专利名称：维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法
技术领域：
本发明属于大肠癌肿瘤细胞原代培养技术领域。
背景技术：
迄今为止，国内外在从大肠癌组织中分离、纯化肿瘤细胞并建立稳定生长的 大肠癌肿瘤细胞均没有获得高效的方法。虽然通过大量标本的筛选最终可以建立 起细胞系，但巨大的工作量及漫长的筛选时间使其培养效率相当低下。由于原代 肿瘤可以很好地保持原始状态的肿瘤生物学特性，对于肿瘤本身研究及各种抗肿 瘤药物研究均具有重要意义，寻求一种简便而又高效的原代培养方法非常迫切， 并且很多建立在大肠癌细胞系水平的研究也需要在原代细胞水平进一步验证其 可靠性。大量资料表明，原代大肠癌培养的难点在于细菌及成纤维细胞污染， 初代细胞生长困难，继代生长缓慢或停滞。而最大的难点在于影响细胞长期生长 的继代生长停滞。因很多实验无需长久代次的肿瘤生长，故本研究主要致力于短期存活的大肠癌原代细胞的培养和纯化，可供原代肿瘤的蛋白、DNA、 RNA提取， 部分免疫学检测等研究。发明内容本发明目的在于克服现有技术中存在的一些问题，提供一种维持大肠癌肿瘤 细胞短期生长的原代培养方法的技术方案。一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于包括以下工 艺步骤1) 手术获取新鲜状态肿瘤标本，生理盐水清洗并剪去污秽及坏死区域后， 碘伏浸泡消毒5分钟，采用含双抗的PBS清洗液清洗；2) 在含双抗的PBS清洗液中将上述肿瘤标本剪成细小组织块，静置、去上清 液，之后再用含双抗的PBS清洗液清洗，离心分离，去上清液；3) 采用胶原酶消化法或组织块贴壁法，在培养液中进行组织贴壁及细胞爬 出，所述的培养液为10-20%胎牛血清培养液；4) 在上述培养液中继续培养并纯化处理，维持细胞生长至所需数量。 所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的胶原酶消化法工艺步骤为1) 根据标本组织块量，按l: 8-12的体积比加入胶原酶消化液，置于37X:水 浴摇箱中作用0.5-3小时，至组织块均呈半毛絮状或细小颗粒状，静置，滴管吸 弃上清液；2) 离心分离，用滴管吸弃上清液，然后使用无血清DMEM培养液重悬、吹洗 混匀，离心，弃上清液；3) 在10-20%胎牛血清培养液中以薄量液体培养方式培养48小时后，弃去原 培养液，换入足量新培养液，并每3日换一次培养液；所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述 的组织块贴壁法工艺步骤为1) 经处理后的标本组织加入无血清DMEM培养液重悬、清洗，离心分离，弃 上清液；2) 根据标本组织块量，按l: 8-12的体积比加入胶原酶消化液，置于37"C水 浴摇箱中作用20-40分钟，使组织块表面间质分离，暴露肿瘤细胞，之后用无血 清DEME培养液清洗，静置沉淀、弃上清液；3) 加入纯胎牛血清(FBS)，混匀，使标本组织充分浸润；4) 组织块的种植将纯胎牛血清(FBS)浸泡的组织块吸至培养瓶或培养皿 内，分布均匀，继续滴加纯胎牛血清(FBS)至完全覆盖培养瓶或培养皿底面，将 培养瓶或培养皿缓慢倾斜状态放置入培养箱内，使组织块黏附贴壁；5) 6-12小时后，加入10_20%胎牛血清培养液，使组织块刚好被浸没而不至 于浮起，重新水平位放入培养箱内培养，根据组织块的多少每隔24—48小时换一 次培养液。至组织块贴壁牢固后，加入足量培养液每72小时换液一次。