一种产1,3-丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种产1,3-丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及一种产1,3-丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用。
技术背景1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工和医药中间体原料，是合成新型聚酯高分子材 料聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的单体。与聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸 丁二酯(PBT)和尼龙等比较，PTT具有良好的印染特性、富有弹性、抗紫外线、静电 性好、可生物降解并再生利用等多种优良特性，因此PTT在纺织服装业、地毯装饰业、 工程塑料等众多领域有着十分广阔的应用前景。据估计，目前仅我国每年就需求PDO 上百万吨，而且在未来十年我国对PDO的需求量还将继续增大。PTT是目前国际上公 认的六大石化新产品之一。PTT生产的关键在于单体原料PDO的来源，其生产成本直 接影响着PTT的工业化生产和应用规模。1,3-丙二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法目前仅有国 外DuPont和Shell公司以及国内的少数几家单位在进行小规模工业化生产。技术路线 分别是德国Degussa公司的丙烯醛合成法专利技术和Shell公司开发的环氧乙垸合成 法，并用于聚合生产PTT。为了垄断市场，这两家跨国公司不对外销售用于PTT生产 的PDO，而只向客户销售PTT切片及其下游产品。同时，化学合成法存在设备投资大、 工艺要求严格、操作条件苛刻、有毒副产物多、产品提取难度大、三废处理成本高以及 生产原料依赖于不可再生的石油资源等问题，导致PTT材料及其原料产品PDO的价格 一直居高不下，制约其进一步的发展，因而我们采用微生物发酵法生产PDO，以可再 生资源——碳水化合物为原料，具有操作简便、反应条件相对温和、副产物少、污染少 且容易处理以及成本低廉等优点，引起了国内外相关企业和研究单位的高度重视，将具 有广泛的应用情景和开发潜力。微生物发酵法的生产方法包括 一是利用从自然界获得的菌株以甘油为底物直接发 酵生产1,3-丙二醇；二是构建基因工程菌以葡萄糖或甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇； 基因工程菌构建策略主要有5种5(1 )强化原始菌株中还原途径限速酶的表达及阻止副产物的代谢途径；(2) 将l,3-丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、 dhaT基因克隆到甘油生产菌中，以 希望能获得将葡萄糖转化为,3-丙二醇的基因工程菌；(3) 将甘油生产菌的DAR1、 GPP2基因克隆到1，3-丙二醇生产菌中，以希望能获 得将葡萄糖转化为1,3-丙二醇的基因工程菌；(4) 将产1，3-丙二醇的dha调控子基因克隆到大肠杆菌中，获得能转化甘油为1,3-丙二醇的基因工程菌；(5) 将1，3-丙二醇生产菌的关键酶基因WaB、 J/wT基因和甘油生产菌的DARl、 OPP2基因克隆到大肠杆菌中，从而获得能将葡萄糖转化为1,3-丙二醇的基因工程菌。目前，国外DuPont公司已经在大肠杆菌中成功构建了以葡萄糖为底物发酵1.3-丙 二醇的途径，产量高达135g/L。国内众多研究机构也纷纷针对产1,3-丙二醇途径中的关 键酶进行了深入的研究，在模式大肠杆菌成功表达关键酶基因，但产量水平较低，而针 对原始生产菌株肺炎克雷伯氏菌的基因工程手段改造鲜见报道，随着国际范围内生物柴 油工业的广泛兴起，将产生大量的剩余副产品甘油，为利用发酵法制备1,3-丙二醇提供 的一定了丰富的原料。发明内容本发明的目的是提供一种产1，3-丙二醇基因工程菌。 本发明另一个目的是提供上述产1,3-丙二醇基因工程菌的制备方法。 本发明还有一个目的是提供上述产1,3-丙二醇基因工程菌的应用。 本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种产1,3-丙二醇基因工程菌，其分类命名为A7eZwe//a ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR。所述的产1，3-丙二醇基因工程菌，该工程菌是通过下列方法制备得到的利用PCR 技术从大肠杆菌中扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因;^MD (SEQIDNo.5)，从质 粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因TetR (SEQIDNo.6)，通过多克隆位点将 其串联到表达载体pUC18的合适位置，TetR基因置于j^MD的下游，得到重组质粒 pUCl8-yqhD-TetR，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌A7efo/e//a p"ewwo"/ae ATCC 25955， 得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产1,3-丙二醇基因工程菌A7e^/e//a戶ewwom'ae ATCC 25955-pUC18-yqhD墨TetB。