专利名称：针对A族链球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种针对A族链球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基 酸的单克隆抗体(以下简称McAb96-118)，属于单克隆抗体技术领域。
背景技术：
A族链球菌(GAS)即化脓性链球菌，是一种常见的病原菌，它可 以引起人类的多种感染性疾病，包括扁桃腺炎、咽炎、中耳炎等的浅 表感染，及坏死性筋膜炎等具有高度侵袭及潜在致死性的感染，以及 儿童猩红热等中毒性疾病，更为严重的是可导致感染后的超敏反应性 疾病，如风湿热、急性肾小球肾炎等，临床上存在着反复感染及难以 治愈等问题，因为目前尚无有效的疫苗予以预防，人类对其致病机制 及疫苗的研究从未停止过。FbaA蛋白是一种表达于GAS表面的新发现 蛋白，至少存在于18个血清型中。研究发现FbaA蛋白有抗吞噬及通 过结合补体调节蛋白FH、 FH-L以促进GAS进入上皮细胞的作用(参见 Infect Imnmn. 2003， 71: 7119-7128.)。本申请发明人的前期工作显 示FbaA具有良好的免疫原性和免疫保护性(参见中国免疫学杂志， 2007， 23 (9): 835-838，中华传染病学杂志，2008， 26 (3): 146-150)， 有望成为疫苗的候选蛋白。
经国内外检索，尚未发现以A族链球菌表面蛋白FbaA为抗原制备 单克隆抗体的相关文献。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为寻求新型GAS疫苗而开创新思路 的针对A族链球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的单克隆抗体。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案 本发明所述单克隆抗体是由以FbaA蛋白为免疫原免疫小鼠制备
的杂交瘤细胞产生；
所述单克隆抗体的类型为IgGl;
所述第96-118位氨基酸的基因的碱基序列为
acg tat aaa caa犯a att aaa act gca cca gac犯ei gat aag eta tta ttc acg tat cat agt gag tat;
所述第96-118位氨基酸序列为
TY眼KTAPDKDKLLFTYHSEYo
一、制备A族链球菌(GAS)表面蛋白FbaA的单克隆抗体(McAb) 的方法
1. 材料和方法
材料pMD18-T载体，高保真PCR系统，T4DNA连接酶及限制性 内切酶均购自Takara生物公司。表达载体pGEX4T-2和￡ cWiBL21 均为本室保存。FbaA+GAS标准菌株、FbaA—GAS菌株及抗FbaA蛋白的兔 血清均由Kansas大学Cue惠赠。小量质粒抽提及胶纯化回收试剂盒购 自北京天为时代科技有限公司。凝血酶购自PIERCE公司、6周龄的雌 性BALB/c小鼠，购自河北医科大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0为河北医科大学生物科技公司惠赠；RPMI1640粉末(用于培养 细胞的培养基)购自GIBCO公司；服PES (羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲 液购自AMERECO公司；次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶核苷(T)、氨基喋呤(A) 等细胞培养添加剂购自SIGMA公司；聚乙二醇4000 (PEG4000)购自 MERK公司；弗氏佐剂购自SIGMA公司；碱性磷酸酶(AP)标记的抗小 鼠IgG以及AP标记的抗小鼠IgGl- IgG4购自北京中杉金桥生物技术 有限公司。
2. 以FbaA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠 2.1.制备融合FbaA蛋白
2.1.1. 引物设计
