专利名称：一种酶法合成l-茶氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种L-茶氨酸的合成方法，尤其涉及一种以L-谷氨酰胺-铜(II)配合 物为谷氨酰供体，利用Y-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸的方法。
技术背景茶氨酸属酰胺类化合物，是茶叶的特征氨基酸，也是茶叶的主要呈味物质之一，大 量存在于茶树中，是一种非蛋白游离氨基酸。茶氨酸作为一种氨基酸，也有D型和L 型，但天然存在的茶氨酸均为L型。L-茶氨酸除了调味之外，还具有很多生理功能镇 静和松弛神经作用；增强学习记忆能力；降血压作用；抗肿瘤作用和提高抗癌药物的疗 效；保护脑神经作用；减肥作用；抗疲劳作用。因此，L-茶氨酸可用于药品，保健品， 化妆品等各行业。目前L-茶氨酸的生产方法主要有化学合成法、发酵法和提取法。化学合成法制备 L-茶氨酸采用的均为谷氨酸的衍生物与乙胺或乙胺化合物反应，涉及到谷氨酸的保护与 脱保护，反应路线复杂，条件苛刻，副反应多，且容易产生消旋体，同时大量有机溶剂 会污染环境。而发酵法有以下不足产物浓度和转化率较低、发酵时间过长、下游分离 难度大、设备成本高。提取法就是从茶叶组织中直接提取，由于茶氨酸在茶叶中含量很 低，因而提取法并不适于大量制备。近年来，由于L-茶氨酸的生理功能不断被发现，L-茶氨酸的应用研究受到越来越多 的重视。目前，L-茶氨酸已在日本和欧洲被正式批准为食品添加剂，并广泛应用；L-茶 氨酸在药品中的应用也在开发之中。随着L-茶氨酸的市场需求日益扩大，有关其合成技 术的研究也受到广泛的关注。专利WO2004016798公开了一种酶法合成茶氨酸的方法。该方法从自然界土壤中分 离选定香茅醇假单胞菌GEA作为具有Y-谷氨酰基转移活性的茶氨酸生产菌，在pH为 9 12的条件下，以L-谷氨酰胺和乙胺为底物，将来自该菌的谷氨酰胺酶用于催化制备 茶氨酸。专利WO2006001296在前述专利方法上做了扩展改进，使用来自芽孢杆菌属、 霉菌或酵母中的一种或两种以上的来自微生物的谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺和乙胺衍生 物反应，生成L-茶氨酸。该方法主要考察了不同菌种、不同活性的酶对反应进行催化。但是上述酶法均以L-谷氨酰胺为底物，存在自转肽问题，即由于L-谷氨酰胺具有a-氨基，在实际反应中也可作为Y-谷氨酰受体，形成谷氨酰谷氨酰胺(Ghi-Gln)。 发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法合成L-茶氨酸的方法，以避免自转肽现象。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下 一种酶法合成L-茶氨酸的方法，包括如下步骤1、 利用化学法合成底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物；2、 将Y-谷氨酰转肽酶加入到含有底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物和乙胺的混合水 溶液中，L-谷氨酰胺-铜(II)配合物的起始浓度为3~6mmol/L，乙胺的起始浓度为 50~200mmol/L，，谷氨酰转肽酶的加入体积为底物混合水溶液体积的"16%，反应pH 为8.0~11.0，反应温度为35~45 °C，反应时间为2~5小时，得L-茶氨酸-铜(II)配合物；3、 在反应液中加入盐酸使L-茶氨酸-铜(II)配合物分解为L-茶氨酸；4、 将所得茶氨酸溶液分离，浓縮，结晶。步骤l中，化学法合成L-谷氨酰胺-铜(II)配合物是本领域技术人员已知技术。底 物L-谷氨酰胺通过金属配位，保护了L-谷氨酰胺上的a-氨基，解决了L-谷氨酰胺的自 转肽问题，从而提高转化率。步骤2中，反应受体乙胺的比例高，有利于反应转化率的提高。其反应方程式如下步骤2中，优选纯度大于95%的？谷氨酰转肽酶，其加入体积为底物混合水溶液体 积的1%。上述Y-谷氨酰转肽酶可通过如下方法制备a、 常规方法培养5a"7to犯to7fcNX-2 ，发酵产y-谷氨酰转肽酶。b、 利用蛋白分离纯化系统制备，谷氨酰转肽酶。步骤a中，产酶微生物枯草芽孢杆菌5ad//^ wM/fc NX-2 (保藏号为CGMCC No . 0833 )的培养条件为以单糖或双糖作为碳源，如葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；氮源以有 机氮源为佳，效果最好的是玉米浆和酵母膏。该菌是好氧培养菌，在pH8 9、温度30~40 °C的通气条件下，生长良好。在发酵时使用液体培养， 一般发酵周期在20-30小时。