专利名称：：生物农药梧宁霉素的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及——禾中由不吸水链霉菌梧外l亚禾中(5trepto历/cesa力j^r。,sropicussw/6p.r股力o"e/7Si's;i.5'"65'p)产生的生物农药——梧宁霉素改进的制备方法以及该产品在防治苹果斑点落叶病中的应用。
背景技术：
：.我国是农业大国，常年种植粮食作物l亿公顷以上，棉花480万公顷以上，油料作物1400万公顷以上，蔬菜瓜果1800万公顷以上，常年需要防治面积超过3亿公顷，为了防治病虫害，保证农业的正常生产，长期以来，人们大量使用化学农药防治病虫害。化学农药的使用对保证农作物正常生产起到有效作用，但随着长期以来大量化学农药的使用，对生态环境已造成严重破坏，如土壤结构破坏、土壤中酶活性降低、土质和水体严重污染等等，破坏了整个生态环境，粮食、蔬菜、水果等几乎所有食品中有毒农药残留量严重超标，食用残留化学农药严重超标的瓜果蔬菜造成人畜中毒的事件也时有发生。针对中国入世，发达国家纷纷调整提高了产品进口的技术门槛，农产品受到的影响首当其冲。我国仅农副产品因农药残留超标而遭国外"绿色壁垒"封杀的损失每年就高达70亿美元。发展无公害的生物农药是解决现有农药及农产品出口问题的主要途径。生物农药属于环境友好型产品，使用生物农药，不仅可以减少化学农药和化肥的使用，有效地实现农产品的优质安全生产，提升农产品的经济附加值，而且可为我国农产品出口创造有利条件，极大地增强我国农产品的国际竞争力。对我国推进绿色农业产业发展及发展农村经济、增加农民收入、促进农村繁荣具有重要的推进作用。苹果斑点落叶病主要危害展叶不久的幼嫩叶片，也能危害嫩梢和果实。病斑初期为褐色小点，以后扩大成直径56毫米的红褐色圆斑，边缘紫揭色，中心有一深褐色小点，其周围有深褐色环纹，状如蛙眼。天气潮湿时，病斑正反面均可产生墨绿色霉状物。发病后期，病斑继续扩大成不规则形，病斑部分或全部呈灰白色，其上散生小黑点，有的病斑破裂或穿孔。在高温多雨季节，病斑迅速扩人成不规则形褐色大斑，叶片焦枯脱落。秋梢嫩叶发病最重，一张叶片上常可发生数十个甚至上百个大小不等的病斑，许多病斑连缀在一起，呈云朵状，叶尖干枯，叶片扭曲畸形早落。叶柄受害发生椭圆形暗褐色凹陷病斑并易折断。枝条一年生枝或徒长枝易发病，病枝皮孔突起，芽周变黑，凹陷坏死，边缘开裂。幼果被害，以果为中心产生褐色圆斑，表面略凹陷，附近果肉变褐木栓化，不深入果肉深处，若被二次寄生可使果实腐烂。苹果斑点落叶病是70年代末到80年代初在我国流行的一种新的苹果叶斑病，目前己在很多地区发生，且有日益发展的趋势。目前，我国登记注册的生物农药(防治植物病、虫、草、鼠害)有效成分77个，占有效成分的13.4%。产品691个，占整个农药产品的7.1%,制剂产量接近10万吨，采用生物农药防治病虫害的占10%左右。一些生物农药制剂也成为出口的重要品种，如阿维菌素、井冈霉素和赤霉素。用于苹果斑点落叶病生物农药以多抗霉素为主，但多抗霉素多为进口制剂，增加了成本，急需研究开发出新型的生物农药，解决现有生物农药成本高、防治率低等问题。梧宁霉素作为已知化合物，是由不吸水链霉菌梧州亚种(5"tr印t咖ycesa力jg7Y^cc^'cusr"^o〃e"w's".s"力卬)(《微生物学报》1988年，28巻(1)85-87页)产生的，由于梧宁霉素的生物效价低，保质期较短，对苹果腐烂病的防治效果不够理想，在使用和药效方面受限；除发明单位对梧宁霉素新用途进行研究外，尚未见到其它单位将梧宁霉素作为生物农药还有其它新用途的相关报道。
发明内容本发明目的在于提供利用不吸水链霉菌梧州亚种(5Yr印to历yce5a力j^rosc卬i'ci/ss"Z^a/f^力o"e/7W's/7.w力邵)制备梧宁霉素的方法，进一步提高对苹果腐烂病的防治效果；本发明另一个目的是该方法制备的梧宁霉素在防治苹果斑点落叶病中的应用。用不吸水链毒菌梧州新亚禾中(■SYrepto/ffycesa/j^roscopicuss"6sp,fkz/w〃e/7sj's/7.制备梧宁霉素的方法
技术领域：