根据网上公布的化脓性链球菌SSI-9 (GAS Ml血清型标准株) 基因序列(编号:AB040536)设计引物， Pl: 5' -TTAAGGATCCAGGAGGACAATATGCGTAGAGC-3'; P2: 5' -AGTGAATTCTCACCTGTTGMGGCAAGTACTTACCTG-3'，分别在Pl 和P2上添加^a貞及&oM酶切位点(划线所示)。扩增的目的基因约 为982 bp，编码324个氨基酸，为FbaA蛋白第1位至324位的氨基酸 片段。
2.1.2. PCR (聚合酶链反应)
以化脓性链球菌SSI-9为模板，用引物P1、P2进行扩增，94。C5min 预变性；94。C30s,55。C30s,72。C40s，25个循环；最后72'C延伸7min。 PCR片段经琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化。
2.1. 3.融合表达质粒的构建
将纯化的目的基因连接至pMD18-T载体，经序列测定正确后，用
AM和&0皿双酶切获得目的基因片段如图1所示，与经相同双酶
切后的原核pGEX4T-2表达质粒连接，转化￡ co7iDH5 a ，小量提取质 粒酶切鉴定，成功构建了 pGEX4T-2//&a4。
2. 1. 4.融合蛋白的表达和包涵体纯化 将pGEX4T-2及鉴定为阳性的pGEX4T-2/Z&a4质粒分别转化 ￡ "hBL21，挑取单菌落用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导， pGEX4T-2作为表达质粒，表达的融合蛋白带有GST (Glutathione S-transferase,谷胱甘肽硫基转移酶)标签蛋白，SDS-PAGE电泳检 测目的蛋白的表达。阳性菌株大量诱导表达后，超声裂解破碎，分别 收集裂解上清液和沉淀，洗涤沉淀后，溶于8mol/L尿素(pH8.0)中， 经SDS-PAGE电泳证实GST-FbaA融合蛋白主要为包涵体形式，采用凝 胶电泳回收法进行纯化。并按常规操作用凝血酶去掉GST蛋白，电洗 脱法回收。结果如图2所示，成功诱导并纯化出FbaA蛋白。本申请克 隆的/^W基因不包含锚定基序，共编码324个氨基酸，相对分子质量 约为35. 6KDa,但由于FbaA蛋白中富含脯氨酸，使其在SDS-PAGE电 泳中的迁移速度变慢，因此经SDS-PAGE反映的相对分子质量比实际大 21. 1Kda (参见Molecular Microbiology, 2001,42(1)， 75-86)，故 FbaA蛋白的相对分子质量为57. 7 KDa， GST相对分子质量约为26KDa， 故GST-FbaA融合蛋白相对分子质量分别为82. 7KDa。
2. 1. 5. Western blot检测蛋白表达
纯化的GST-FbaA融合蛋白及移去GST的FbaA蛋白经SDS-PAGE 电泳，通过电转膜转移至醋酸纤维素膜，用含3呢牛血清白蛋白(BSA) 的磷酸盐缓冲液封闭过夜，以兔抗FbaA多克隆抗体为一抗，AP标记 的羊抗兔IgG为二抗，底物BCIP-NBT显色。结果获得了纯化的FbaA 蛋白。结果如图3所示。
2. 2.免疫方法
免疫原为FbaA蛋白，分别在一、三、五周三次免疫小鼠，抗原 FbaA蛋白(50ug)与弗氏完全(初次免疫)或不完全佐剂(二、三 次免疫)按1 : 1比例充分混合乳化，于小鼠的背部皮下多点注射。末 次免疫后10天断尾取血，检测血清抗体效价，效价达6.0X1()4以上 小鼠备用，处死小鼠取脾细胞之前72-96小时，腹腔注射无佐剂的抗 原FbaA蛋白100ug加强免疫一次。
3. 杂交瘤细胞株的建立
按常规方法取免疫小鼠脾细胞，与已培养好的SP2/0细胞按io :