进一步，所述的产1,3-丙二醇基因工程菌通过下列方法制备得到(1) 基因yqhD的克隆根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中基因的 序列设计合成PCR所需的引物P1 5，-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3' ( SEQ ID No. 1) P2: 5 '-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3' (SEQ ID No.2) 引物两端分别引入&oi I , Sa/wM,以大肠杆菌E.coli JM108或E.coli JM109基因 组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件95'C变性5min，经94'C30sec， 52'C30sec， 72'Clmin， 30个循环，再经过72'C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经 PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，五coi I， 酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，根据所述酶切位点连接至pUC18载体 的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD;(2) 基因TetK的克隆根据质粒载体pHY300PLK中四环素抗性基因序列设计合 成PCR所需的引物P3: 5，-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3， ( SEQ ID No.3) P4: 5'-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3， (SEQIDNo.4) 引物两端分别引入5flm/ZI，州mnn，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应； PCR反应条件:95'C变性5min,经94。C30sec， 52'C30sec， 72。Clmin， 30个循环，再 经过72'C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化 后，与pMD18-T载体连接，经万flwM， ///wHII酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶 切位点连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，TetR基因置于少^D的下游，得到重组质 粒pUC18-yqhD-TetR;(3) 重组基因工程菌的获得将重组质粒pUC18-yqhD-TetK转化肺炎克雷伯氏菌 p"e"momVze ATCC 25955，涂布含40 pg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为p"e!mw"/ae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR。所述的产1,3-丙二醇基因工程菌的制备方法，该方法包括下列步骤利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,从质粒载体pHY300PLK 中扩增出四环素抗性基因TetR，利用多克隆位点将其串联到表达载体pUC18的合适位 置，TetK基因置于^/2D的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetK,重组质粒转化肺炎克 雷伯氏菌A7eZwW/a/we"mom'ae ATCC25955，得到重组肺炎克雷伯氏菌，即产1，3-丙二 醇基因工程菌A7e&y/e〃a;we"wo"/ae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。进一步，所述的产1,3-丙二醇基因工程菌的制备方法包括下列步骤(1) 基因yqhD的克隆根据Genebank公布的大肠杆菌￡.co//K12中;^M)基因的 序列设计合成PCR所需的引物P1: 5 ，-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3' P2: 5 ，-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3'引物两端分别引入五co7 I ， ^m//1,以大肠杆菌E.coliJM108或E.coliJM109基因 组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件95。C变性5min，经94。C30sec, 52'C30sec， 72。Clmin， 30个循环，再经过72。C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经 PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，， 酶切重组pMD18-T载体，回收其中U6kb片段，根据所述酶切位点连连接至pUC18 载体的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD;(2) 基因Tef的克隆根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合 成PCR所需的引物P3: 5 ，-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3' P4: 5'-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3'引物两端分别引入万"w/ZI， ///"d III,以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应； PCR反应条件:95。C变性5min，经94。C30sec， 52。C30sec， 72°C lmin 30个循环,再经 过72。C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后， 与pMD18-T载体连接，经BamM， ///"c/III酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶切位 点连连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，TetR基因置于y^D的下游，得到重组质粒 pUC18-yqhD-TetR;(3) 重组基因工程菌的获得将重组质粒pUC18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌 人7eZw/e〃"戶ez朋o"/fle ATCC 25955，涂布含40 fig/mL的四环素平板，挑取阳性转化子， 并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为幻e^'e/to戶ewno"/ae ATCC 25955-pUC 18-yqhD-TetR 。