：本发明方法是以不吸水链霉菌梧州亚禾中(Strepto/ffycesa力jgroscopic6ASs〃Z^a脂z力m/e"w's/7.s〃fep)(《微生物学报》1988年，28巻(1)85-87页)作为出发菌株(该菌种保存在辽宁省微生物菌种保藏中心，自申请日起20年内公众可从该中心获取该菌种)，通过菌种液体深层发酵制取生物农药梧宁霉素，其特征在于它包括以下方法a)种子发酵培养基的制备每100毫升中含有黄豆饼粉0.5-1.5g，淀粉0.5-1.5g，葡萄糖0.5-1.5g，蛋白胨0.1-0.5g,硫酸镁0.01-0.05g，硫酸铵0.1-0.5g，憐酸氢二钾0.01-0.05g，碳酸钙0.1-1.0g，氯化钠0.05-0.15g，植物油0.2-0.5g，PH自然;(2)种子发酵条件和方法按5-20%的接种量取不吸水链霉菌梧州亚种(6Y7^oto//cesa力j^rosc，ycuss"力s/./feioi/e/wh/7.犯6砂)菌株，于25-35。C在种子发酵培养基中培养20-24小时，通风量1:0.5-1(V/V)，转速150-300转/分钟，制取种子发酵液备用；(3)深层发酵培养基的制备每100毫升中含有葡萄糖1.0-3.0g，淀粉1.0-2.0g，玉米面0.5-1.5g，黄豆饼粉1.0-2.0g，蛋白胨(或玉米浆)0.2-0.6g,硫酸铵O.1-0.5g，硫酸镁0.01-0.05g，磷酸氢二钾0.01-0.05g，碳酸钙O.l-1.0g，氯化钠0.05-0.15g，植物油0.2-0.5g，灭菌后加入培养基体积0.3-0.5%的正丙醇，PH自然；(4)梧宁霉素发酵液的制备按5-20%的接种量取上述种子发酵液于25-35'C进行深层发酵培养64-72小时，通风量前期0-12小时、中期12-40小时、后期40-42小时1:0.5-1(V/V)，转速150-300转/分钟，得到梧宁霉素发酵液。本发明还涉及梧宁霉素作为在防治苹果斑点落叶病的生物农药的应用。梧宁霉素是一种复合型生物抗生素，含有四霉素A1、A2以及白诺氏菌素和茴香菌素。根据梧宁霉素A1的核磁共振、红外吸收光谱、紫外吸收光谱以及质谱确定的分子量和其他一些理化数据，推导M.i梧宁霉素Al的分子式应为(]3孔2船13，其化学结构式为根据类似HQ梧宁霉素Al分离鉴定方法，通过核磁共振、红外吸收光谱、紫外吸收光谱以及质谱确定的分子量和其他一些理化数据，推导出梧宁霉素B化学结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>根据类似梧宁霉素A1分离鉴定方法，通过核磁共振、红外吸收光谱、紫外吸收光谱以及质谱确定的分子量和其他一些理化数据，推导出梧宁霉素C化学结构式为<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>梧宁霉素生物检测方法方法管碟法指示菌清酒酵母(fecc/zaroffl/cwsaAe)培养基上层PDA下层水琼脂标准品四霉素A纯品产品标定指示菌苹果斑点落叶病菌、苹果腐烂病菌等梧宁霉素毒理实验(1)梧宁霉素小白鼠和大白鼠急性毒性动物性别LD50(mg/kg)小白鼠雄2851.31(2632.83-3087.92)雌2949.87(2661.75-3269,18)大白鼠雄~4000雌~4000结论从急性毒性实验结果可以看；ii梧宁霉素毒性较低。(2)梧宁霉素对CHL-1细胞SCE频率的影响表1:梧宁霉素对CHL细胞SCE频率的影响(非活化系统)受试物及浓度(化/ml)观察细胞数SCE数湖胞平均土SEt检验阴性对照25897848677895896138875657967.32±0.37Bap6.7256871081088786886978897586677.6±0.26t=0.617P>0.5訓2569787656107776794571197810877.32±0.34t=0P>0.5梧50257796878596979611811789588577,6±0.33t=0.569P>0.5宁霉2525657711399910895576896710866107.44±0.40t=0.2218P>0.5素12.5257888678658988767896759887.7.32±0.23t=0P>0.56.28257107410756710812937678898712887.72土0.43t=0.7099P>0.57表2:梧宁霉素对CHL细胞SCE频率的影响(活化系统)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>梧宁霉素CHL细胞SCE频率的影响实验结果表明梧宁霉素的5个浓度都没有引起SCE频率的增加。