专利名称：：高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a的制作方法
技术领域：
：本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及从南极海水中分离筛选出高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a及其产生的低温过氧化氢酶。技术背景南极海域由于气候特别寒冷，环境极其恶劣，所以动植物种类较少，但却有大量的原核生物，低温微生物资源丰富。低温酶是维持低温条件下细胞生命活动合适的生化反应速率的关键，筛选低温酶高产菌株是低温微生物理论与应用研究的基础。过氧化氢酶是好氧微生物生命活动中的重要持家蛋白。它迅速清除在生物代谢过程的氧化还原反应中产生的强氧化剂HA，防止其穿过细胞内结构、氧化蛋白质或断裂核酸单链伤害细胞。近年来它又以高效催化的能力在工业和医疗等领域展现出广阔的应用前景。所以低温过氧化氢酶作为生物抗氧化保护剂对好氧低温微生物生命活动有重要意义，也是有潜在工业应用价值的低温酶。Hernandez曾报道南极海水细菌在50iimol/LH202的条件下仍能正常生长，说明有可能南极海水中存在高过氧化氢酶活性的菌种。Yumoto等人和Lorentzen等人分别报道了来自K/6i"ioi"i/y7w'e/7w's和Kz力riosa^w/^ciA的高活性低温过氧化氢酶，但来自天然环境自由生活的高活性低温过氧化氢酶的微生物尚无报道，高过氧化氢酶活性的海洋革兰氏阳性菌也无报道。
发明内容本发明的目的在于寻找生存在自然环境中特别是在极端低温条件下高产高活性低温过氧化氢酶的微生物，经发明人广泛深入开发研究，在对南极海水中低温微生物进行分离筛选基础上，获得一株具有高效催化能力的生物抗氧化保护剂的高产高活性低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a(简称菌株n2a)。本发明提供的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a是从南极海水中分离筛选获得的高产高活性低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a，根据南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a和相关菌株的16SrDNA系统发育树(图l)以及菌株n2a的16SrDNA序列相似性最高的菌株分别为BacillusbarbaricusDSM147301(98.8%)，BacillusarsenicusDSM15822T(97.5%)，BacillusmacauensisDSM17262T(96.4%)，BacillusgelatiniLMG21880T(95.1%)。经16SrDNA基因测序(GenBanKaccessionnumberDQ508485)鉴定确定为芽孢杆菌属的细菌，是Bacillus的新菌种。该高产低温过氧化氢酶南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a于2007年6月9日保藏在地址位于中国武汉"武汉大学"，邮编-430072的中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNo:M207079。本发明提供的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a的形态与生理生化特征为形态特征-菌株n2a为芽孢杆菌，长2.5-5um，宽0.5-lum，卵圆形芽孢端生。培养特征-在基础海水培养基中(所述基础海水培养基为5克蛋白胨和1克酵母膏溶于1升海水，pH7.5，12rC灭菌20分钟)于4'C40。C的温度下生长，其最适生长温度范围为20°C30。C，生长pH范围为pH611，最适生长的NaCl浓度为0%6%，当NaCl浓度大于8%时生长被抑制。3(TC基础海水培养基培养24h的菌落圆形、全缘、扁平，直径0.9至L2mm，光滑有光泽，粘液状外观，质地似奶油，白色半透明。生理生化特征菌株n2a的生理生化特征列表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>菌株n2a具有杆菌形态和产芽孢能力这两种芽孢杆菌属的重要特征。菌株表型特征菌株n2a与系统发育相关菌种的表型特征的差异列于表2表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1,菌株n2a:2,Bacillusbarbaricus;3,Bacillusarsenicus;4,Bacillusmacauensis;5'Bacillusgelatini。+;正负ND:未测定v:可变；w:弱。从表2可见菌株n2a在低温生长、耐盐性等方面明显有别于16SrDNA系统发育学相关菌株，菌株n2a的表型5'C生长，7%NaCl生长。菌株n2a与系统发育相关菌种的脂肪酸含量(%)列于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1，n2a;2，Bacillusbarbaricus;3，Bacillusarsenicus;4,Bacillusmacauensis;5,Bacillusgelatini。由表3可见菌株n2a的支链脂肪酸占优势，即不饱和脂肪酸占40%以上，体现出低温海洋菌的特征，这完全符合芽孢杆菌属细菌的特征。但菌株n2a的C14、C15和C16三类主要脂肪酸含量相差不大(20%至30%)，这明显不同于系统发育学相关菌株(其C15或C16—种脂肪酸占优势)。