专利名称：：转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物
技术领域：
的提高抗蚜虫性的方法，特别是一种转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法。技术背景百合属植物(Liliums卯.)总称为"百合"。百合科(Liliaceae)植物为多年生露地鳞茎花卉。野生种或人工培育的培品种繁多，种质资源遗传变异十分丰富。据不完全统计，全世界百合属植物共有100多种(文献记录130种)。中国是百合属植物的自然分布中心之一，据文献记载原产中国百合属植物约55个种。其中有36个种、18个变种为中国所特有。属内许多种花朵硕大、花色艳丽多彩、花姿百态、芳香怡人，具有较高的观赏价值。百合作为高档的鲜切花商品之一，在世界各地广为栽培，在世界鲜切花市场中占有十分重要的地位。然而，目前绝大多数百合栽培品种不抗蚜虫。蚜虫已成为是危害百合生产的主要害虫之一，除其自身吸食百合汁液，致使百合生长不良以外，还通过传播各种病毒(如花叶病毒)而导致病毒病对百合造成间接危害。特别是近年来受大气温室效应的影响，我国百合主要种植地区百合生育期间气温升高，出现"暖冬"，致使蚜虫危害猖獗，每年在百合生产上因蚜虫及由其传播的病毒所造成的经济损失十分严重，如何有效防治蚜虫已成为百合生产上的重大问题之一。近年来研究发现，天南星科(Araceae)植物半夏(Pinelliaternata)凝集素(Pinelliaternataagglutinin,PTA)对嫁虫具有很强的抗性(黄大昉，潘映红，张淑香，曹景平，杨雪梅，张杰，尹蔚庄.从掌叶半夏和半夏中发现对几种釾虫有致死活性的蛋白。《中国农业科学》，1997年30巻第2期94页。)，前期的研究发现，转pta基因的转基因烟草对蚜虫的抗性明显提高(Yao，J.，Pang，Y.，Qi，H,,Wan,B.，Zhao，X.,Kong，W.,Sun，X.andTangK.(2003).TransgenictobaccoexpressingPinelliaternataagglutininconfersenhancedresistancetoaphids.TransgenicResearch12(6):715-722)，说明pta基因在植物抗蚜虫育种中具有很好的应用前景。然而，到目前为止，还没有利用转基因技术提高百合抗蚜虫性的报道。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法。本发明涉及的基因克隆、载体构建和遗传转化、转基因植物的分子检测及抗虫测定用于本发明，为利用基因工程技术培育抗蚜百合奠定坚实的基础。本发明是通过以下技术方案实现的采用RT-PCR技术从半夏中克隆出半夏凝集素基因pta，构建含pta基因的植物表达载体，利用根癌农杆菌介导法，将pta基因导入百合并经过抗生素筛选获得转化植株；利用PCR技术检测外源目的基因pta的整合情况，抗虫性试验测定转基因植株的抗蚜性，最终获得抗蚜性提高的转基因百合植株。本发明包括如下具体步骤(1)采用RT-PCR技术获得半夏凝集素基因pta;(2)将pta基因置于花椰菜花叶病毒35S启动子之后，构建成含pta基因的植物表达载体；(3)将含pta基因的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得用于转化百合的含Pta基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化百合无菌苗叶片，经过抗生素筛选，获得经PCR检测的转基因百合植株；(5)对获得的转基因百合植株进行抗虫性测定，最终获得抗蚜性提高的转基因百合植株。所述的经PCR检测的转基因百合植株是指，分别设计合成pta基因核心片段的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为转基因百合植株。本发明的转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法，采用转基因技术，将半夏凝集素基因pta导入百合植株中，然后通过抗虫性测定最终筛选获得抗蚜性提高的转基因百合植株，结果表明，在含半夏凝集素基因pta的转基因百合植株上存活的蚜虫数量同非转基因对照上的相比显著减少(P〈0.05)。本发明中所涉及的根癌农杆菌菌株为市场上公开出售的菌株EHA105，从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1采用RT-PCR技术获得半夏凝集素基因pta1.半夏总RNA的提取取少量半夏(来源于上海中医药大学)幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mLTRIzol(TRIzolReagents,GIBCOBRL，USA)的1.5mLEppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200叱氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min后，于4°C、12，000g离心15min;将上清液吸入干净的1.5mLE卯endorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4。C、12，000g离心10min;弃上清，加1mL75%乙醇清洗，振荡后，于4°C、7,500g离心5min;室温干燥15-20min后溶于适量(50叱)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。2.