所述的产 1,3-丙二醇基因工程菌 A7e^/e/to ;we"wo"/fle ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR在生产1,3-丙二醇中的应用。所述的应用，该基因工程菌以甘油为底物发酵生产i,3-丙二醇，具体生产工艺为 (1)出发菌株幻e^7W/"; "ewwow^ ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR; (2) 种子培养基酵母膏4-5g/1，麦芽3.0-4.0 g/1，蛋白胨4-5g/1， NaC18-12g/l'四环素浓度20-40ug/l;种子培养250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31-37 'C,摇床转速120-180 r/min, 培养12-24h;(3)发酵培养培养基组成酵母膏4-5 g/l， K2HP04'3H20 8-12 g/l， KH2P04 1.5-2.5 g/l， NH4C1 0.8-1 g/1, NaCl 0.3-0.6 g/I， MgS04'7H20 0.08-0.12 g/，FeCl3.6H20 25-35 mg/l， CoCl2-6H20 4-6 mg/l， VitaminB12 4-6 mg/l， glycerol 50-70 g/1;培养条件接种量10v/v。/。，发酵温度31-37'C，接种6小时好氧发酵，加入IPTG 诱导，IPTG的终浓度1.0mmol/L，此后，控制氧气的通入量(0.4-0.8L/min)，维持微氧 环境发酵即可。分批补料流加甘油维持甘油浓度在20-30 g/L。发酵时间30-60 h。 本发明有益效果本发明在于提供一种新型基因工程菌，用于发酵产1,3-丙二醇，该菌在微氧条件下 利用甘油高效发酵产1,3-丙二醇，突破了传统的厌氧发酵途径和微氧条件下低效率生产 1,3-丙二醇的局限。分批补料发酵完毕可利用130g/L的甘油，得到1,3-丙二醇73g/L， 摩尔转化率近68%，接近理论最高水平(理论转化率72%);在相同条件下，原始菌株只 能利用120g/L的甘油，得到53 g/L的1,3-丙二醇，与原始克雷伯氏菌相比，重组菌株 的生产1,3-丙二醇的能力得到显著提高，提高了对底物甘油的利用能力和转化率。与目 前文献所报道利用基因手段构建重组微生物生产1,3-丙二醇方法相比，不仅质粒在宿主 菌株中稳定性高，而且产物终浓度也较高(目前文献所报道的利用基因工程手段改造肺 炎克雷伯氏菌生产1，3-丙二醇的产量在45g/L左右，质粒稳定性在40-50%左右，Zheng Ping， Process Biochemistry 41 (2006) 2160-269)，另外还可在发酵过程中添加微量四环 素，达到抑制部分杂细菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的染杂菌现象， 提高产物质量，发酵时间也有所縮短，为微生物发酵法工业化生产l,3-丙二醇奠定了良 好的基础。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1: K/efe/e〃a p"e"wo"/ae ATCC 25955-pUC 18-yqhD-TetR的构建 (1)基因yqhD的克隆根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中>^7D基因的 序列设计合成PCR所需的引物9PI: 5'-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3， (SEQ ID No.l) P2: 5'-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3' (SEQIDNo.2) 引物两端分别引入五coR I ， 5a/wM,以大肠杆菌E.coliJM 108或E.coli JM 109基 因组DNA为模板完成PCR反应PCR反应条件95'C变性5min，经94'C30sec, 52'C30sec， 72'Clmin， 30个循环，再经过72'C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分 析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，￡coR I , SawM酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，连接至pUC18载体，获得重 组质粒pUC18-yqhD(2)基因TeP的克隆根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合 成PCR所需的引物.P3: 5，-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3' (SEQ ID No.3) P4: 5，-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3， (SEQIDNo.4) 引物两端分别引入5aw//I， ///"d III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应 PCR反应条件95。C变性5min，经94。C30sec， 52。C30sec， 72'Clmin， 30个循环，再 经过72'C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化 后，与pMD18-T载体连接，经5aw//1， ///mnil酶切回收其中1.56kb片段，连接至 pUC18-yqhD载体的合适位置，TetR基因置于>^2D的下游，得到重组质粒 pUC18-yqhD-TetR。实施例2:重组质粒pUC18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955利用电穿孔仪将重组质粒pUC 18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌幻e^eZ/a ;wewno",'fle ATCC 25955，电转化条件参数为电压2.5kv，阻值200 Q，脉冲时间4.5 msec。