所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述 的纯化处理采用机械刮除法，其工艺步骤为l)标记显微镜下观察，用标记笔在培养瓶或培养皿的背面圈下生长肿瘤 细胞的部位；2) 刮除弃掉培养液，于超净台内把无菌胶刮或棉签伸入瓶皿中，肉眼观 察下，刮除无标记空间；3) 用PBS清洗液清洗，洗除被刮掉的细胞；4) 注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的纯化处理采用消化排除法，其工艺步骤为1) 首先用含0.25。/。胰蛋白酶和0.02XEDTA的混合消化液漂洗培养细胞，使之 浸没细胞，然后弃去消化液，使细胞处于薄层消化液消化状态，在倒置显微镜下 定时观察并不时摇动培养瓶；2) 当见到半数成纤维细胞脱落，肿瘤细胞圈周围的细胞呈巻状后，立即加 入含血清培养液停止消化，之后轻柔摇动、吹打盘面细胞使成纤维细胞脱落；3)用PBS清洗液轻柔漂洗，将消化液及游浮细胞完全弃去，重复处理后向 原瓶内补加新的培养液继续培养。所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于细胞生长至所需数量后，采用0. 25%胰酶-0. 02%EDTA的混合消化液消化并收集肿瘤单 细胞。所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述 培养液为15-20。/。胎牛血清培养液。所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述 的胶原酶消化液为含胶原酶lmg/ml和透明质酸酶0. 5mg/ml的混合液，过滤无菌 后溶于DMEM培养液中。所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述 培养液为含10_15%胎牛血清培养液。常规原代培养方法培养良好状态的大肠癌肿瘤细胞，成功率很低(6%)，本 发明所述的原代培养方法可达33%以上，显著提高了原代大肠癌细胞短期体外培 养成功的概率，且工艺简单易行，成本低，为应用短期生长原代大肠癌细胞的实 验研究提供了一个可供选择的良好平台。
具体实施方式
实施例1:(1) 手术室获取新鲜状态肿瘤标本；无菌生理盐水清洗剪去污秽及坏死区 域后，碘伏浸泡、轻摇消毒5分钟；含双抗(1000U/ml青、链霉素)的PBS清洗液 清洗两遍；转移至消毒后的洁净玻璃皿内。(2) 使用无菌眼科剪镊将组织块剪成尽量细小组织块(〈lmra);置入15ml离 心管内静置沉淀，去上清，之后再次用PBS清洗液清洗，离心分离，去上清。(3) 转移至50ml离心管内，根据组织块总量按l: 10加入约10—15ml胶原酶 消化液(胶原酶lmg/ml+透明质酸酶0.5mg/ml)，置于37'C水浴摇箱中作用0. 5-3 小时，根据实际消化程度具体时间可以为0.5小时、l小时、2小时或3小时；胶原 酶添加量也可以为l: 8至1: 12。(4) 待管内组织块均呈半毛絮状或细小颗粒状时停止消化，若消化过度， 可采用100目钢筛过滤单细胞，获取筛网上方余留的肿瘤腺团，收集入离心管内 静置2分钟，滴管吸弃上清液。(5) 使用无血清DMEM培养液重悬并冲洗，离心分离，弃上清液；之后再次 加入无血清DMEM培养液重悬，清洗、离心，弃上清液。(6) 加入20。/。胎牛血清培养液4ml，混匀，用滴管将微组织块及腺体颗粒分 别置入两个六孔板板孔内或一个6cm培养盘内，轻轻摇动使其分布均匀。(7) 培养48小时后，弃去原培养液，沿培养板壁加入足量含10%胎牛血清培养液。(8) 继续培养观察，等待细胞自小组织块周围生长出来，每3日换液一次， 其间观察细胞圈大小，并根据成纤维细胞生长情况酌情按下述方法进行成纤维细 胞清除。(9) 至肿瘤细胞覆盖面为合适大小且细胞不至于过密时(细胞扩展至组织 块外10层左右)，用0.25%胰酶-0.02y。