菌株n2a的不饱和脂肪酸含量超过40W，明显高于16SrDNA系统发育学相关菌株，这也是低温菌的重要特征。菌株n2a的培养初筛含1.5%(w/v)琼脂的基础海水培养基灭菌后冷却至5(TC加入H202，使终浓度达lmmol/L，倒平板。以200yL海水样品(例如南极中山站附近海水)涂布，15。C培养10天，长出的单菌落划斜面保藏。复筛初筛获得的菌株从斜面接入250mL摇瓶(含20mL基础海水培养基)，200rpm，20'C培养24h,离心收菌体，以pH7.5，50mraol/LTris-Cl重悬菌体并在冰浴中超声破碎，离心后取上清液测活性和蛋白。过氧化氢酶活性以HA在240nm处分解速率计算。H202摩尔吸光系数为43.6(mol/L)—'cm—'，1个活力单位定义为5'C每分钟分解1umolHA的酶量。蛋白含量测定采用Bradford法。以7e/7t^s和i&c力er/c力j'acoh'为对照筛选高活性菌株。初筛平板细菌生长缓慢，7天后出现肉眼可见的菌落。所有单菌落复筛后获得一株高活性菌株n2a，其菌体超声破碎液过氧化氢酶活性达1200U/mg，而必7e/7^/s和A的菌体超声破碎液中酶活性分别为900U/mg和70U/mg。菌株n2a与其它微生物的细胞破碎液中过氧化氢酶活性比较列于表4表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表4可见菌株n2a的过氧化氢酶活性极高达1200U/mg。用含高浓度过氧化氢的平板初筛能获得高活性菌株。本发明提供的从南极海水分离获得高产低温过氧化氢酶为小亚基单功能过氧化氢酶(BNC)，是分子量为230kD的同源四聚体，亚基分子量56kD，pl二4.2。其最适温度25°C，最适p服一ll,活性受叠氮钠、盐酸羟胺和巯基乙醇的抑制。BNC的活化能13kJ，在4。C和25'C的催化效率分别为3.6X1。6和4X106M、-'。BNC低温下高催化效率保证代谢产生的过氧化氢被迅速清除。作为低温小亚基单功能过氧化氢酶的代表，BNC和同源中温酶的活化能、催化效率和热稳定性之间差别不大，成为低温酶中的特例。将在工业和医疗等领域得到广泛应用。图1为菌株n2a和相关菌株的16SrDNA系统发育树具体实施方式本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。实施例1初筛含1.5%(w/v)琼脂的基础海水培养基(5克蛋白胨和1克酵母膏溶于1L海水，调PH7.5，12rC灭菌20分)灭菌后冷却至5CTC加入HA，使终浓度达l画ol/L，倒平板。以200yL海水样品(南极中山站附近海水样品)涂布，15"C培养10天。长出的单菌落划斜面保藏。复筛初筛获得的菌株从斜面接入250mL摇瓶(含20mL基础海水培养基)，200rpm，20。C培养24h。离心收菌体，以pH7.5，50隱ol/LTris-Cl(三羟甲基氨基甲烷-Cl)重悬菌体并在冰浴中超声破碎，离心后取上清液测活性和蛋白。测得过氧化氢酶活性达1200U/mg,得菌株n2a。菌株n2a为芽孢杆菌，长2.5-5ym，宽0.5-1um，卵圆形芽孢端生。基础海水培养基中在4。C4(TC的温度下生长，其最适生长温度范围为2(TC3(TC，其生长pH范围为pH611。最适生长的NaCl浓度为0%6%，当NaCl浓度大于8%时生长被抑制。3(TC基础海水培养基培养24h的菌落圆形、全缘、扁平，直径0.9至1.2mm，光滑有光泽，粘液状外观，质地似奶油，白色半透明；氧化酶、甲基红、V-P、吲哚、仏S产生、纤维素酶、Tween20水解、Tween80水解、亚硝酸盐还原、乙醇氧化、L-苯丙氨酸脱氨酶、精氨酸双水解酶、水解马尿酸、利用酒石酸盐、利用糖或醇产气实验均属阴性。RNA酶、碱性磷酸酯酶、明胶液化、酪素分解、利用葡萄糖、淀粉、甘油、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖产酸实验均属阳性；不能从木糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、乙二醇、甲醇产酸。菌株n2a的表型特征革兰氏染色v长链形态学_生长4°C+47°C-pH9.5+5%NaCl+厌氧生长-活动性+硝酸盐还原_^"""菌株n2a脂肪酸含量C13::00iso--C13:04.7iso--C14:013.3C14::00iso--C14:l17.6iso--C15:014.2anteiso-C15:014.2C15::00iso--C15:l2.4iso--C16:l11.2C16::1"7cis6C16::1"llcis1iscr-C16:02反一-异-C16:01C16::00iso--C17:00反一-异-C17:00反一-异-C18:l2C18:1"llcis5.7序列表aio〉中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a<160〉1〈210〉1<211>1434〈212〉DNA<213〉南极海洋微生物菌株n2a(Bacillussp.n2a).