电击转化完毕，将经过电击处理过的/^^W/fl/wewmo"/aeATCC25955涂布于含 有40 pg/m L四环素的LB培养基上，得到阳性克隆幻e^W/" / "e,o"/"e ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。实施例3:工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC8-yqhD-TetR的质粒稳定 性考察考察方法:从新鲜转化平板上挑取单菌落接种至3mL不含四环素的LB培养基中， 37 。C下培养12h作种子，转种培养24h ，即为传种20代，转种培养5次，即为100 代，将上述菌液涂布于不含抗生素的LB板上,从中挑选100个单菌落分别点在添加和不添加四环素的平板上，37 'C下培养12 16 h，比较在添加和不添加四环素的平板上 的菌落数即得其稳定性。考察结果传种100代之后其质粒稳定性为100%。实施例4:工程菌幻efo/e〃a/ "ewmom'ae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR利用甘油在 摇瓶中发酵产1,3-丙二醇(1) 出发菌株X/eZwW/o; "ewwo"/ae ATCC 25955-pUCl 8-yqhD-TetR;(2) 种子培养基酵母膏5g/1，麦芽3.0g/1，蛋白胨5g/l,NaC1.0g/l; 种子培养250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31'C，摇床转速180r/min，培养12h;(3) 发酵培养培养基组成酵母膏5g/l， K2HP04'3H20 10g/l， KH2P042g/l， NH4C1 1 g/l， NaCl 0.5 g/l， MgS04'7H20 0.1 g/I， FeCl3'6H20 30 mg/l， CoCl2'6H20 5 mg/l， VitaminBl2 5 mg/1, glycerol 60 g/1;发酵培养条件250ml摇瓶，装液量100ml，接种量5~10% (v/v),发酵温度37。C，摇床转速110rpm，发酵时间20h左右。发酵结果60 g/1的底物甘油经转化得到33.8 g/1的1,3-丙二醇。对比例1:原始菌A7efo/e//a p股"wow'aeATCC25955利用甘油在摇瓶中发酵产1，3-丙二醇(1) 出发菌株K/eZw'e〃a; "e"wo"/fleATCC25955(2) 种子培养基酵母膏5g/1,麦芽3.0 g/1,蛋白胨5g/l,NaCl 10g/l, 种子培养250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31。C，摇床转il 180r/min，培养12h。(3) 发酵培养培养基组成酵母膏5 g/1, K2HP04'3H20 10 g/l， KH2P04 2 g/l， NH4C1 1 g/l， NaCl 0.5 g/1, MgS04-7H20 0.1 g/1, FeCl3'6H20 30 mg/l， CoCl2'6H20 5 mg/l， VitaminB12 5 mg/I， glycerol 60 g/1发酵培养条件250ml摇瓶，装液量100ml,接种量5~10°/。 (v/v)，发酵温度37。C， 摇床转速llOrpm，发酵时间20h左右。发酵结果60 g/1的底物甘油经转化得到29.8 g/1的1,3-丙二醇。实施例5:工程菌;we"wo"/ae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR利用甘油在113L发酵罐中分批补料发酵生产产1，3-丙二醇(1 )出发菌株尺/eZw'e〃a; "ewmo"/ae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR;(2) 种子培养基酵母膏5g/1，麦芽3.0g/1，蛋白胨5g/1， NaC110g/l; 种子培养250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31'C，摇床转速180r/min，培养12h。(3) 发酵培养培养基组成酵母膏5g/l， K2HP04'3H20 10 g/1, KH2P042g/l, NH4Cl 1 g/l， NaCl 0.5 g/l， MgS04.7H20 0.1 g/1, FeCl3'6H20 30 mg/l， CoCl2'6H20 5 mg/l， VitaminB12 5 mg/1, glycerol 30 g/1;培养条件3L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ)，接种量10% (v/v)，发酵温度 37'C，接种6小时好氧发酵，6小时之后控制通气量(0.4-0.8L/min)维持微氧环境发酵。 发酵时间45土lh，分批补料流加甘油维持甘油浓度在25 ±lg/L。发酵结果底物甘油消耗130g/L，产物l， 3-丙二醇浓度73 g/L。 对比例2:原始菌夂/efe/e〃a戸ewwo"/ae ATCC25955利用甘油在3L发酵罐中添加 分批补料发酵生产产1,3-丙二醇(1) 出发菌株A7efc/e〃a;w"w2om'aeATCC25955(2) 种子培养基酵母膏5g/1，麦芽3.0g/1，蛋白胨5g/1， NaC110g/l; 种子培养250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31'C，摇床转速180r/min,培养12h。(3) 发酵培养培养基组成酵母膏5g/l， K2HP04'3H20 10g/l， KH2P042g/l, NH4C11 g/l， NaCl 0.5 g/l， MgS04'7H20 0,1 g/1 ， FeCl3.6H20 30 mg/1, CoCl2'6H20 5 mg/1, VitaminBl2 5 mg/l， glycerol 30 g/1;培养条件3L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量10% (v/v)，发酵温度 37°C，接种6小时好氧发酵，6小时之后维持微氧环境(0.4-0.8L/min)发酵。发酵时间50 ±lh,分批补料流加甘油维持甘油浓度在25士1 g/L。发酵结果底物甘油消耗120g/L，产物l， 3-丙二醇浓度53g/L。