专利名称：：一种利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产l-苯丙氨酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种苯丙氨酸的制备方法，尤其涉及一种利用枯草芽孢杆菌(^^7^s发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，属于氨基酸发酵制备领域。
背景技术：
：L-苯丙氨酸又名L-苯基-a-氨基丙酸，英文名称L-Phenylalanine，分子式为C9HuN02，分子量为165.19，白色结晶粉末，略有特殊气味，味苦，熔点283'C(分解)，水中溶解度为3%，微溶于乙醇，不溶于醚。苯丙氨酸有外消旋DL-型、L-型和D-型，其中最重要的是L-苯丙氨酸，在自然界中主要存在于卵、乳和动物蛋白中，含量5%-6%，植物性蛋白质中约含1%。L-苯丙氨酸是人体所需8种必需氨基酸之一，人和动物自身不能合成，必须从外界摄取，也是生物体内合成酪氨酸的重要原料，在人体的代谢过程中具有重要作用。精制药典级L-苯丙氨酸可用于配制复合氨基酸输液，还可用于氨基酸类抗癌药物、营养保健品开发应用，目前我国医药行业每年需消耗L-苯丙氨酸500吨左右。L-苯丙氨酸最主要的一个用途是合成甜味剂阿斯巴甜(Aspartame,简称APM)。阿斯巴甜又称天冬甜素、蛋白糖，化学名为N-L-a-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸-l-甲脂，是一种由L-天门冬氨酸与L-苯丙氨酸(人体必须的营养物质)合成的二肽，可完全被人体吸收代谢，无毒无害，安全可靠，口味纯正清凉爽口酷似蔗糖，但甜度为蔗糖的200倍，热量仅为蔗糖1/200，常食不产生龉齿，不影响血糖，不引起肥胖、高血压、冠心病。阿斯巴甜进入人体后快速分解成天门冬氨酸和苯丙氨酸，不会积存于人体组织中，因此被世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)确定为A(1)级甜味剂，已经在世界上130多个国家地区批准使用，广泛添加在各种食品、副食品及各种软硬饮料中，目前使用阿斯巴甜的品种已达4000余种。阿斯巴甜国际市场需求量以年均15%20%的速度增长，远远高于其他人工甜味剂年均5%的增长速度。当前，全球L-苯丙氨酸的需求量在1.8万t以上，主要生产企业有美国孟山都、日本味之素、韩国大象公司等。美国是世界上L-苯丙氨酸的主要消费国，消费量约占世界需求量的一半，其次是西欧和日本。西欧的L-苯丙氨酸主要供Euro-Aspartame公司生产阿斯巴甜。2005年我国L-苯丙氨酸的生产能力约为400t/a，主要企业有浙江亚美生物化工股份有限公司、南昌化工有限责任公司、安徽科苑股份有限公司、平顶山易元制药有限公司、新疆伊宁复祥生化公司、江苏武进市牛塘化工厂等。2005年我国L-苯丙氨酸的需求量约为3500t，其中医药行业约需500t，合成阿斯巴甜约需3000t，绝大部分依赖进□。L-苯丙氨酸工业化生产工艺有两种酶法和直接发酵法。酶法工艺相对简单，但酶活性易受影响，需要特殊的氨基酸做氨基供体，并需要添加前体化学物，生产成本较高，这些因素限制了产酸率的提高和大规模工业化生产，国外从20世纪80年代中期逐步淘汰了酶法生产，而改用直接发酵法。直接发酵法就是用特殊微生物发酵葡萄糖等碳源，在微生物体内代谢合成L-苯丙氨酸并分泌到发酵液中。复旦大学采用诱变育种和基因工程技术相结合的方法选育获得了高产苯丙氨酸菌种；中国科学院成都生化所研究出了用红酵母转化肉桂酸制备L-苯丙氨酸的工艺；华东理工大学研究了直接发酵法生产工艺；南京工业大学开发了海因酶法工艺。直接发酵法省略了酶法生产中的酶促反应工艺，节省设备和原料投资，便于大规模工业化生产。然而，经检索在现有的直接发酵法制备L-苯丙氨酸的方法中，目前国内外还没有利用枯草芽孢杆菌发酵家禽羽毛大规模生产L-苯丙氨酸的方法。
发明内容针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用枯草芽孢杆菌(feci'"^幼6""s)发酵家禽羽毛大规模生产L-苯丙氨酸的方法。概括地说，本发明制备L-苯丙氨酸的方法是利用枯草芽孢杆菌(few77wYYW-1发酵家禽羽毛，通过一系列代谢过程，合成L-苯丙氨酸，然后通过732铵型树脂吸附和洗脱而制得L-苯丙氨酸。具体地说，本发明利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，步骤顺序如下(1)菌种选择选用枯草芽孢杆菌(Aao7A^仰6z^7A)YYW-1CGMCCNO.2396;(2)种子培养将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接12环于3040mL液体羽毛发酵种子培养基中，354(TC震荡培养2436小时，得种子液；(3)发酵培养摇瓶发酵以37%的体积比的接种量，将种子液接种于装有瓶体积40%60%羽毛发酵培养基的摇瓶中，354(TC，以150180转/分钟的转速摇瓶发酵48—60小时，发酵结束；发酵罐发酵以310%的体积比的接种量，将种子液接种于装有罐体积65%70%羽毛发酵培养基的发酵罐中，354(TC进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为180