半夏凝集素基因pta的克隆采用RT-PCR技术克隆半夏凝集素基因pta，具体地，将所获的半夏总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，再根据所述半夏pta基因的编码序列(序列表中的序列1)设计扩增出pta基因完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后将扩增产物构建到pGEMT-easy测序载体上进行测序(采用3730自动测序仪进行测序)。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的半夏pta基因的编码序列(序列表中的序列1)一致。本实施例采用RT-PCR技术从半夏中获得序列正确的半夏凝集素基因pta，为利用转Pta基因提高百合抗蚜虫性提供了目的基因。实施例2将pta基因置于花椰菜花叶病毒35S启动子之后，构建含pta基因的植物表达载体1.含pta基因的植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-pta-nos的构建首先，采用HindIII和EcoRI双酶切植物表达载体pBI121质粒和pCAMBIA2300质粒，再利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段(pBI121的gus表达盒和pCAMBIA2300大片段)；再将回收片段同连接酶混合均匀并短暂离心后，于16'C恒温反应12小时，回收连接产物后将回收产物利用氯化钙冻融法转化大肠杆菌菌株DH5a，将转化后的菌液涂布在含羧苄青霉素的LB培养平板上，从长出的白色菌落中提取转化质粒进行PCR检测并酶切验证，获得中间载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos。进而，用实施例1中pta基因替换中间载体上的gus基因。具体地，利用BamHI/SacI双酶切pGEMT-easy+pta和中间载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收pta和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。实施例3将含pta基因的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得用于转化百合的含pta基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株将含pta基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300::p35S-pta-nos利用冻融法转入市售的根癌农杆菌菌株EHA105，并进行PCR验证。结果表明，含pta基因的植物双元表达载体己被成功构建到根癌农杆菌菌株中。本实施例获得了含半夏凝集素基因pta植物表达载体的根癌农杆菌菌株EHA105(pCAMBIA2300::p35S-pta-nos)，该菌株可用于通过转基因策略来提高百合抗蚜虫性的研究中。实施例4利用所构建的根癌农杆菌菌株转化百合无菌苗叶片,经过抗生素筛选，获得经PCR检测的转基因百合植株1.根癌农杆菌介导的pta基因转化百合叶片1.1.外植体的获得将麝香百合(LiliumlongiflorumThunb)"SnowQueen"的鳞茎用75%乙醇浸泡0.5min，再用20%NaClO浸泡20min后用无菌水冲洗3_4次，再用无菌吸水纸吸干表面水分，将鳞片切成0.5cm2的小块接种于诱导分化固体培养基[MS(MurashigeandSkoog,1962)+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.1mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝胶，pH值为5.8]中，于25°C、12h/12h(light/dark)光照培养，即可获得百合无菌苗。待苗长至7cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体(0.5cm2)用于转化。1.2.农杆菌与外植体的共培养将所述的叶片外植体，转到含活化好的EHA105(pCAMBIA2300::p35S-pta-nos)的液体共培养培养基(1/2MS+1mg/LNAA+0.5mg/L6_BA+AS100Wnol/L)中共培养，轻摇10-15min后，将外植体用无菌纸吸干多余菌液接至固体共培养基上，于28'C暗培养3d。1.3.抗性再生植株的筛选将所述的共培养3d后的百合外植体转入到发芽筛选培养基(MS+0.5mg/L6-BA十1rag/LIAA+75mg/LKan+250mg/LCb)上于25。C、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性芽。将生长良好的抗性芽剪下转入生根培养基(1/2MS+75mg/LKan+Cb125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生百合植株。2.转基因百合植株的PCR检测根据目的基因Pta核心序列设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出480bp的特异DNA片段。而以非转化百合基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。本实施例将所述的根癌农杆菌菌株转化百合，获得了经PCR检测的转基因百合植株。实施例5对获得的转基因百合植株进行抗虫性测定，最终获得抗蚜性提高的转基因百合植株按Yao等(Yao，丄，Pang,Y.,Qi，H.，Wan，B.