专利名称：：一种重组人血清白蛋白的纯化方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明阐述了一种毕氏酵母表达的重组人血清白蛋白(rHSA)的纯化方法及在细胞培养法生产人用病毒疫苗中的应用。
背景技术：
：牛血清白蛋白或人血清白蛋白是细胞培养法生产病毒疫苗中不可缺少的稳定剂，但牛血清白蛋白由于来源于动物并且有潜在的疯牛病等污染而逐渐被人血液来源的人血白蛋白所替代。然而同样，血源人血白蛋白不可避免地含有潜在的病原体感染的危险，同时血源人血白蛋白来源于人血桨而限制了其产量和批间稳定性，质量不稳定。W098/068221998年2月19日公开了重组人血清白蛋白(rHSA)用于动物细胞培养，其中重组人血清白蛋白是用于促进细胞的增长。W099/125681999年3月18日公开了重组人血清白蛋白与糖、无机盐等组合物用于水痘、带状疱疹及麻疹、风疹、腮腺炎活病毒的稳定剂。rHSA的制备方法为本领域技术人员所熟知，EP0612761、EP0570916和EP0699687中均揭示了一个用基因操作技术重组人血清白蛋白的方法。然而，这些方法均因步骤多、周期长、成本高而变得复杂，因而难于满足工业放大的经济要求。申请人自有专利申请CN1496993A和CN1854155A公开了制备疫苗生产用rHSA的方法。与其他方法相比，该方法所纯化的重组HSA特征的显色物质及多糖等杂质水平大幅度降低，但内毒素水平难以控制，需要进行进一步优化处理，控制内毒素、提高收率以得到可工业化的纯化工艺。
发明内容本发明提供了一种高效的适合工业化的rHSA的纯化方法以及rHSA在制备病毒疫苗培养基，特别是狂犬病疫苗培养基和狂犬病疫苗制剂中的用途。本发明是通过下述技术方案实现的首先通过申请人自有专利申请技术(CN1854301和CN1854306)构建的基因工程酵母菌及生产方法获得重组人血清白蛋白发酵液，利用0.5um孔径的陶瓷膜进行过滤，加热后的上清液经过高盐阳离子交换层析，收获的溶液进行硼酸盐处理，经过中空纤维处理的溶液按照CN1854155A中的工艺进行疏水交换层析和弱阴离子交换层析。最后，弱阴离子层析的洗脱组分用已知方法，如超滤浓縮方法、冷冻干燥方法等制成各种成品。硼酸盐沉淀的去除方式在专利CN1854155A中描述为离心去除，但实际操作中离心后料液澄清度低，在生产上动力消耗较大，与专利CN1854155A不同的是，通过引入中空纤维处理操作，使得发酵上清液在加热时不用加入活性炭，并且对硼酸盐处理的溶液不用离心操作，从而使操作更加简便。引入中空纤维的优点合适孔径的中空纤维可以大幅度降低内毒素含量、滤后料液澄清度好，并且省去活性炭及离心沉淀对蛋白的吸附，收率提高2-10%。其中中空纤维孔径为截留分子量100K-0.5um，优选为500K-0.2um。内毒素水平得到稳定控制，以鲎试剂检测低于0.5EU/mL(产品浓度为100mg/mL)。除非特别说明，本申请中rHSA的浓度(％)的含义为g/100mL，即每100mL溶液中rHSA的含量(g)，如rHSA10X的含义为每lOOmL溶液中rHSA的含量为10g。具体地，本发明涉及1)—种可工业化的纯化rHSA的方法，包括将含rHSA的发酵液经过陶瓷膜处理，上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析，得到纯化rHSA，其特征是所述经高盐阳离子交换层析的溶液在经硼酸盐处理后，利用中空纤维柱进行过滤。2)根据项1)所述的方法，其中中空纤维的孔径为截留分子量100K-0.5um，优选为500K-0.2咖。3)根据项1)所述的方法，其中弱阴离子交换层析使用的缓冲液包括醋酸钠、磷酸钠、氯化钠及辛酸钠等，优选为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和辛酸钠，浓度为10mM-200mM，优选50-100mM。