EDTA的混合消化液适度消化细胞，轻柔吹下 游离细胞收集并离心分离、重悬，接种于另外的培养孔或培养皿内继续进行培养 或直接进行应用研究。结论经大量实践证明，大肠癌细胞原代培养过程中，单个原代肿瘤细胞很 难在体外生存。只有成团的肿瘤细胞或肿瘤腺团才会生长于体外培养环境。本法 所用的方法原理主要是通过物理剪切作用使组织块变得细小，使块内肿瘤细胞主要以小腺团结构存在。经适当胶原酶消化使得肿瘤腺团周围间质成分被消化开来 而有利于肿瘤实质细胞接触外部培养液及培养皿底部。因肿瘤间质对胶原酶敏 感，实质不敏感，故经消化后肿瘤实质更易于暴露并以较完整的腺团结构存在， 更利于肿瘤细胞生长。成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维 细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞 成为肿瘤细胞培养中的关键。所述的排除成纤维细胞的方法包括机械刮除法和消 化排除法，可单独或联合使用。 机械刮除法1) 标记显微镜下观察，用标记笔在培养瓶、皿的背面圈下生长肿瘤细胞 的部位；2) 刮除弃掉培养液，于超净台内把无菌胶刮或棉签伸入瓶皿中，肉眼观 察下，刮除无标记空间；3) 用PBS清洗液清洗两次，洗除被刮掉的细胞；4) 注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全 除掉为止。消化排除法主要原理为原代培养的肿瘤细胞对胰酶消化液的敏感性迟钝，而成纤维细 胞较为敏感，故两类细胞脱落时间相差较多。具体程序是1)首先用0.25y。胰蛋白酶和0.02XEDTA (1: 1)混合消化液漂洗培养细胞 次，使之浸没细胞，然后弃去消化液，使细胞处于薄层消化液消化状态，并在倒 置显微镜卜定时观察和不时摇动培养瓶。2)当见到半数成纤维细胞脱落下来，肿瘤细胞圈周围的细胞呈巻状后，便立即加入含胎牛血清培养液停止消化，之后轻柔摇动、吹打盘面细胞使成纤维细胞 脱落。 3) PBS清洗液轻柔滤洗，将消化液及游浮细胞完全弃去，向原瓶内补加新的 培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反 复处理，可把多数成纤维细胞除净。实施例2:(1)手术室获取肿瘤鲜活部位标本；无菌生理盐水清洗剪去污秽及坏死区域 后，碘伏浸泡消毒5分钟；含双抗(1000U/ml青、链霉素)的PBS清洗两遍；转移至消毒后干净的玻璃皿内。(2) 使用无菌眼科剪镊将组织块剪成细小组织块(平均1--2mm)(不宜过细， 否则组织易漂浮)。(3) 置入15ml离心管内离心分离；用滴管吸弃上清液，使用PBS清洗液重悬 并再次冲洗，离心分离，吸弃上清液；之后加入无血清DMEM培养液重悬，清洗， 离心分离，吸弃上清液。(4) 根据组织块量加入适量胶原酶消化液(胶原酶lmg/ml+透明质酸酶 0.5mg,/ml)，置于37。C水浴摇箱中作用30分钟，使组织块表面间质分离，暴露肿 瘤腺团；之后无血清DEME培养液清洗，沉淀1分钟，不离心直接弃上清液。再次 用无血清DEME培养液清洗，离心弃上清液。(5) 加入约O. 5—1. Oml纯胎牛血清(FBS)，混匀。(6) 组织块的种植用口径稍大的滴管将纯胎牛血清(FBS)浸泡的组织块 吸至培养瓶或培养皿内，将组织块拨动至密度适当、分布均匀，均匀滴加纯胎牛 血清至完全覆盖培养瓶或培养皿底面，然后将培养瓶或培养皿慢慢倾斜放置使 血清积于瓶底，倾斜状态放入培养箱内，此时处于组织块黏附贴壁期。(7) 6-12小时后，加入10-15。^胎牛血清培养液，使组织块刚好被浸没而不至于浮起，水平状态重新放入培养箱内培养。(8) 换液为了保持足够的营养及酸碱平衡，必须24—48小时换液1次。