步骤b中，可采用AKTATM explorer 100蛋白纯化仪(Amersham Pharmacia公司生产)分离纯化Y-谷氨酰转肽酶，该纯化方法对本领域普通技术人员而言，属于一般的分 离纯化过程。设备使用的依照该系统的使用手册即可。步骤2中，供体L-谷氨酰胺-铜(II)配合物与受体乙胺的起始摩尔比优选3: 25 100。步骤3中，加入盐酸的目的是破坏L-茶氨酸-铜(II)配合物的结构，利用酸性条件 下氨基酸金属螯合物分解而得到茶氨酸。若选用lmol/L盐酸，则加入体积为步骤2得 到的反应液体积的8~10%。步骤4中，可利用乙醇沉淀法分离纯化L-茶氨酸，用乙醇沉淀法分离纯化茶氨酸技 术为本领域技术人员公知技术。本发明的有益效果如下1、 本发明采用L-谷氨酰胺-铜(II)配合物为反应供体，L-谷氨酰胺的a-氨基用金 属离子螯合保护，解决了L-谷氨酰胺在Y-谷氨酰转肽酶催化下会发生自转肽的问题，从 而使反应相对供体谷氨酰胺的转化率得到很大提高。2、 本发明采用？谷氨酰转肽酶催化L-谷氨酰胺-铜(II)配合物与乙胺转肽反应， 仅需一步就可以得到L-茶氨酸-铜(II)配合物，加入盐酸即可得到产物L-茶氨酸。与 化学合成法相比，反应简单，收率高，不需对游离羧基进行复杂的保护与脱除，反应过 程中也不会产生消旋体。3、 本发明采用的，谷氨酰转肽酶是通过分离纯化得到的精制酶，反应在碱性的水 溶液中进行，转化率高(详见实施例转化效果)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。 实施例1:取蔗糖15g ，玉米浆30g ，蛋白胨15g ， K2HP04 15g , MgS04 0.5g ， pH7.5加自 来水配制成1L液体培养基，按此配方配制3.5L装入5L发酵罐中O.lMPa高压蒸汽灭 菌25分钟备用。同时分装50mL培养基到500mL，加8层纱布，用牛皮纸包好后，与 发酵罐一起灭菌备用。将冰箱内保存的菌种——枯草芽抱杆菌5ac/〃ws wW/fcNX-2 (保藏号为CGMCC No.0833 )取出后，接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g/L ):蛋白胨IO ，牛肉 膏3，NaC15 ，琼脂20 )上，活化培养24小时，接入种子培养基(种子培养基(g / L ): 葡萄糖15，玉米浆IO，蛋白胨IO， K2HP042， MgSO40.25 )在33。C、 220r/min振荡 培养20小时。培养结束接入发酵罐，于33。C、 200r/min，发酵培养40小时。发酵结束后，8000 r/min离心25分钟，收集上清液。以60%~90%饱和度的硫酸铵 梯度进行蛋白质分级沉淀，分离出的蛋白用等体积Tris-HCl (pH8.0，0.05mol/L)复溶， 用疏水层析分离，收集30%洗脱液(pH8.0， 0.05mol/LTris-HCl )浓度处的洗脱峰，10万分子量的透析袋透析过夜，PEG20000浓縮，再用DEAE离子交换层析分离，20 %~75%洗脱液(pH8.0， 0.05mol/LTris-HCl， 0.5mol/LNaCl)(约25min )梯度洗 脱处第一个洗脱峰得到纯的(纯度>95%) Y-谷氨酰转肽酶(比活为59.6U/mg蛋白)。(疏 水层析及DEAE离子交换层析的方法为本领域普通技术人员公知的技术)。 实施例2:称取7.3g (O.lmol) L-谷氨酰胺，4.2g碳酸氢钠溶解于50mL水，通过恒流泵流加 50mL五水合硫酸铜，控制反应温度在6(TC左右。流加结束后，室温继续反应约2小时， 然后过滤、洗涤、干燥、得到L-谷氨酰胺-铜(II)配合物。 实施例3:取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物10.6mg(0.03mmo1)于2.5mLTris-HCl 缓冲液中(pH9， 0.1mol/L)，加入2.5mL400mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的？ 谷氨酰转肽酶0.8mL，混合均匀置于水浴锅反应2小时，反应温度为37'C 。反应结束 后，反应液加入lmol/L盐酸(体积为反应液10%)混匀，用高效液相色谱系统分析检 测(色谱分离条件色谱柱为DI0NEX1 Acclaim120 C18;检测波长为200nm;流 动相为95%水(含196。三氟乙酸)，5%乙腈；流速lmL/min)，对谷氨酰胺的转化率 为71% 。实施例4:取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物53mg (0.15mmo1)于12.5mLTris-HCl (pH 9， O.lmol /L)，加入12.5mL 400mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的y-谷氨酰 转肽酶4mL，混合均匀置于水浴锅反应3小时，反应温度为40'C。