经统计学处理与阴性对照比均PX).l。Bap代谢活化明显的诱发了SCE频率增加，与阴性对照比PO.001,差异非常显著。以上结果表明，梧宁霉素5个浓度均未见引起SCE频率增加，结果可视为致突变阴性。(3)梧宁霉素的微核试验<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实验结果表明梧宁霉素样品与阴性对照比较均PX).l，没有统计学意义。阳性对照与阴性对照比PO.OOl，有显著差异。以上结果表明梧宁霉素未引起微核的增加，结果为阴性。(4)梧宁霉素皮肤毒性和兔眼刺激性试验将梧宁霉素涂抹于去除腹部毛的大白鼠腹部，观察7天，结果证明皮肤LD50在4000mg/kg以上，表明梧宁霉素皮肤毒性较低，且涂抹梧宁霉素的局部皮肤未见损害；将梧宁霉素配制成10mg/ml澄明液体，滴5只大耳白兔左眼一滴，右眼滴生理盐水，每日滴两次，连续3天，停药后继续观察3天，结果表明梧宁霉素对兔眼无刺激性。(5)梧宁霉素大鼠蓄积毒性①将梧宁霉素配制成400mg/ml浓度，冉用蒸馏水稀释40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml，PH均为5.5.②以梧宁霉素对大鼠LD50为4000mg/kg为基准，设三个给药剂量，1/5LD50(800mg/kg)、l/10LD50(400mg/kg)、1/20LD50(200mg/kg)。③大鼠80只，雌雄各半，均匀分为四组，每组雌雄各10只，以蒸馏水作对照，每天灌胃给药1次，连续28天。④停药后处死一半动物，雌雄各半，另一半动物观察两周后处死。结果表明各剂量组动物均无死亡。蓄积系数计算结果为5,6.从而看出梧宁霉素为弱蓄积性物质。(6)梧宁霉素Ames试验按照Ames平板掺入法进行梧宁霉素的试验，结果如下:药物与剂量(g/皿)TA97TA98TA100TA102-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9十S9突发回变142±32136±429±630±153士119143±2224]±38245土10溶剂对照146±"27±330土6147土24130i7247±10292±21梧宁歸5000135±141S7土627±1172±17172±17164±11303士18351±10IO()()138±"26±5136土16136±16240+16271±23200150±17130±〗225±2133±10133±10141±32246±13245±32IO()128土17139±U35土13149土25149±25'135土9250±7254土135(138±19147±627±8141±10141±10125±11262±9248±182A「l(J149±3224土9053±32210±2615S±151103土133NQO1761±34174±6正定51201±]87()■1122±471258±1080.她l1188士611216土87BaP4281土6635±659从表中结果表明在未加S9活化和加S9活化的条件下，梧宁霉素五个剂量对四株鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TAIOO、TA102的回变数无影响，与自然回变数无显著差异；在未加S9活化和加S9活化的条件下，梧宁霉素高剂量达到5mg/皿时，四株鼠伤寒沙门氏菌的回变数为增加，这个结果说明用Ames试验观察梧宁霉素的致突变结果为阴性。梧宁霉素作为生物农药在防治苹果斑点落叶病的应用试验示范例1、试验示范试验地点陕西省咸阳市礼泉县试验作物及品种苹果，品种红富士防治对象苹果斑点落叶病(ylfe/^幼;7i/7s/ffl3Jj'(P.Henn.))试验目的为了验证梧宁霉素防治苹果斑点落叶病防治效果、有效剂量及对苹果的安全性等环境条件试验安排在陕西省咸阳市礼泉县，果园面积10亩，12年生苹果树，株行距2x3m2，土壤类型为土娄土，有机质含量为1.05%,PH值为中性。试验药剂梧宁霉素阳性对照药剂10%多抗霉素B可湿性粉剂用量与处理编号处理编号药剂施药剂量施药量(有效成分量)(1)梧宁霉素800倍1.88邮/kg(2)梧宁霉素1000倍1.5mg/kg(3)梧宁霉素1200倍1.25mg/kg")阳性对照10%多抗霉素B1000倍100nig/kg(5)清水对照一—使用方法采用植株茎叶喷雾处理试验周期和施药次数2006年5月-8月，共9次施药调查方法于春梢停止抽生期和秋梢停止抽生期各进行一次防效调査。