〈110〉南京工业大学〈120〉 一种产l, 3-丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用 <歸6<210> 1<211〉 25<212〉 DNA <213〉人工引物 <220>〈223>上游引物〈400〉 1gaattcatga gctatcgtat gtttg 25〈210〉 2〈211〉 25<212〉 DNA <213〉人工引物 <220〉<223>下游引物〈400> 2ggatcccact cagaatgcct ggcgg 25〈210〉 3〈211〉 26<212> DNA <213〉人工引物 <220>〈223〉上游引物<400〉 3ggatccatga aatactgaat ttaaaa 26<210〉 4<211> 26 〈212〉腿 <213>人工引物 <220>〈223〉下游引物〈400〉 4aagcttctta acgatttaga aatccc 26<210> 5 <211> 1164 <212> DNA〈213>来自大肠杆菌(E.coli) JM108或JM109 <220〉〈223〉 yqhD序列 <400〉 5atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60 ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120 gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180 gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240 gUcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggUggcg gcggttctgt actggacggc 300 accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360 caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420 gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480 caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540 tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600 gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660 ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720 cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780 ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840 cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900 cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat %0 gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020 acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080 gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtc鄉cgc 1140 cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164<210〉 6 〈211〉 1560 〈212〉腿〈213〉来自质粒pHY300PLK <220>〈223〉四环素抗性基因 〈400〉 6atgaaatact gaatttaaaa cttagtttat atgtggtaaa atgttttaat caagtttagg 60 aggaattaat tatgaagtgt aatgaataat gaatgtaaca gggttcaatt aaaagaggga 120 agcgtatcat taaccctata aactacgtct gccctcatta ttggagggtg aaatgtgaat 180acatcctatt cacaatcgaa tttacgacac tcttttttta gcgtatt犯a tgaaatggtt gattttaats aaccacctgc gagtacaaac tccattggaa cagctgteita tggaaagcta ctatttggaa ttataataaa ttgtttcggg ttttccttac ttattatggc tcgttttatt ctcgtaatgg ttgtagttgc gcgctatatt cttattggat cgatagtagc catgggagaa gcccattata ttcattggtc ctatcttcta ccgtttctta tgaaattatt a犯gaaagaa ggaattatac tsatgtctgt aggcattgta atttcttttc ttatcgttag cgtgctgtca gtaacagatc cttttgttga tcccggatta ctttgtgggg gaattatatt tggaacagtet atgaaagatg ttcaccagct aagtactgcc acaatgagtg tcattatttt cggctacatt ttatacgtgt t3犯cstcgg ￡Lgttacattt cttttaga犯caacatcatg gttcatgaca tcgttcacca aaacagttat atcaacaatt ggtgctggaa tgagtttgct taactttacc 3ttgtaggtg gtttattatc cataccctta gatcagtcaa cttatctgta tagtaatttg agttggctgg ttsccttgaa