前 几次换液时在保证培养瓶直立的情况下，吸出全部的旧培养液，沿瓶壁加入同 等量的新培养液，并保证培养液刚好能覆盖住组织块表面。此为贴壁期微量培养 过程。贴壁期微量培养液的总培养时间， 一般要保持3天或更长，视组织块长出 细胞的快慢而定。待组织块周围长出较多细胞并贴壁后可视为进入细胞生长期， 换液时才能将培养液增加到常规量或更多，并且每次换液应保持2-4天的静止 培养，以利于细胞的迅速生长。(9) 继续培养观察，等待细胞自小组织块周围生长出来，换液期间观察细 胞圈大小，根据成纤维细胞生长情况酌情按实施例l所述相同方法进行成纤维细 胞清除。对于只有成纤维细胞爬出的组织块，将其完全刮除。(10) 收获细胞待细胞生长达到实验要求的数量后，用0.25%胰酶 -0. 02。/。EDTA的混合消化液消化至组织块脱落。加含血清培养液吹打均匀并收集肿 瘤单细胞。视组织块的活性及实验要求，可吸出组织块按本方法继续培养。根据 实验的要求，可将所收集的细胞做传代培养或将细胞用于后续实验研究。结论本实施例建立的强行细胞贴壁培养法，对于取材良好的肿瘤组织很易 使肿瘤细胞得以生长。相对以往的组织块培养法，可以减少组织块贴壁困难及细 胞损伤而致的爬出困难。本培养法特点是组织块在纯血清被覆的培养盘底面黏 附一段时间后，加入微量培养液。在定时换液保持营养充足的情况下，组织块长 时间不被浮起，给细胞贴壁生长创造了良好的环境，增加了组织块原代培养的成 功率。
权利要求
1.一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)手术获取新鲜状态肿瘤标本，生理盐水清洗并剪去污秽及坏死区域后，碘伏浸泡消毒5分钟，采用含双抗的PBS清洗液清洗；2)在含双抗的PBS清洗液中将上述肿瘤标本剪成细小组织块，静置、去上清液，之后再用含双抗的PBS清洗液清洗，离心分离，去上清液；3)采用胶原酶消化法或组织块贴壁法，在培养液中进行组织贴壁及细胞爬出，所述的培养液为10-20％胎牛血清培养液；4)在上述培养液中继续培养并纯化处理，维持细胞生长至所需数量。
2. 如权利要求1所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的胶原酶消化法工艺步骤为1) 根据标本组织块量，按l: 8-12的体积比加入胶原酶消化液，置于37"C水 浴摇箱中作用0.5-3小时，至组织块均呈半毛絮状或细小颗粒状，静置，滴管吸弃上清液；2) 离心分离，用滴管吸弃上清液，然后使用无血清DMEM培养液重悬、吹洗 混匀，离心，弃上清液；3) 在10-20%胎牛血清培养液中以薄量液体培养方式培养48小时后，弃去原 培养液，换入足量新培养液，并每3日换一次培养液。
3. 如权利要求l所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法， 其特征在于所述的组织块贴壁法工艺步骤为1)经处理后的标本组织加入无血清DMEM培养液重悬、清洗，离心分离，弃 上清液；2) 根据标本组织块量，按l: 8-12的体积比加入胶原酶消化液，置于37'C水 浴摇箱中作用20-40分钟，使组织块表面间质分离，暴露肿瘤细胞，之后用无血 清DEME培养液清洗，静置沉淀、弃上清液；3) 加入纯胎牛血清(FBS)，混匀，使标本组织充分浸润；4) 组织块的种植将纯胎牛血清(FBS)浸泡的组织块吸至培养瓶或培养皿 内，分布均匀，继续滴加纯胎牛血清(FBS)至完全覆盖培养瓶或培养皿底面，将 培养瓶或培养皿缓慢倾斜状态放置入培养箱内，使组织块黏附贴壁；5) 6-12小时后，加入IO-20%胎牛血清培养液，使组织块刚好被浸没而不至 于浮起，重新水平位放入培养箱内培养，根据组织块的多少每隔24—48小时换一 次培养液。至组织块贴壁牢固后，加入足量培养液每72小时换液一次。