每小区调查2株，每区分东、西、南、北、中五个方向调查新梢抽生旺盛的5个当年生枝条的全部叶片，记录总叶数、病叶数、病斑数。10分级方法0级:无病斑；1级:病斑面积占整个叶面积的10%以下;3级:病斑面积占整个叶面积的11-25%;5级:病斑面积占整个叶面积的26-40%;7级:病斑面积占整个叶面积的41-65%;9级:病斑面积占整个叶面积的66%以上。药效计算方法i:(各级病叶数x相对级别数)病情指数=-~x100调查总叶数X9CKO—PT1防治效果(％)=(1--)xiooCKl-PT0式中CK0、CK1分别为空白对照区施药前、后的病情指数；PT0、PT1分别为药剂处理区施药前、后的病情指数。结果与结论1、结果(1)春梢停止抽生期梧宁霉素防治苹果斑点落叶病试验结果处理平均病指平均防效(％)差异显著性5%阳性对照10%多抗霉素B1000倍(有效成分量100mg/kg)0.7385.28bB梧宁霉素800倍(有效成分量1.88mg/kg)0.6686.30A梧宁,素1000倍(有效成分量1.5mg/kg)0.9283.49CC梧宁霉素1200倍(有效成分量1.2mg/kg)1.0480.93dD清水对照5.74---11(2)秋梢停止抽生期梧宁霉素防治苹果斑点落叶病试验结果处<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、结论(1)试验期间经系统观察得知，供试药剂梧宁霉素在试验剂量范围内对苹果树生长发育无不良影响，果树生长旺盛；(2)通过试验，我们认为梧宁霉素对苹果斑点落叶病有显著的防治效果，其800-1000倍稀释，在有效成份用量(1.25-1.88mg/kg)明显低于阳性对照10。/。多抗霉素B(100mg/kg)的情况下，在春梢停止抽生期的防治效果达到阳性对照的防治效果；秋梢停止抽生期的防治效果也达到阳性对照的防治效果，其中梧宁霉素800倍稀释液防效高于阳性对照，有效成分用量明显低于阳性对照。建议对其进行大面积示范推广。推荐剂量为800-1000倍稀释液，于苹果斑点落叶病发生初期(5月上旬)开始喷药防治，间隔10-14天左右喷药一次，连续喷施3-4次为宜。通过以上试验结果，证明本发明与现在技术相比，具有下述有益效果1、己知梧宁霉素产生菌是辽宁省微生物科学研究院从土壤中筛选的一株放线菌，命名为不吸7K链毒菌梧州亚禾中(5Yi"e/to迈yces3力/grosco/2'cfASst/zfep.伊股力oue/57's/.sw&sp)《微生物学报》1988年，28巻(1)85-87页，该菌种保存在辽宁省微生物菌种保藏中心，自申请日起20年内公众可从该中心获取该菌种。2、梧宁霉素在施药量明显小于阳性对照10%多抗霉素的情况下，800倍稀释样品在春梢停止抽生期时防治苹果腐烂病的效果高于多抗霉素，春梢停止抽生期时平均防效达83%以上，防治效果高于或等同现在大面积推广的生物农药。将梧宁霉素进一步推广，不仅可以提高防效，而且可以与其他生物农药交替使用，减缓抗性的产生；123、梧宁霉素具有广谱性，对酵母、对革兰氏阴性、阳性细菌以及真菌(包括病原真菌)等有抑制作用，通过室内和田间试验证明对苹果腐烂病防治效果提高到95%以上，对苹果斑点落叶病、水稻稻瘟病以及番茄灰霉病也有良好的防治效果；4、梧宁霉素是一株菌同时产生的含有4种成分的抗生素，属于环境友好型农药，且多种抗生素协同作用，可减少其他农药的使用，对维护生态环境有一定意义；5、梧宁霉素经试验证明是低毒的。急性毒性LD50为4000mg/kg,皮肤和粘膜刺激都无异常反应，Ames试验，CHL-1细胞SCE致突变和微核试验均为阴性。蓄积性毒性试验检查结果表明各器官均无明显异常，蓄积系数大于5.6，以上说明梧宁霉素毒性很低，急性毒性和食盐和小苏打相仿；6、利用本发明改进的梧宁霉素制备方法，不仅提高了梧宁霉素的生物效价(添加0.3-0.5%的正丙醇后，发酵液生物效价提高了15.5%),而且能使保质期增长。生产仍采用通用型发酵设备，工艺简单，周期短。生产原料价格便宜，生产过程中不存在三废问题，不会造成环境污染；具体实施例方式通过下面给出的具体实施例，可以进一步了解本发明。但它们并不是对本发明保护范围的限制。