tgtatataaataatttggctttgcatttta240ttgaacgtctcattacctgatattgca犯t300tgggtg犯C3cagcctttatgttaaccttt360tctgatcaatt￡LggC3tC￡L￡taaggttactc420tcggtaattgggtttgttggccattctttc480c犯ggggctggtgcagctgcatttccagca540ataggggt犯agcatUggt600ggsgtcggtccagcgattggtggaatgata660ctcattcctatatcactgtt720gt犯ggat犯aaggtcattt780ttttttatgttgtttac犯catcataitagc840ttcctgatatttgtaaaacatatcagg犯a900taccttttatgattggagtt960gcagggtttgtctctatggttccttatatg1020g犯atcgg33gtgtaattattttccctgga1080ggtggg3t3Cttgttgatagaagaggtcct1140ctttctgttagctttttaactgcttccttt1200attataatcgmttgtttt郷tgggctt1260gtttcaagtsgcttg犯acagcaggaagct1320agctttttatcagaggg幼caggtattgca1380cttg3tc犯aggttgtt3CC1440ttattacttttttcagg犯tcattgtcatt1500cattctca犯gggatttctaaatcgttaag15601权利要求
1. 一种产1，3-丙二醇基因工程菌，其分类命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
2、 根据权利要求1所述的产1，3-丙二醇基因工程菌，其特征在于该工程菌是通过 下列方法制备得到的利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶 基因月M),从质粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因Tet11，通过多克隆位点将 其串联到表达载体pUC18的合适位置，TetK基因置于WMD的下游，得到重组质粒 pUC18-yqhD-TetR，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌A7efo/e〃a戶ewwo"/ae ATCC 25955， 得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产1,3-丙二醇基因工程菌幻efo!W/a ATCC 25955-pUC 18-yqhD-TetR 。
3、 根据权利要求2所述的产1，3-丙二醇基因工程菌，其特征在于该工程菌通过下 列方法制备得到(1) 基因yqhD的克隆根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中j^MD基因的 序列设计合成PCR所需的引物P1: 5 ，-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3' P2: 5 ，-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3'引物两端分别引入￡co/ I ，以大肠杆菌E.coli JM108或E.coli鹿09基因 组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件95。C变性5min，经94。C30sec， 52。C30sec， 72。Clmin， 30个循环，再经过72'C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经 PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，五coi I， 酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，根据所述酶切位点连接至pUC18载体 的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD;(2) 基因TetR的克隆根据质粒载体pHY300PLK中四环素抗性基因序列设计合 成PCR所需的引物P3: 5 '-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3' P4: 5 ， -AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3'引物两端分别引入^^m，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应； PCR反应条件:95。C变性5mb,经94。C30sec， 52。C30sec， 72。Clmin， 30个循环，再 经过72。C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，经SawM，历"^m酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶 切位点连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，TetK基因置于y^D的下游，得到重组质 粒pUC18-yqhD-TetR;(3)重组基因工程菌的获得将重组质粒pUC18-yqhD-Te^转化肺炎克雷伯氏菌 /:/efo/e//a戶ewmom'ae ATCC 25955,涂布含40 pg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子， 并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为A7e&/e//a; "ewwom'ae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR。
4、 如权利要求1所述的产1,3-丙二醇基因工程菌的制备方法，其特征在于该方法 包括下列步骤利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因 yqhD，从质粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因TetK，利用多克隆位点将其串 联到表达载体pUC18的合适位置，TetK基因置于y一D的下游，得到重组质粒 pUC18-yqhD-TetR，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌A7e&s7e〃fl; ""ww"〖ae ATCC25955，得 到重组肺炎克雷伯氏菌，即产1,3-丙二醇基因工程菌p"eWWom'ae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