1比例混合，37。C水浴逐滴加入509&聚乙二醇(PEG4000) lmL进行细胞融 合，HAT培养液选择培养10-14天(待融合细胞集落生长至孔底1/4 时)后，采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，具体方法为优 化包被浓度后用10ug/ml FbaA蛋白包被ELISA板，用4°C 12h，洗 涤液洗涤4次(lmin/次)，加入封闭液100Pl/孔，37。C孵育1.5h洗涤 4次；加入细胞培养上清，每种上清双复孔，37。C孵育lh，洗涤4次； 加入l: 5000稀释的AP标记羊抗鼠IgG, 37。C孵育lh，洗涤；加入显 色液，显色30min，测定0D405值，同时设2孔空白对照。判断标准 将阴性对照的0D405值求平均数，然后将每一份细胞培养上清的 0D405值与该平均数相比，P/N〉 2. l为阳性。有限稀释法行阳性杂交 瘤细胞株的亚克隆(参见《抗体工程》 一书，北京医科大学出版社， 第二版，2001， 56-71)。结果获得的杂交瘤细胞融合率为37. 1%，经 两次亚克隆后获得了稳定分泌抗FbaA融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤 细胞株。
4.小鼠腹水的制备
采用免疫同系BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0. 5mL高温灭菌后 的石蜡油，14d后每只小鼠再腹腔注射杂交瘤细胞0. 5-1 X 106。待小鼠 腹部明显膨大后抽取腹水。
二、单克隆抗体的检测方法
1. 抗体效价的测定
采用间接ELISA法，测定杂交瘤细胞培养上清、腹水的效价，方法 同上。酶标仪检测0D405值，效价的判定标准以大于或等于阴性对 照OD405值2. 1倍且0D405值^0. 15的最高稀释度为效价。所获单抗 的上清效价约为l: 640，腹水的效价约为1:105。
2. McAb类别的检测
采用间接ELISA法，测定杂交瘤细胞培养上清、腹水中的McAb 的类别，方法同上，所获单抗的类型均为IgGl。
3. 单克隆抗体特异性的检测
采用Western-blot方法，将纯化的GAS-FbaA融合蛋白及GST蛋 白(阴性对照)行SDS-PAGE，电转移法转至PVDF膜，第一抗体为阳 性细胞培养上清，第二抗体为AP-马抗鼠IgG，底物为BCIP-NBT。结 果阳性杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与FbaA蛋白有特异杂交带，如
图4所示。
4. McAb结合链球菌能力的检测
挑FbaAGAS，FbaA+GAS菌单菌落接种于THY液体培养基过夜培养， 次日按l: 30转种，当0D560=0. 5时离心集菌、洗涤2次后，将菌液 用包被液稀释为0D560=0. 05包被96孔ELISA，第一抗体为获得的不 同株阳性杂交瘤细胞的分泌的McAb，第二抗体为AP-马抗鼠IgG，间 接ELISA法检测McAb结合菌的能力。结果发现有一株单克隆抗体(命 名为McAb96-118)与FbaA+GAS菌的结合能力远远高于与FbaA—GAS 菌的结合，如图5所示。
三、McAb96-118对应表位区段的检测
1. FbaA蛋白分段表达及Western blot检测McAb96-118对应表位 所在区段
根据FbaA蛋白的结构，本申请人将FbaA蛋白分段诱导表达，四 段蛋白分别为37-108位氨基酸(FbaA3w。s) 、 68-161位氨基酸
(FbaA68—161)、 104-277位氨基酸(FbaA卦277 )及160-324位氨基酸
(FbaA16Q-324 )，设计引物如下 FbaA37—咖的上游引物5， -TT GAATTC GCC GTA GAT GGC ATC CCT C-3， FbaA37—舰的下游引物5， -GC GCTAGC CTT ATC TTT GTC TGG TGC-3， FbaAs8-un的上游引物5， -GGC GGATCC CCT TTA GGT ATA AGC TTA G-3， FbaAe8,的下游引物5， -GGT GCTAGC AGG AGA ATC AGT CGT AAC-3， FbaAun-277的上游引物5， -G GGATCC GCA CCA GAC AAA GAT AAG CTA-3， FbaA,277的下游引物5， -GTTTG GCTAGC MC AAG TGA AGA GGC-3， FbaA则—324的上游引物:5， -TT GGATCC ACG ACT GAT TCT CCT GAG-3， FbaA16。—324的下游引物5， -TC GCTAGC ACC TGT TGA AGG CAA GTA C-3， 上述划线部分为DNA内切酶的酶切位点，以化脓性链球菌SSI-9 为模板，分别用四对引物进行扩增，94nC5min预变性;94'C30s，55i: 30s，72。C40s，25个循环;最后72'C延伸7 min。 PCR片段经琼脂糖凝 胶电泳切胶回收纯化。成功扩增出四段目的基因片段，见图6A所示， 四段基因分别经相应DNA内切酶双酶切后插入经相同双酶切的原核表 达载体pGEX4T-2，转化感受态后小提质粒做双酶切鉴定，结果见图6B，