4)项1)所述方法制备的rHSA，其具备下述特征蛋白纯度为99%_100%单体和二聚体，优选基本上100%单体和二聚体；宿主蛋白残留低于100ppm总蛋白，优选为10ppm总蛋白；多糖残留低于10ug/mgrHSA，优选为低于lug/mgrHSA;内毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，优选为0.5EU/mL(10%rHSA)。5)项4)所述的rHSA在病毒疫苗生产细胞VERO、MDCK或MRC-5细胞培养基中的用途。6)根据项5)所述的用途，其中rHSA的浓度为O.1%_10%，优选为0.1%_0.5%。7)根据项5)_6)所述的用途，其中病毒的培养方法是转瓶工艺，微载体悬浮工艺或多聚酯片吸附的灌注工艺。8)根据项5)_6)任一所述的用途，其中病毒疫苗为人用狂犬病疫苗。9)项4)所述的rHSA在制备人用狂犬病疫苗制剂中的用途，其中rHSA的浓度为0.1%_10%，优选0.5%-5%。10)根据项9)所述的用途，其中所述的狂犬病疫苗是水针或冻干剂。本发明获得的疫苗生产用rHSA具有以下特征l)蛋白浓度为99%_100%单体和二聚体，优选基本上100%单体和二聚体。2)宿主蛋白残留低于100ppm总蛋白，优选为10卯m总蛋白。3)多糖残留低于10ug/mgrHSA，优选为低于lug/mgrHSA。4)内毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，优选为0.5EU/mL(10%rHSA)。本发明方法制备的rHSA可用于VERO、MDCK和MRC-5细胞进行病毒疫苗的生产，特别是狂犬病疫苗的生产。具体地，在DMEM培养基中添加O.1%_10%，优选为0.l%-0.5%的重组人白蛋白做为病毒收液过程的维持培养基进行病毒收液。病毒培养方法可以是转瓶工艺，微载体悬浮工艺或多聚酯片吸附的灌注工艺。同时，该方法制备的rHSA还可以用作病毒疫苗终产品的稳定剂，可以是冻干剂，也可以是水剂。具体实施例方式下述实施例仅为本领域技术人员更好地理解本发明，不应解释为对本发明的限制。实施例1重组人血清白蛋白(rHSA)的纯化在纯化过程中所用的各种缓冲液见下表4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>a)发酵液的澄清和加热处理利用孔径0.5um的陶瓷膜对发酵液进行澄清处理，取发酵上清液80L，加入5mM辛酸钠、5mMEDTA，在70。C下加热20分钟，冷却。b)高盐阳离子层析分离和浓縮将上述经过处理的样品以150cm/h流速上样高盐阳离子CST-IIFF柱(XK50/60,Vt二300ml，GE公司制造，预先用溶液A平衡)，用溶液B洗脱，得CST-I1BD组分。用截留分子量300K的浓縮膜包(MILLIPORE公司生产)进行浓縮至100mg/ml左右。c)硼酸盐处理和中空纤维处理向浓縮组分中加入四硼酸钠和氯化钙，使最终浓度为50-100mM，过夜。用截留分子量500K的中空纤维超滤柱(GE公司)分离。d)加热处理向中空纤维处理后溶液中加入辛酸钠和半胱氨酸，至最终浓度各5mM和10mM，在6(TC加热60分钟，迅速冷却。e)疏水层析分离和浓縮加热后样品经0.45和0.22um的膜过滤，进入PhenylSFF柱(XK50/60，Vt=500ml，GE公司，用溶液C平衡)。收集流穿部分。f)弱阴离子层析分离将上述流穿组分进入AminobutylSFF柱(XK50/60,Vt=500ml，GE公司制造，用溶液C平衡)，用溶液D进行洗脱，得Amino-BD组分。g)浓縮换液用截留分子量30K的超滤膜浓縮，然后用含辛酸钠的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液换液，得到最终含rHSA10%的终产品517g。h)产品的鉴定本发明各步rHSA浓度、产率、糖含量以及纯度见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其中，用Bradford方法测定蛋白浓度，计算总蛋白量，从而计算各步收率；糖含量用苯酚-硫酸法测定；纯度利用SDS-PAGE电泳法结合HPLC法进行分析；内毒素水平利用鲎试剂法检测。