5、 根据权利要求4所述的产1,3-丙二醇基因工程菌的制备方法，其特征在于包括 下列步骤(1) 基因yqhD的克隆根据Genebank公布的大肠杆菌￡.co// K12中基因的 序列设计合成PCR所需的引物PI: 5 ， -GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3' P2: 5，-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3'引物两端分别引入&oJ I ， 5fl"Lffl，以大肠杆菌E.coliJM108或E.coliJM109基因 组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件95。C变性5min，经94。C30sec， 52。C30sec， 72。Clmin， 30个循环，再经过72'C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经 PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，五coi I，万画/ZI 酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，根据所述酶切位点连连接至pUC18 载体的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD;(2) 基因Tef的克隆根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合 成PCR所需的引物P3: 5'-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3' P4: 5 ，-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3'引物两端分别引入万aw//1, ///"J III,以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应； PCR反应条件:95。C变性5min,经94。C30sec， 52。C30sec, 72。Clmin 30个循环，再经 过72'C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后， 与pMD18-T载体连接，经5owM， ///w/m酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶切位 点连连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，Tef基因置于^M)的下游，得到重组质粒 pUC18-yqhD-TetR;(3)重组基因工程菌的获得将重组质粒pUC18-yqhD-TetK转化肺炎克雷伯氏菌 A7e^/e//fl戶ewwow'ae ATCC 25955,涂布含40 ng/mL的四环素平板，挑取阳性转化子， 并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为A7efc/e〃a p"eiw7om'ae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR。
6. 权利要求1所述的产1,3-丙二醇基因工程菌A7efo/e//a ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetK在生产1,3-丙二醇中的应用。
7、 根据权利要求6所述的应用，其特征在于该基因工程菌以甘油为底物发酵生产 1，3-丙二醇，具体生产工艺为(1) 出发菌株A7efe/e〃"; "ewwo"/ae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR;(2) 种子培养基:酵母膏4-5g/1，麦芽3.0-4.0g/1，蛋白胨4-5g/l' NaC18-12g/1, 四环素浓度20-40 ug/l;种子培养250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31-37 'C，摇床转速120-180 r/min， 培养12-24h;。)发酵培养培养基组成酵母膏4-5 g/l， K2HP04'3H20 8-12 g/l， KH2P04 1.5-2.5 g/l， NH4C1 0.8-1 g/I， NaCl 0.3-0.6 g/l， MgS04.7H20 0.08-0.12 g/l， FeCl3.6H20 25-35 mg/l， CoCl2'6H20 4-6 mg/l， VitaminB12 4-6 mg/1, glycerol 50-70 g/1;培养条件接种量10v/v。/。，发酵温度31-37。C，接种6小时好氧发酵，加入IPTG 诱导，IPTG的终浓度1.0mmol/L，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境发酵即可。
全文摘要
本发明属于生物化工领域，公开了一种产1，3-丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用。该菌株分类命名为Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-Tet^R，由来自大肠杆菌的1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD与来自质粒pHY300PLK的四环素抗性基因Tet^R相连接，插入载体pUC18，转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955获得。该菌能显著提高甘油转化1，3-丙二醇的能力，提高了对底物甘油的利用能力和转化率，提高了产物1，3-丙二醇的终浓度，同时缩短了发酵时间，便于微生物发酵法工业化生产1，3-丙二醇。
文档编号C12R1/22GK101260379SQ200810024000
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月23日 优先权日2008年4月23日
发明者朱建国, 霜 李, 纪晓俊, 南 胡, 和 黄 申请人:南京工业大学