4. 如权利要求l所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法， 其特征在于所述的纯化处理采用机械刮除法，其工艺步骤为1)标记显微镜下观察，用标记笔在培养瓶或培养皿的背面圈下生长肿瘤 细胞的部位；2) 刮除弃掉培养液，于超净台内把无菌胶刮或棉签伸入瓶皿中，肉眼观 察下，刮除无标记空间；3) 用PBS清洗液清洗，洗除被刮掉的细胞；4) 注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全 除掉为止。
5. 如权利要求l所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法， 其特征在于所述的纯化处理采用消化排除法，其工艺步骤为1)首先用含0.25。/。胰蛋白酶和0.02^EDTA的混合消化液漂洗培养细胞，使之 浸没细胞，然后弃去消化液，使细胞处于薄层消化液消化状态，在倒置显微镜下定时观察并不吋摇动培养瓶；2) 当见到半数成纤维细胞脱落，肿瘤细胞圈周围的细胞皇巻状后，立即加 入含血清培养液停止消化，之后轻柔摇动、吹打盘面细胞使成纤维细胞脱落；3) 用PBS清洗液轻柔漂洗，将消化液及游浮细胞完全弃去，重复处理后向 原瓶内补加新的培养液继续培养。
6. 如权利要求1所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法， 其特征在于细胞生长至所需数量后，采用0. 25%胰酶-0. 02%EDTA的混合消化液消 化并收集肿瘤单细胞。
7. 如权利要求2所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法， 其特征在于所述培养液为15-20%胎牛血清培养液。
8. 如权利要求2所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法， 其特征在于所述的胶原酶消化液为含胶原酶lmgZml和透明质酸酶O. 5mg/ml的混 合液，过滤无菌后溶于DMEM培养液中。
9. 如权利要求3所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法， 其特征在于所述培养液为含10-15%胎牛血清培养液。
10. 如权利要求3所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法， 其特征在于所述的胶原酶消化液为含胶原酶lmg/ml和透明质酸酶O. 5mg/ml的混 合液，过滤无菌后溶于DMEM培养液中。
全文摘要
本发明属于大肠癌肿瘤细胞原代培养技术领域。包括1)手术获取新鲜肿瘤标本，清洗并剪去污秽及坏死区域，碘伏浸泡消毒，采用含双抗的PBS清洗液清洗；2)将上述肿瘤标本剪成细小组织块，静置、去上清液，之后再用含双抗的PBS清洗液清洗，离心分离，去上清液；3)采用胶原酶消化法或组织块贴壁法，在培养液中进行组织贴壁及细胞爬出；4)在上述培养液中继续培养并纯化处理，维持细胞生长至所需数量。常规原代培养方法培养良好状态的大肠癌肿瘤细胞，成功率很低(6％)，本发明所述的原代培养方法可达33％以上，显著提高了原代大肠癌细胞短期体外培养成功的概率，且工艺简单易行，成本低，为应用短期生长原代大肠癌细胞的实验研究提供了一个可供选择的良好平台。
文档编号C12N5/08GK101245337SQ200810059758
公开日2008年8月20日 申请日期2008年2月25日 优先权日2008年2月25日
发明者超 何, 廖永强, 朱洪波 申请人:浙江大学医学院附属邵逸夫医院