专利名称：：南极海洋芽孢杆菌n2a高产低温过氧化氢酶分离纯化方法
技术领域：
：本发明涉及海洋微生物酶领域，特别是涉及南极海洋芽孢杆菌n2a高产低温过氧化氢酶分离纯化方法。技术背景地球上高山、深海和两极的低温环境中生活着种类众多的低温微生物，它们进化出在O'C左右生存繁殖的整套适应机制,低温极大地降低化学反应速率，低温微生物如何维持重要生化反应正常进行，在低温下保持正常活性的酶是确保低温微生物正常代谢的关键。催化重要反应的低温酶是低温微生物适应低温机理研究的重要内容。一般地，低温酶活化能和热稳定性低于同源的中温酶；低温酶虽然在中温条件下活性低于同源的中温酶，但在低温下低温酶以Km增加为代价换得较高的kcat保证酶有理想的催化效率。过氧化氢酶是好氧微生物生命活动中一直保持活性的重要持家蛋白。它迅速清除在生物代谢过程的氧化还原反应中产生的强氧化剂HA，防止其穿过细胞内结构、氧化蛋白质或断裂核酸单链伤害细胞。所以作为生物抗氧化保护剂，过氧化氢酶必须有高效催化的能力，确保H202被迅速分解而不会损伤有机体。低温过氧化氢酶研究对认识好氧低温微生物生命活动规律有重要意义。Yumoto等人首先报道了兼性嗜冷菌W6r&r"M^e/w"的低温过氧化氢酶(VRC)的性质，Lorentzen等人研究了来自鱼类病原菌K力r2'osa7/Km'ci'A的低温过氧化氢酶(VSC)，这使人们初步了解了低温过氧化氢酶，这两种低温酶和通常低温酶的性质有许多差异VRC的活性在4(TC时也远远高于牛肝过氧化氢酶等中温酶；VSC的Km在低温和中温条件都低于iVo加s卵'raWfe的过氧化氢酶(PMC);同时获得VSC及VRC的分离纯化方法复杂，步骤长，效果欠佳，满足不了现代工业需要。
发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术存在不足之处，经发明人长期从事微生物领域的丌发研究，采用现代先进技术，丌发提供一种简单、快速、有效的南极海洋芽孢杆菌n2a高产低温过氧化氢酶分离纯化方法。本发明提供的南极海洋芽孢杆菌Bacillussp.n2a(简称菌株n2a)高产低温过氧化氢酶(简称BNC)的分离纯化方法，包括下列歩骤①菌株n2a培养将菌株n2a置于含有培养基的摇瓶中，于20-3(TC，在摇床上培养至指数生长期晚期，再于O-l(TC离心收集菌体，其中培养基优选为基础海水培养基或每升蒸馏水含8克蛋白胨，5克NaCl和3克酵母浸膏，p服-IO的培养基；②超声破碎将歩骤①收集菌体悬于缓冲液A[Tris.HCl(三羟甲基氨基甲烷HC1)，pH7.5]中，进行超声破碎，离心取上清液，超声破碎所用功率大小决定于破碎程度和次数，破碎可在冰浴中或4'C(0-4'C)进行；③硫酸铵沉淀取歩骤得到的上清液加入硫酸铰至40%饱和度，于0-4'C离心收上清液，再加硫酸铵至70%饱和度，仍于0-4°C离心收沉淀；④阴离子交换层析将歩骤③的沉淀对缓冲液A透析过夜，离心上阴离子交换柱，例如3cmX10cmDEAE-s印hadexA25阴离子交换柱，室温下用安玛西亚AKTAFPLC装置以O.5-2.0m1/分流速，优选lml/分钟的流速的缓冲液A平衡柱，再以例如0-0.3mol/LNaCl梯度洗脱收集活性组分；然后用聚乙二醇2000浓縮上例如SephacrylS200HR的安玛西亚XK16/70柱,再用含0.1-0.15mol/LNaCl缓冲液A平衡洗脱，流速0.1-0.3，优选0.17ml/min，收集活性组分，再用聚乙二醇2000浓縮得电泳纯低温过氧化氢酶。按照本发明提供的南极海洋芽孢杆菌n2a高产低温过氧化氢酶分离纯化方法中，所述菌株n2a是从南极海水中分离筛获得的高产低温过氧化氢酶的南极海洋芽孢杆菌(或称南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a)(简称菌株n2a)，保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNo:M207079，tij中国水产科学研究院黄海水产研究所提供。在菌株n2a培养过程中，可采用任何规模大小的摇床进行培养l-2天至指数生长期为晚期，例如一升摇瓶中含200ml或250毫升中含20毫升培养基等，于如200rpm/min摇床2(TC培养24小时即能达到指数生长晚期。离心收集菌体可用任何离心机，例如Hitachi20pR-520型离心机，优选于0-4'C进行离心收集菌体。所述硫酸铵沉淀中，歩骤②得到的上清液中加入硫酸铵至饱和度为40%，优选于0-4。C离心收上清液，再于上清液中再加硫酸铵至饱和度为70%，离心收沉淀。在酶的纯化中，经过硫酸铵沉淀(盐析)、阴离子交换层析和凝胶过滤纯化歩骤，(表l)，得到电泳纯的BNC。纯化只用两次柱层析，比VSC和VRC以及其它许多过氧化氢酶的纯化工艺都简单。这主要因为阴离子层析时，在NaCl浓度0.13niol/L时收集到酶活性峰。而此时蛋白浓度(紫外吸收值)很低，所以这一步除去大部分杂蛋白，有很好的纯化效果。下分子筛后浓縮的BNC在两种电泳后染色均为单一条带(图l)，证明纯化的蛋白达到电泳纯。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本发明提供的低温过氧化氢酶分离纯化方法中，过氧化氢酶活性测定采用紫外分光光度法。