反应结束后，反应 液加入lmol/L盐酸混匀(体积为反应液10%)，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分 离条件色谱柱为DIONEXlAcclaiml20 5pC18，检测波长为200nm，流动相为95%水 (含196。三氟乙酸)，5%乙腈，对谷氨酰胺的转化率为70.8%。 实施例5:取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物0.075mmo1于12.5mLTris-HCl (pH 9， O.lmol /L)，加入12.5mL 15Ommol/L的乙胺，再加入实施例1得到的y-谷氨酰转肽酶 0.25mL，混合均匀置于水浴锅反应5小时，反应温度为45 °C 。反应结束后，反应液加 入lmol/L盐酸混匀(体积为反应液10%)，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条 件色谱柱为DIONEXlAcclaiml20 5nC18，检测波长为200nm，流动相为95%水(含 1%。三氟乙酸)，5%乙腈，对谷氨酰胺的转化率为64.2%。 实施例6:同实施例4的方法，所不同的是取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物0.125mrno1于12.5mLTris-HCl(pH11.0， 0.1mol/L)，加入12.5mL300腿ol/L的乙胺。 对谷氨酰胺的转化率为67.1%。 实施例7:同实施例4的方法，所不同的是取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物 0.075mmo1于12.5mLTris-HCl(pH8.0， 0.1mol/L)，加入12.5mL 100mmol/L的乙胺。 对谷氨酰胺的转化率为57.5%。 实施例8:由实例4得到的茶氨酸反应液，超滤去除酶蛋白，然后减压蒸发结晶，无水乙醇重 结晶。得茶氨酸25.25mg。
权利要求
1. 一种酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)利用化学法合成底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物；(2)将γ-谷氨酰转肽酶加入到含有底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物和乙胺的混合水溶液中，L-谷氨酰胺-铜(II)配合物的起始浓度为3～6mmol/L，乙胺的起始浓度为50～200mmol/L，γ-谷氨酰转肽酶的加入体积为底物混合水溶液体积的1～16％，反应pH为8.0～11.0，反应温度为35～45℃，反应时间为2～5小时，得L-茶氨酸-铜(II)配合物；(3)在反应液中加入盐酸使L-谷氨酰胺-铜(II)配合物分解为茶氨酸；(4)将所得茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶。
2、 根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸方法，其特征在于所述Y-谷氨酰转肽 酶的纯度大于95%。
3、 根据权利要求2所述的酶法合成L-茶氨酸方法，其特征在于Y-谷氨酰转肽酶的 加入体积为底物混合水溶液体积的1%。
4、 根据权利要求l所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(3)中，加入 体积为反应液体积8~10%的lmol/L盐酸。
5、 根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(4)中，利用 乙醇沉淀法分离纯化L-茶氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种用L-谷氨酰胺-铜(II)配合物为供体酶法制备L-茶氨酸的方法，包括利用化学法合成L-谷氨酰胺-铜(II)配合物；将γ-谷氨酰转肽酶加入到含有底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物和乙胺的混合水溶液中反应。利用本方法可避免自转肽问题，且大大提高对供体的转化率，操作简单，条件温和，成本低。
文档编号C12P13/00GK101270376SQ20081002483
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月14日 优先权日2008年5月14日
发明者吴明刚, 治 周, 忠 姚, 虹 徐, 邓海霞, 萍 韦 申请人:南京工业大学