220r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3分钟计为11.11.2，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵4872小时，发酵结束；(4)发酵产物分离提纯待步骤(3)所述发酵结束后，向发酵液中加入盐酸，调节pH值至1.2士0.1，然后加入732铵型树脂，吸附2430小时；用纯水将吸附后的树脂洗至无铵离子，再将树脂放入阳离子交换柱中，用氨水解析，即得纯度为95%以上的L-苯丙氨酸浓溶液；上述羽毛发酵种子培养基及制备方法为按重量份氯化钠0.01-0.2份、氯化镁0.005-0.2份、氯化转0.001-0.2份、磷酸二氢钾0.01-0.2份、磷酸氢二钾0.02-0.5份、硫酸锰0.01-0.5份、酵母粉0.01-0.5份、废弃羽毛0,1-5.0份混合，加纯净水1-94份溶解，调节pH值至6-8，蒸汽灭菌后备用；上述羽毛发酵培养基及制备方法为按重量份氯化钠0.01-0.2份、氯化镁0.005-0.2份、氯化钙0.001-0.2份、磷酸二氢钾0.01-0.2份、磷酸氢二钾0.01-0.5份、酵母粉0.01-0.3份、废弃羽毛0.5-5.0份混合，加纯净水1-94份溶解，调节pH值至6-8，蒸汽灭菌后备用。上述利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法中，步骤(1)所述菌种选用枯草芽孢杆菌(^ac/W^幼&j7A)YYW-1，而且该菌己于2008年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.2396。上述枯草芽孢杆菌(^3W7"SW力"7A)YYW-1为发明人从废弃羽毛中分离筛选并鉴定的，该菌革兰氏阳性，直杆状，培养36小时形成大量芽孢，孢子囊柱状，中生到次端生，孢子囊基本不膨胀，菌体大小O.70.8WnX2.03.0m，芽孢大小约为0.9mX1.5Mffl，可以在15。C55i:温度下生长，最适生长温度范围为30°C40°C;该菌可以在NaCl浓度为0.1%7%范围内生长，而其最适的生长浓度范围为0.1%2%，当NaCl浓度为10%时，生长被抑制；最适生长pH范围为7.08.0，在pH5.7的沙氏葡萄糖培养液中可以生长；该菌的生理生化特征与伯杰鉴定手册中的典型特征完全一致。本发明所述利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法中，步骤(2)、(3)所述培养温度优选为37'C;步骤(2)所述培养时间优选为24小时；步骤(3)所述培养时间优选为48小时；步骤(4)所述吸附时间优选是24小时；所述的废弃羽毛优选是鸡毛；所述鸡毛是以常规方式粉碎为粒径约2mm的鸡毛粉。利用本发明方法制备的L-苯丙氨酸为光学纯度95%以上的L-苯丙氨酸浓溶液。本发明首次选用枯草芽孢杆菌发酵羽毛大规模制备高纯度L-苯丙氨酸。经检测，所用的枯草芽孢杆菌YYW-1发酵羽毛粉48小时，发酵液中L-苯丙氨酸含量达1.5克/升。本发明方法生产L-苯丙氨酸的原料成本低廉，实现了废弃物高值化利用，而且生产的L-苯丙氨酸光学纯度高，质量好，能够满足工业和医药行业的需要。具体实施方式实施例1:将枯草芽孢杆菌YYW-1种子液按照5%比例接入500mL羽毛粉发酵培养基中进行摇瓶培养。(1)菌种选择选用枯草芽孢杆菌(fec277"ss"6ti7/s)YYW-1CGMCCN0.2396;(2)种子培养将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接12环于3040mL液体羽毛发酵种子培养基中，37'C震荡培养24小时，得种子液；(3)摇瓶发酵培养以5%的体积比的接种量，将种子液接种于装有500mL羽毛发酵培养基的摇瓶中，37°C，以180转/分钟的转速摇瓶发酵48小时，发酵结束；取发酵液测定各种游离氨基酸含量，结果表明发酵后发酵液中游离氨基酸总量为2872.lmg/L，其中苯丙氨酸1869.7mg/L，占游离氨基酸总量的65.1%(结果见表1)。表1:YYW-1菌发酵鸡毛粉48h后发酵液中各种游离氨基酸含量(mg/L)名称含量(mg/L)名称含量(mg/L)Asp14.0Tyr450.4Thr12.0Phe1869.7Ser21.9Lys33.5Glu214.6lie16.5Gly25.9His5.6Ala23.6Arg9.3Cys51.7Pro1.3<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述羽毛发酵种子培养基及制备方法为按重量份氯化钠0.1份、氯化镁0.1份、氯化钙0.06份、磷酸二氢钾0.02份、磷酸氢二钾0.02份、硫酸锰0.05份、酵母粉0.02份、废弃羽毛2份混合，加纯净水80份溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌后备用；上述羽毛发酵培养基配方为氯化钠O.1%,氯化镁0.1%，氯化钙0.005%,磷酸二氢钾0.02%,磷酸氢二钾0.02%，酵母粉0.01%,废弃鸡毛2%，加余量的纯净水溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌。所述鸡毛是以常规方式粉碎为粒径约2rara的鸡毛粉。