成功构建了四段基因的融合原核表达质粒。挑选阳性克隆菌37"C常规 IPTG诱导，四段蛋白成功表达见图7A;将四段蛋白行SDS-PAGE后转 PVDF膜，与McAb96-118行Western blot,方法同上。结果McAb96-118
只与FbaAe8^段特异地结合，见图7B，证实McAb96-118对应表位位 于FbaA 68—161 段。但McAb96-118不与FbaA 37-108 段、FbaA 104—277 段结合，据 此推测McAb96-118针对的表位涵盖了 FbaA第104-108位氨基酸，结 合生物信息学技术初步确定McAb96-118针对的表位区段为FbaA的第 96-118位氨基酸。
2.表位缺失片段的融合表达及检测
PCR搭桥法设计缺失96-118氨基酸(涵盖了 FbaA第104-108位 氨基酸)的68-161氨基酸的基因片段(简写为FbaAA68-161)，引物 如下
68位氨基酸端的上游引物为
5， -GGCGGATCCCCTTTAGGTATAAGCTTAG-3，
96位氨基酸端的下游引物为
5 ， -CGGCTGTCATTTCTTTTTGTGCTTCAGATAA-3 ，
118位氨基酸的上游引物为
5 ， -GCACAAAAAGAAATGACAGCCGTTAAGGAT-3,
161位氨基酸的下游引物为
5， -GCCGGGAATTCAGTCGTAACTGATGTTG-3， 上述划线部位为酶切位点。上游引物的酶切位点为BamHl，下游 引物的酶切位点为EcoRI ，以化脓性链球菌SSI-9为模板，PCR扩增 出相应的基因片段(见图8)。将PCR扩增产物BamH I / EcoR I双酶切 后插入经相同双酶切的pGEX4T-2载体，转化DH5a感受态。PCR鉴定 阳性克隆、测序正确后，将融合质粒转化入BL21感受态，阳性克隆经 IPTG诱导表达FbaAA68-161蛋白片段(见图9)， McAb96-118与FbaA △68-161、 FbaA68-161行western blot以及将这两种蛋白以相同浓 度包被ELISA板后行间接ELISA。 二者结果一致，即McAb96-118只与 FbaA68-161片段特异结合，不与FbaAA68-161结合(见图10， 11)， 证实McAb96-118针对的表位位于FbaA蛋白的第96-118位氨基酸。
四、结论与讨论
链球菌FbaA蛋白属于纤连蛋白结合蛋白，与金黄色葡萄球菌纤连 蛋白结合蛋白有很高的同源性。己知在化脓性链球菌和上皮细胞相互 作用的过程中，GAS的F1蛋白可以利用可溶性纤连蛋白介导与作为上 皮细胞表面受体的整合素a 5 6 1的结合(参见Mol Microbiol, 1998， 30:625-637 ); FbaA蛋白也可以通过结合纤连蛋白介导链球菌与HEp-2
细胞结合并侵入HEp-2细胞(参见Infect Immun., 1998， 66: 4593-4601)，链球菌的这种特性可使其逃避抗生素及机体免疫系统的 攻击。
FbaA蛋白还可与血浆中的补体调节蛋白H因子(FH)及H因子样蛋 白-1 (FHL-1)结合(参见Infect I國n, 2002， 70: 6206-6214)。 Horstmann等(参见Proc Natl Acad Sci USA， 1988, 85:1657-1661) 首先提出，FbaA蛋白结合FH和其他补体调节蛋白的能力支配或影响致 病菌逃避补体攻击和细胞调理作用的能力(参见Biol Chem, 2002， 277:12642-12648， Eur J I画unol， 2003， 33:697-707)。