在25'C，以OD240nm下降速率计算过氧化氢分解速率，eH.A=43.6(mol/L)-lcm-l。反应体系为50mmol/LpH7磷酸盐的钾盐缓冲液，HA浓度20mmol/L。能每分钟分解1ymol过氧化氢的酶量定义为一个活力单位。过氧化物酶活性分别用4一氨基安替比林法(http://www.worthington-biochem.com/HPO/)和焦性没食子酸法(http:〃www.sigmaaldrich.com/img/assets/l7540/HRP—Assay_pyro.pdf)测定，分别在520nm和410nm测OD增加值。蛋白质浓度测定用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准。电泳(Mini-PROTEANII,Bio-Rad)SDS—PAGE根据Laemmli法，以0.25%考马斯亮蓝R250(45%甲醇和10%乙酸)染色。非变性电泳用4%浓缩胶,7.5%分离胶；活性染色使用2%三氯化铁2%铁氰化钾(v:v=l:7)染色液。理化性质经过上述测定南极海洋芽孢杆菌n2a高产低温过氧化氢酶是小亚基单功能过氧化氢酶(BNC)。BNC是分子量为230kD的同源四聚体，亚基分子量56kD，pl=4.2。其最适温度25。C，最适p朋一ll，活性受叠氮钠、盐酸羟胺和巯基乙醇的抑制。BNC的活化能13kJ，在4。C和25。C的催化效率分别为3.6Xl()6和4X106MHs—'。BNC低温下高催化效率保证代谢产生的过氧化氢被迅速清除。作为低温小亚基单功能过氧化氢酶的代表，BNC和同源中温酶的活化能、催化效率和热稳定性之间差别不大，成为低温酶中的特例。本发明提供的南极海洋芽孢杆菌n2a高产低温过氧化氢酶分离纯化方法特点是工艺简单，比VSC和VRC以及其它许多过氧化氢酶的纯化都简单，只用两次层析，而且快速效果好，成为当前有效、可靠、经济分离纯化低温过氧化氢酶的方法，具有工业化广阔甜景。图1为纯化的过氧化氢酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图。具体实施方式实施例1菌株与培养条件菌株n2a是自南极海水中分离，经16SrRNA基因测序(GenBankaccessionnumberDQ508485)鉴定为芽孢杆菌属的新种。生长和发酵培养基每1L蒸馏水含8g蛋白胨，5gNaCl和3g酵母浸膏，pH7.2。1L摇瓶含200mL培养基，2CTC，200rpm摇床培养24h至指数生长期晚期。4°C，5000g离心收集菌体。纯化过程将23g菌体重悬于365mlpH7.550画l/LTris'Cl(缓冲液A)，以75W功率超声破碎10次(VibracellVCF1500,Sonics)，每次1min，间隔2min。于4。C离心取上清液，加入硫酸铰粉末至40%饱和度，离心收上清液再加硫酸铵至70%饱和度，于4'C离心收沉淀。沉淀对缓冲液A透析过夜，离心上DEAE-S印hadexA25阴离子交换柱(3cmX10cm)，室温下用安玛西亚MTAFPLC装置，以流速lmL/min的缓冲液A平衡柱，0.15mol/LNaCl梯度洗脱40min收集活性组分。聚乙二醇2000浓縮后上S印hacrylS200HR(安玛西亚XK16/70柱)，含O.15mol/LNaCl缓冲液A平衡洗脱，流速0.17mL/min，收集活性组分，聚乙二醇2000浓縮。纯化后达到电泳纯低温过氧化氢酶。权利要求1、一种南极海洋芽孢杆菌n2a高产低温过氧化氢酶分离纯化方法，其特征在于包括下列步骤①将南极海洋芽孢杆菌n2a置于含有培养基的摇瓶中，于20-30℃，在摇床上培养至指数生长期晚期，后于0-10℃离心收集菌体；②将步骤①收集菌体悬于三羟甲基氨基甲烷HCl，pH7.5的缓冲液A中进行超声破碎，在0-4℃离心取上清液；③取步骤②的上清液中加入硫酸铵至40％饱和度，于0-4℃离心收上清液，再加硫酸铵至70％饱和度，于0-4℃离心收沉淀；④将步骤③的沉淀对缓冲液A透析过夜，离心取上清液，上阴离子交换柱，室温下用安玛西亚AKTAFPLC装置以0.5-2.0m/分流速的缓冲液A平衡柱，再以0-0.3mol/LNaCl梯度洗脱收集活性组分；后用聚乙二醇2000浓缩后上柱，后用含0.15mol/LNaCl缓冲液A平衡洗脱，收集活性组分，聚乙二醇2000浓缩，得电泳纯低温过氧化氢酶。2、根据权利要求l的低温过氧化氢酶分离纯化方法，其特征在于所述培养基为海水培养基或每升蒸馏水含8克蛋白胨，5克NaCl和3克酵母浸膏培养基，pH6-10;所述阴离子交换柱为DEAE-s印hadexA25阴离子交换柱，所述流速为lml/分钟，所述聚乙二醇2000浓縮后上柱为S印nacry/S200HR安玛西亚XK16/70柱。全文摘要本发明涉及一种南极海洋芽孢杆菌n2a高产低温过氧化氢酶分离纯化方法，包括菌株摇瓶培养、超声破碎、硫酸铵沉淀，阴离子交换层析和凝胶过滤得到电泳纯低温过氧化氢酶。该方法工艺简单，快速效果好，用来分离纯化低温过氧化氢酶有效、可靠、经济方法。文档编号C12N9/08GK101230338SQ200810057970公开日2008年7月30日申请日期2008年2月22日优先权日2008年2月22日发明者谧孙,朱重昊,王跃军,媛郑申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所