实施例l:梧宁霉素发酵液的制备本发明通过正交试验优选的培养基配方(1)种子发酵培养基每100毫升中含有黄豆饼粉1.0g，淀粉1.0g，葡萄糖0,7g，蛋白胨0.5g,硫酸镁0.03g，硫酸铵1.0g，磷酸氢二钾0.02g，碳酸钙0.7g，氯化钠O.lg，植物油0.2g,PII自然；(2)深层发酵培养基每100毫升中含有葡萄糖2.5g，淀粉l,5g，玉米曲1.0g，黄豆饼粉2,0g，蛋白胨(或玉米浆)0.5g，硫酸铵0.2g，硫酸镁0.03g，磷酸氢二钾0.02g，碳酸钙0.7g，氯化钠0.1g，植物油0.2g，灭菌后添加培养基体积0.4%的正丙醇，PH自然。本发明对发酵条件进行了优化(1)种子发酵液的制备按5-20%的接种量取不吸水链霉菌梧州亚种(5Yr印to/^cess々FgroscoA/c"ss"Z)5A,"z/o〃e/757'51/.s〃Zs^)菌株，于25-35。C在禾中子发酵培养基中培养20-24小时，通风量1:0.5-1(V/V)，转速150-300转/分钟，制取种子发酵液备用；(2)梧宁霉素发酵液的制备按5-20%的接种量取上述种子发酵液于25-35。C进行深层发酵培养，通风量前期0-12小时、中期12-40小时、后期40-42小时1:0.5-1(V/V)，转速150-300转/分钟，接种量5-20%，发酵周期64-72小时，得到梧宁霉素发酵液。实施例2-5:梧宁霉素防治苹果斑点落叶病应用实例<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求1、一种生物农药梧宁霉素的制备方法，是采用不吸水链霉菌梧州亚种(Streptomycesahygroscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)通过菌种液体深层发酵制取的生物农药---梧宁霉素，其特征在于它包括以下方法(1)种子发酵培养基制备每100毫升中含有黄豆饼粉0.5-1.5g，淀粉0.5-1.5g，葡萄糖0.5-1.5g，蛋白胨0.1-0.5g，硫酸镁0.01-0.05g，硫酸铵0.1-0.5g，磷酸氢二钾0.01-0.05g，碳酸钙0.1-1.0g，氯化钠0.05-0.15g，植物油0.2-0.5g，PH自然；(2)种子发酵条件和方法按5-20％的接种量取不吸水链霉菌梧州亚种(Streptomycesahygroscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)菌株，于25-35℃在种子发酵培养基中培养20-24小时，通风量1∶0.5-1(V/V)，转速150-300转/分钟，制取种子发酵液备用；(3)深层发酵培养基制备每100毫升中含有葡萄糖1.0-3.0g，淀粉1.0-2.0g，玉米面0.5-1.5g，黄豆饼粉1.0-2.0g，蛋白胨或玉米浆0.2-0.6g，硫酸铵0.1-0.5g，硫酸镁0.01-0.05g，磷酸氢二钾0.01-0.05g，碳酸钙0.1-1.0g，氯化钠0.05-0.15g，植物油0.2-0.5g，灭菌后加入培养基体积0.3-0.5％的正丙醇，PH自然；(4)梧宁霉素发酵液制备按5-20％的接种量取上述种子发酵液于25-35℃进行深层发酵培养64-72小时，通风量前期0-12小时、中期12-40小时、后期40-42小时1∶0.5-1(V/V)，转速150-300转/分钟，得到梧宁霉素发酵液。2、按照权利要求1制备的梧宁霉素作为生物农药在防治苹果斑点落叶病中的应用。全文摘要本发明公开了由不吸水链霉菌梧州亚种(Streptomycesahygroscopicussubsp.Wuzhouensisn.subsp)制备生物农药梧宁霉素的方法以及该方法所得产品在苹果斑点落叶病等病害防治中的用途。利用本发明方法制备的梧宁霉素，不仅提高了梧宁霉素的生物效价(添加0.3-0.5％的正丙醇后，发酵液生物效价提高了15.5％)，能使保质期延长；该梧宁霉素不仅对防治苹果腐烂病的效果提高到95％以上，而且对苹果斑点落叶病、番茄灰霉病等病害均有良好的防治效果；梧宁霉素对酵母、对革兰氏阴性、阳性细菌以及真菌(包括病原真菌)等有抑制作用，具有广谱性，属于环境友好型生物农药。文档编号C12P17/18GK101633941SQ20081001250公开日2010年1月27日申请日期2008年7月24日优先权日2008年7月24日发明者关艳丽,吴红艳,莉李,桓明辉,王志学,郭玲玲,飞陈,韩希军申请人:辽宁省微生物科学研究院