本申请基于FbaA蛋白制备了其单克隆抗体，类型均为IgGl，并 且其中一株单克隆抗体McAb96-118引起了申请人极大的兴趣。全菌 ELISA结果显示，McAb96-118与FbaA+GAS及FbaA—GAS的结合能力有明 显的差异:其可与FbaA+GAS特异结合，而与FbaA—GAS的结合能力极弱， 提示McAb96-118针对的表位属于菌体表面的FbaA蛋白的天然表位。 继而，将McAb96-118与FbaA分段蛋白结合，显示其能特异地结合FbaA 68—161 段，但不与FbaA 37-108 段、FbaA 104-277 段结合，据此推测McAb96-118 针对的表位涵盖了 FbaA第104-108位氨基酸的区段，结合生物信息学 技术，初步确定了该单抗针对的表位区段位于FbaA蛋白的第96-118 位氨基酸；于是，设计FbaA蛋白的第96-118位氨基酸(包含了 FbaA 第104-108氨基酸)缺失的68-161位氨基酸的融合蛋白FbaAA68-161 的诱导表达，并将表达产物与McAb96-118分别行Western-blot及 ELISA，结果显示缺失了 96-118位氨基酸的融合蛋白不与McAb96-l 18 发生特异性结合，证明FbaA蛋白的第96-118位氨基酸为McAb96-118 针对的表位区段，且筛选出多株一样的杂交瘤细胞，其产生的单克隆 抗体针对的表位区段都多是该区段，提示该表位是一个优势表位。
本发明有益效果如下
1、 本发明所述的单克隆抗体McAb96-118所针对FbaA蛋白的氨基 酸序列是位于GAS表面的天然结构，同时也是GAS的一个优势表位， 这为深入研究新型GAS疫苗提供了新的靶点。
2、 McAb96-118与FbaA蛋白的结合区段与FH、 FHL-1与FbaA蛋 白结合位点(FbaA蛋白的97-112位氨基酸)重叠，因为GAS通过其 表面蛋白FbaA与FH的结合入侵上皮细胞，故McAb96-118与GAS结合 可以降低GAS侵入细胞的能力。这为研究链球菌的致病机制、开辟控
制链球菌感染非抗生素治疗提供了新视角。
图1为PCR扩增/ib^基因片段及PMD-18T/ZZ，a力双酶切产物的琼 脂糖胶电泳图。
图2为融合Fba蛋白的SDS-PAGE图。
图3为融合蛋白的Western blot分析图。
图4为Western blot检测McAb的特异性。
图5为McAb96-118与FbaA+GAS和FbaA_GAS结合能力的ELISA检 测图(横坐标为McAb96-118的稀释度)。
图6A为PCR扩增四段基因片段的琼脂糖胶电泳图。 图6B为四段基因片段插入pGEX4T-2后的双酶切鉴定电泳图。 图7A为FbaA各分段蛋白诱导表达SDS-PAGE图。 图7B为McAb96-118与分段蛋白的Western blot分析图。 图8为PCR搭桥法扩增FbaAA68-161的基因片段的琼脂糖胶电泳图。
图9为FbaA68-161诱导表达SDS-PAGE图。 图10为McAb96-118与FbaA68-161和FbaAA68-161的Western blot分析图。
图11为McAb96-118与FbaA68-161和FbaAA68-161结合的ELISA 检测图(McAb96-118的稀释度为l: 4000)。
在图1中，1.标准分子质量DNA， 2. PCR扩增链球菌y&a4基 因，3.融合质粒pMD18-T外o4双酶切产物；
在图2中，4.蛋白相对分子质量标准,5.融合质粒pGEX4T-2/^kL4 未诱导，6.融合质粒pGEX4T-2外"诱导表达，7.纯化的GST-FbaA 融合蛋白，8.去除GST的FbaA蛋白；
在图3中，9.纯化的GST-FbaA融合蛋白，lO.移去GST的FbaA 蛋白，11. GST阴性对照；
在图4中，12.纯化的GST-FbaA融合蛋白，13. GST阴性对照， 14特异杂交带；
在,6A中，15. FbaA37.u)8的基因片段，16. FbaA68_161的基因片 段，17. FbaAK)4.277的基因片段，18. FbaA,324的基因片段，19. DNA Marker;
在图6B中，20. pGEX4T-2/y&d！,24的双酶切产物，21.