实施例2:(1)菌种选择选用枯草芽孢杆菌(few'77Ms"A"7is)YYW-1CGMCCNO.2396;(2)种子培养将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接12环于3040mL液体羽毛发酵种子培养基中，37'C震荡培养30小时，得种子液；(3)发酵罐发酵培养以5%的体积比的接种量，将种子液接种于装有0.65吨羽毛发酵培养基的1吨发酵罐中，37'C进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为220r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m、分钟计为l:1.1，罐内压力O.1±0.02MPa，发酵48小时，发酵结束；(4)发酵产物分离提纯待步骤(3)所述发酵结束后，向发酵液中加入盐酸，调节pH值至1.2土0.1，然后加入732铵型树脂，吸附24小时；用纯水将吸附后的树脂洗至无铵离子，再将树脂放入阳离子交换柱中，用氨水解析，即得纯度为95%以上的L-苯丙氨酸浓溶液；经检测，其中含L-苯丙氨酸质量为0.95千克。上述羽毛发酵种子培养基及制备方法为按重量份氯化钠0.1份、氯化镁0.1份、氯化钙0.06份、磷酸二氢钾0.02份、磷酸氢二钾0.02份、硫酸锰0.05份、酵母粉0.02份、废弃羽毛2份混合，加纯净水80份溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌后备用；上述羽毛发酵培养基配方为氯化钠O.1%,氯化镁0.1%，氯化钙0.005%,磷酸二氢钾0.02°/。，磷酸氢二钾0.02%，酵母粉0.01%,废弃鸡毛2%，加余量的净化水溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌。所述鸡毛是以常规方式粉碎为粒径约2mm的鸡毛粉。实施例3:(1)菌种选择选用枯草芽孢杆菌s"力"7is)YYW-1CGMCCNO.2396;(2)种子培养将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接12环于40mL液体羽毛发酵种子培养基中，37'C震荡培养36小时，得种子液；(3)发酵罐发酵培养以10%的体积比的接种量，将种子液接种于装有35吨羽毛发酵培养基的50吨发酵罐中，37t:进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为180iVmin，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3分钟计为1:1.2，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵72小时，发酵结束；(4)发酵产物分离提纯待步骤(3)所述发酵结束后，向发酵液中加入盐酸，调节pH值至1.2土0.1，然后加入732铵型树脂，吸附24小时；用纯水将吸附后的树脂洗至无铵离子，再将树脂放入阳离子交换柱中，用氨水解析，即得纯度为95%以上的L-苯丙氨酸浓溶液；经检测，其中含L-苯丙氨酸质量为50千克。上述羽毛发酵种子培养基及制备方法为按重量份氯化钠0.1份、氯化镁0.1份、氯化钙0.06份、磷酸二氢钾0.02份、磷酸氢二钾0.02份、硫酸锰0.05份、酵母粉0.02份、废弃羽毛2份混合，加纯净水85份溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌后备用；上述羽毛发酵培养基配方为氯化钠O.1%，氯化镁O.1%，氯化钙0.004%,磷酸二氢钾0.02%,磷酸氢二钾0.01%，酵母粉0.01%,废弃鸡毛3%，加余量的纯净水溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌。所述鸡毛是以常规方式粉碎为粒径约2mm的鸡毛粉。实施例4:(1)菌种选择选用枯草芽孢杆菌(feci""s幼/^.h'5)YYW-1CGMCCNO.2396;(2)种子培养将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接12环于40mL液体羽毛发酵种子培养基中，37'C震荡培养32小时，得种子液；(3)发酵罐发酵培养以10%的体积比的接种量，将种子液接种于装有1.3吨羽毛发酵培养基的2吨发酵罐中，37'C进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为200r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3分钟计为1:1.1，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵60小时，发酵结束；(4)发酵产物分离提纯待步骤(3)所述发酵结束后，向发酵液中加入盐酸，调节pH值至1.2土0.1，然后加入732铵型树脂，吸附24小时；用纯水将吸附后的树脂洗至无铵离子，再将树脂放入阳离子交换柱中，用氨水解析，即得纯度为95%以上的L-苯丙氨酸浓溶液；经检测，其中含L-苯丙氨酸质量为1.8千克。