gly Glu Tyr Thr Ala Lys Asn Val Glu Ala Ala Arg Arg His Pro Glu 165 170 175
Phe Val Met Gly Phe Val Ala Met Arg Arg Val Asp Glu Arg Glu Glu 180 185 190
Thr Ala Gly Gly Val Ala Pro Gly Glu Gly Ala Asp Tyr Val lie Met 195 200 205
Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Ser Lys Gly Asp Gly Met Gly Gin Gin 210 215 220
Tyr Arg Thr Pro Asp Glu Val lie Arg Glu Ser Gly Cys Asp Val lie
225
230
235
240
lie Val Gly Arg Gly lie Tyr Gly Gly Gly Asp Gly Asn Pro Asn Glu 245 250 255
Glu lie Val Lys Gin Cys Lys Arg Tyr Gin Glu Ala Gly Trp Lys Ala 260 265 270
Tyr Glu Asp Arg Leu Arg Gin 275
<210> 3
<211> 1017
<212> 脆
〈213> 圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
<220>
<221〉 exon <222> (1)..(186) <223>
<220>
<221> e腦乳清酸核苷.ST25
〈222〉 (784). ■ (1017) <223>
<220>
<221> Intron <222> (728).. (783) 〈223〉
〈220〉
<221> exon
<222〉 (420).. (727)
<223>
<220>
<221〉 Intron <222> (364)…(419) <223>
〈220〉
<221〉 exon
<222> (252).. (363)
<223>
<220>
<221> Int，
<222> (187). (251) <223〉
<400> 3
atg ccg tcc atc acg acc cgc acc tac gcc gaa egg get gcc aag cac 48
Met Pro Ser lie Thr Thr Arg Thr Tyr Ala Glu Arg Ala Ala Lys His
15 10 15
ccc gtc ccg gtc gca aag cag ttg etc gac ate tgc gac cgc aaa aag Pro卩al Pro々al Ala Lys Gin Leu Leu Asp lie Cys Asp Arg Lys Lys 20 25 30
96
acc aac etc tgc gtt tea gtc gac gtg acg age aag gcg ggc ctg etc Thr Asn Leu Cys Val Ser〖al Asp Val Thr Ser Lys Ala Gly Leu Leu 35 40 45
144
agg ate gca gag get gcc ggc ccg tac tgc tgc tgc ate aag 186 Arg lie Ala Glu Ala Ala Gly Pro Tyr Cys Cys Cys lie Lys 50 55 60
gtaggttgta ccggcgctga agtaatccga ggaccgcagc tgacagaccg agacaccgac 246
18<formula>formula see original document page 19</formula>
权利要求
1. 一种乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因，其特征在于具有序列表SEQID NO1所示的脱氧核苷酸序列。
2. 按照权利要求1所述乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因，其特征在于 其来源于圆红冬孢酵母，基因组DNA具有序列表SEQIDNO: 3所示的脱 氧核苷酸序列。
3. —种权利要求1所述乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因的编码蛋白，其 特征在于具有序列表SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列。
4. 一种权利要求l所述乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因的应用，其特征 在于所述乳清酸核苷-5'_磷酸脱羧酶基因的开放阅读框ORF置换了载体 pYES2/CT所携带来源于酿酒酵母wra3的ORF ，获得重组载体 pYES2/CT-Rt-wra3;即重组载体pYES2/CT-Rt-wra3的2919-3756位具有乳 清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因的开放阅读框ORF序列；可以用于补偿营养缺 陷型酿酒酵母菌BY4741的啼啶生物合成途径，使构建的工程菌在不含尿嘧 啶的培养基中正常生长。
5. —种权利要求l所述乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因的应用，其特征 在于序列表SEQIDNO: 1所示的脱氧核苷酸序列可作为营养缺陷型标记 基因或反选择标记基因用于基因工程菌株中，可构建新的酵母遗传操作系 统及新的重组工程菌株，所得到的基因工程菌株携带全部乳清酸核苷-5'-磷 酸脱羧酶基因Rt-wra3的序列或部分Rt-wra3序列。
6. 按照权利要求5所述乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因的应用，其特征 在于所述基因工程菌株为圆红冬孢酵母基因工程菌株。
7. —种DNA序歹U，其特征在于与权利要求1所述序列表SEQ ID NO: 1所示的脱氧核苷酸序列具有95%以上同源性，且编码蛋白质具有乳清酸核 苷-5'-磷酸脱羧酶的功能。
全文摘要
本发明涉及自圆红冬孢酵母分离得到的一种乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因及其编码蛋白和重组载体。以圆红冬孢酵母菌AS 2.0389总RNA为模板，利用简并PCR和RACE方法，分离得到Rt-ura3，cDNA序列如SEQ ID No1所示，基因组DNA序列如SEQ ID No3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。所获得的载体pYES2/CT-Rt-ura3可以用于补偿营养缺陷型酿酒酵母菌BY4741的嘧啶生物合成途径，使构建的工程菌在不含尿嘧啶的培养基中正常生长。将Rt-ura3基因用做营养缺陷型标记基因或反选择标记基因，可构建新的酵母遗传操作系统及新的重组工程菌株。
文档编号C12N9/88GK101440375SQ20071015841
公开日2009年5月27日 申请日期2007年11月21日 优先权日2007年11月21日
发明者张素芳, 帆 杨, 赵宗保 申请人:中国科学院大连化学物理研究所