pGEX4T-2/yZ>o4/w_277的双酶切产物，22. DNA Marker ， 23. pGEX4T-2妙o4沐^的双酶切产物，24. pGEX4T-2/yZ>a^7-/0S的双酶切 产物；
在图7A中，25.蛋白Marker, 26. FbaA37_108蛋白诱导表达，27. FbaA37.108未诱导表达，28. FbaA68.161蛋白诱导表达，29. FbaA^w 未诱导表达，30. FbaA胁277蛋白诱导表达，31. FbaA1()4_277未诱导表 达，32. FbaA胁324蛋白诱导表达，33. 63八16().324未诱导表达；
在图7B中，34. FbaA37.108， 35. FbaA68.161， 36. FbaA104.277， 37. PbaA160_324;
在图8中，38. DNAMarker, 39. 68位至95位氨基酸的基因片 段，40. 119位至161位氨基酸的基因片段，41. FbaAA68-161的基 因片段；
在图9中，42.蛋白Marker，43. FbaAA68-161诱导表达，44. FbaA △68-161未诱导表达，45.阴性对照GST蛋白；
在图10中，46. FbaA68-皿,47. FbaAA68-161。
具体实施例方式
单克隆抗体McAb96-118是由以FbaA蛋白为免疫原免疫小鼠制备 的杂交瘤细胞产生；
所述单克隆抗体的类型为IgGl;
所述第96-118位氨基酸的基因的碱基序列为
acg tat aaa caa aaa att aaa act gca_ cca_ gac aaa_ gat aag eta tta ttc acg tat cat agt gag tat;
所述第96-118位氨基酸序列为
TYKQKIKTAPDKDKLLFTYHSEY 。
并按照上述发明内容部分中第一、二、三部分的内容具体操作即可。
权利要求
1、针对A族链球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体是由以FbaA蛋白为免疫原免疫小鼠制备的一株杂交瘤细胞产生；所述单克隆抗体的类型为IgG1；所述第96-118位氨基酸的基因的碱基序列为acg tat aaa caa aaa att aaa act gca cca gac aaa gat aag ctatta ttc acg tat cat agt gag tat；所述第96-118位氨基酸序列为TYKQKIKTAPDKDKLLFTYHSEY。
全文摘要
本发明涉及一种针对A族链球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由以FbaA蛋白为免疫原免疫小鼠制备的杂交瘤细胞产生；所述单克隆抗体的类型为IgG1。本发明的有益效果是为深入研究链球菌的致病机制提供了新的靶点；并且为寻找新型GAS疫苗、开辟控制链球菌感染非抗生素治疗提供了新视角。
文档编号C12N15/31GK101386647SQ20081007966
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月29日 优先权日2008年10月29日
发明者李彩红, 杨建岭, 王秀荣, 郭奕阳, 顾海燕, 马翠卿, 林 魏 申请人:河北医科大学