上述羽毛发酵种子培养基及制备方法为按重量份氯化钠0.1份、氯化镁0.1份、氯化钙0.05份、磷酸二氢钾0.02份、磷酸氢二钾0.02份、硫酸锰0.07份、酵母粉0.02份、废弃羽毛2份混合，加纯净水90份溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌后备用；上述羽毛发酵培养基配方为氯化钠O.1%,氯化镁O.1%，氯化钙0.004%,磷酸二氢钾0.02%,磷酸氢二钾0.01%，酵母粉0.01%,废弃羽毛3%，加余量的净化水溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌。所述羽毛是鸡毛、鸭毛等重量比的混合体，是以常规方式粉碎为粒径约2mra的羽毛粉。权利要求1.一种利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，步骤顺序如下(1)菌种选择选用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YYW-1CGMCCNO.2396；(2)种子培养将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于30～40mL液体羽毛发酵种子培养基中，35～40℃震荡培养24～36小时，得种子液；(3)发酵培养摇瓶发酵以3～7％的体积比的接种量，将种子液接种于装有瓶体积40％～60％羽毛发酵培养基的摇瓶中，35～40℃，以150～180转/分钟的转速摇瓶发酵48-60小时，发酵结束；发酵罐发酵以3～10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有罐体积65％～70％羽毛发酵培养基的发酵罐中，35～40℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为180～220r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶1.1～1.2，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵48～72小时，发酵结束；(4)发酵产物分离提纯待步骤(3)所述发酵结束后，向发酵液中加入盐酸，调节pH值至1.2±0.1，然后加入732铵型树脂，吸附24～30小时；用纯水将吸附后的树脂洗至无铵离子，再将树脂放入阳离子交换柱中，用氨水解析，即得纯度为95％以上的L-苯丙氨酸浓溶液；上述羽毛发酵种子培养基及制备方法为按重量份氯化钠0.01-0.2份、氯化镁0.005-0.2份、氯化钙0.001-0.2份、磷酸二氢钾0.01-0.2份、磷酸氢二钾0.02-0.5份、硫酸锰0.01-0.5份、酵母粉0.01-0.5份、废弃羽毛0.1-5.0份混合，加纯净水1-94份溶解，调节pH值至6-8，蒸汽灭菌后备用；上述羽毛发酵培养基及制备方法为按重量份氯化钠0.01-0.2份、氯化镁0.005-0.2份、氯化钙0.001-0.2份、磷酸二氢钾0.01-0.2份、磷酸氢二钾0.01-0.5份、酵母粉0.01-0.3份、废弃羽毛0.5-5.0份混合，加纯净水1-94份溶解，调节pH值至6-8，蒸汽灭菌后备用。2.如权利要求1所述利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)所述菌种选用枯草芽孢杆菌(fe^77^犯力"7A)YYW-1，而且该菌已于2008年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.2396。3.如权利要求1所述利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)所述培养温度为37°C。4.如权利要求1所述利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述培养时间为24小时。5.如权利要求1所述利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养时间为48小时。6.如权利要求1所述利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，步骤(4)所述吸附时间是24小时。7.如权利要求1所述利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述的废弃羽毛是鸡毛。全文摘要本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌发酵羽毛生产L-苯丙氨酸的方法，是将废弃羽毛，氯化钠，氯化镁，氯化钙，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾、酵母粉按照比例混合，加净化水溶解，热处理灭菌；然后接入枯草芽孢杆菌YYW-1CGMCCNO.2396，35～40℃发酵48～72小时，发酵产物酸调后经732铵型阳离子交换树脂吸附和洗脱而获得L-苯丙氨酸浓溶液。本发明方法原料成本低廉，实现了废弃物高值化利用，而且生产的L-苯丙氨酸光学纯度高，质量好，能够满足工业和医药行业的需要。文档编号C12R1/125GK101240302SQ20081001439公开日2008年8月13日申请日期2008年3月14日优先权日2008年3月14日发明者尤升波,岳寿松,游银伟,王翠萍,谷玉霞,黄亦钧申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心