，Zhao，X.，Kong,W.，Sun，X.andTangK.(2003).TransgenictobaccoexpressingPinelliaternataagglutininconfersenhancedresistancetoaphids.TransgenicResearch12(6):715-722)的方法对含半夏凝集素基因pta的转基因百合植株(10_20厘米高)进行蚜虫(桃蚜)抗性鉴定，在每株植株上接种5头蚜虫三龄若虫，13天后测定存活的蚜虫数。上述实施例采用转基因技术，获得了含基因pta的转基因百合植株。结果表明，在含半夏凝集素基因pta的转基因百合植株上存活的岈虫数量同非转基因对照上的相比显著减少，如表1所示，转半夏凝集素基因pta的百合植株对蚜虫的抗性得以提高，说明转pta基因是提高百合抗虫性的有效方法。表1转基因植株的抗蚜鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P<0.05序列表<110〉上海交通大学<120〉转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法〈160〉1<170〉Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉810<212〉DNA<213>半夏(Pinelliater皿ta)〈400〉11atggcctccaagctcctcctcttcctcctcccggccatcctcggcctcatcatcccgcgg61ccagccgtggcggtgggcaccaactacctactgtccggcgaaaccctagacacggacggc121catctgaagaatggcgacttcgactttatcatgcaggaagactgcaacgccgtcctgtac181aacggcaactggcagtccaacacggccaac已ctgcaagctcaccctcacc241gaccgcggcgagctcgtcatcaacaacggcgagggatccgccgtctggaggagcggctcc301cagtccgcgaagggc已actacgccgccgtcctccatccggggtcatctac361ggcccatccgtcttcaagatcaacccttgggtccccggcctcaacagcctgcggctcggc421aacgtccctttcacgtgcaacatgctcttctccggccaggtcctctacggcg已cggc卿481atcactgcgagctggtcatgc鄉gcgactgcaacctggtcctgtacggc541gggaagtgcgactggcagtcggca已cggcgagcactgcttcctccggctg601aaccac已已gggcgagctcatc已tcaaggatgacgacttcaagagc已tctggagcagccag661tccagctccaagcagggtgactacgtcttcatcctxcaggacaacggctacggcgtcatc721tacggccctgccatctgggcgaccagctcgaagcgctccgttgctgctcagg卿cgatg781atcggcatggtgacggagaaggtgaattaa权利要求1.一种转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法，其特征在于采用RT-PCR技术从半夏中克隆出半夏凝集素基因pta，构建含pta基因的植物表达载体，利用根癌农杆菌介导法，将pta基因导入百合并经过抗生素筛选获得转化植株；利用PCR技术检测外源目的基因pta的整合情况，抗虫性试验测定转基因植株的抗蚜性，最终获得抗蚜性提高的转基因百合植株。2.根据权利要求1所述的转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法，其特征是，包括如下具体步骤(1)采用RT-PCR技术获得半夏凝集素基因pta;(2)将pta基因置于花椰菜花叶病毒35S启动子之后，构建成含pta基因的植物表达载体；(3)将含pta基因的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105菌株，获得用于转化百合的含Pta基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化百合无菌苗叶片，经过抗生素筛选，获得经PCR检测的转基因百合植株；(5)对获得的转基因百合植株进行抗虫性测定，最终获得抗蚜性提高的转基因百合植株。3.根据权利要求1所述的转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法，其特征是，所述的经PCR检测的转基因百合植株是指，分别设计合成pta基因核心片段的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为转基因百合植株。全文摘要本发明是一种生物
技术领域：
的转pta基因提高百合抗蚜虫性的方法。本发明采用RT-PCR技术从半夏中克隆出半夏凝集素基因pta，构建含pta基因的植物表达载体，利用根癌农杆菌介导法，将pta基因导入百合并经过抗生素筛选获得转化植株；利用PCR技术检测外源目的基因pta的整合情况，抗虫性试验测定转基因植株的抗蚜性，最终获得抗蚜性提高的转基因百合植株。本发明提供了一种提高百合抗蚜性的方法，为利用基因工程技术培育百合抗蚜品种打下了基础。文档编号C12N15/82GK101302519SQ20081003957公开日2008年11月12日申请日期2008年6月26日优先权日2008年6月26日发明者唐东芹,唐克轩,月王申请人:上海交通大学