〈400〉1gcctaatacatgcaagtcgagcgaatgatgaggagcttgctcctctgatttagcggcgga60cgggtgagtaacacgtgggtaatctgcctgtaagacggggataactxcgggaaaccgggg120ctaataccggataacaagagaagaagcatttct1:ct:ttttgaaagtcggtttcggctgac180acttacagatgagcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcga240cgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagac300tcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatgggcgaaagcctgaccgagcaacg360ccgcgtgagcgatgaaggccttcgggtcgtaaagctctgttgttagagaagaacaagtac420gagagtaactgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgcc480agcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcg540cgcaggcggtctcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcsttgg600aaactgggagacttgagtgcaggagagaaaagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgc660gtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggcttutggcctgtaactgacgctga720ggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacga780tgagtgctaggtgttggggggttccaccctcagtgctgaagttaacacattaagcactcc840gcctggggagtacgaccgcsaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagc900agtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcct960ctgaccactctagagatagagctttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatgg1020ttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttga1080ccttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggagga1140aggtggggatgacgtcaaatcatxatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaa1200tggatggtacaaagggttgcgaagccgcgaggccaagccaatcccaaaaagccattctca1260gttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaattgctagtaatcgcggatc1320agcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagag1380tUgtaacacccgaagtcggtggggtaacccttttgggagccsgccgccgaagg143权利要求1、一种高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a，其特征在于是从南极海水中分离获得的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a，是芽孢杆菌属的Bacillus的新菌种，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNoM207079。2、根据权利要求1的一种高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a，其特征在于所述高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株Bacillussp.n2a形态与生理生化特征为形态特征菌株n2a为芽孢杆菌，长2.5-5um，宽0.5-lum，卵圆形芽孢端生；培养特征在基础海水培养基中的于4'C4CTC的温度下生长，其最适生长温度范围为2(rC30°C，生长pH范围为pH611，最适生长的NaCl浓度为0%6%，NaCl浓度大于8%时生长被抑制；3(TC基础海水培养基培养24h的菌落圆形、全缘、扁平，直径0.9至1.2mm，光滑有光泽，粘液状外观，质地似奶油，白色半透明；<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>3、根据权利要求1的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a，其特征在于该菌株n2a16srRNA全序列如下，全长为1434bp,<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>4、根据权利要求1或2或3的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a产生的低温过氧化氢酶。全文摘要本发明涉及一种南极海水分离筛选得到的高产低温过氧化氢酶的南极海洋微生物菌株n2a，是芽孢杆菌属的Bacillus的新菌种，该菌株保藏于CCTCC，保藏号为CCTCCNoM207079，过氧化氢酶活性达1200U/mg，将在工业和医疗等领域有着广泛应用。文档编号C12R1/07GK101245331SQ200810057969公开日2008年8月20日申请日期2008年2月22日优先权日2008年2月22日发明者谧孙,伟王,翠袁,郝建华申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所