实施例2rHSA在狂犬病疫苗转瓶培养工艺中的应用a)细胞制备将Vero细胞(来源于美国ATCCCRL-1586)进行复苏、转瓶扩增培养，传代到3.5L双层转瓶。培养条件37t:，(A5%(v/v)。b)病毒接种当Vero细胞培养成单层时，以MOI为0.0250.125接种CTN株毒种(中国药品生物制品检定所)。接种后，换用添加疫苗生产用rHSA0.35X的DMEM培养基维持液。培养温度34°C。c)病毒收液换用维持液之后每三天收换液一次，收液后继续换新鲜维持液，连续收液三次。分别采用单克隆抗体制备双抗体夹心ELISA法和小鼠滴定实验测定三次收液的G蛋白含量与病毒滴度，测定数据见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收获液的纯化病毒收获液澄清过滤后进行超滤浓縮使用截留分子量750K的中空纤维柱，对病毒收获液进行超滤浓縮。超滤过程中，病毒颗粒得到高度浓縮，而培养液中的小分子物质如白蛋白、酚红等大部分在透过液中被除去。e-丙内酯(l:4000)4。C灭活24小时，37。C水解2小时；柱层析纯化使用S印harose4FastFlow层析柱，按柱体积10%上样，收集第1峰。经层析纯化后，病毒液中的低分子量蛋白质分子(主要是培养液中的白蛋白)被去除，病毒峰中蛋白质含量大大降低。从层析柱收集峰抽取测定蛋白含量样品后，立即加入人血白蛋白(湖南衡阳南岳制药厂)作为保护剂，其终浓度为1%，同时加入硫柳汞做防腐剂，硫柳汞终浓度《0.08mg/ml。根据蛋白质含量及抗原含量进行配制，分装，成为液体制剂。制剂成品经检验，各项指标均符合中华人民共和国2005版药典要求，主要是NIH法测定疫苗效力为4.6IU/剂量，特别是，利用Elisa试剂盒法检测到酵母细胞宿主蛋白残留小于5ng/剂量。实施例3rHSA在狂犬病疫苗NBS反应器培养工艺中的应用a)细胞制备将Vero细胞进行复苏、转瓶扩增培养，以4X105cellS/ml的密度接种于NBS5L生物反应器中，反应器酯片篮中装置160g聚酯片，工作容积2.5L，培养条件37°C，溶氧45%，搅拌速度70rpm，pH值7.4。b)病毒接种Vero细胞培养45天时，换用添加疫苗生产用rHSA0.35%的DMEM培养基，以MOI为0.0250.125接种CTN株毒种。培养温度34。C，溶氧45%，搅拌速度70rpm，pH值7.4。c)病毒收液连续灌注收液20天，收液量24L，混合病毒收液病毒滴度均达到6.51gLD50。d)狂犬病疫苗病毒收获液的纯化纯化操作按照实施例2中纯化操作进行。制剂成品经检验，各项指标均符合中华人民共和国2005版药典要求。主要是NIH法测定疫苗效力为4.6IU/剂量，特别是，利用Elisa试剂盒法检测到酵母细胞宿主蛋白残留小于5ng/剂量。实施例4rHSA在狂犬病疫苗微载体反应器培养工艺中的应用a)细胞制备将Vero细胞进行复苏、转瓶扩增培养，以5X105cellS/ml的密度接种于工作体积5L的微载体反应器，微载体用量125克。反应罐在温度371:，溶氧45%，pH值7.4条件下培养细胞5日，细胞浓度达到1.2X107cells/ml时接种病毒。b)病毒接种以MOI为0.0250.125接禾中CTN株毒种。用含rHSA0.35%的DMEM培养基，培养温度34°C，溶氧45%，pH值7.4，培养72小时。c)病毒收液病毒培养72小时后开始灌注收液。病毒感染后于第5、9、13天，以及混合收获液取样。进行镜检、病毒滴定和糖蛋白的检测。糖蛋白含量小于lIU/ml或细胞汇合率低于20%，停止收液。共收液14天，收获病毒液体积58L。第5、9、13天和混合收液检测数据如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收获液的纯化纯化操作按照实施例2中纯化操作进行。制剂成品经检验，各项指标均符合中华人民共和国2005版药典要求。主要是NIH法测定疫苗效力为4.7IU/剂量，特别是，利用Elisa试剂盒法检测到酵母细胞宿主蛋白残留小于5ng/剂量。实施例5rHSA在人二倍体细胞转瓶培养生产狂犬病疫苗工艺中的应用a)细胞制备人二倍体细胞系MRC-5，来自美国ATCCCCL_171。细胞系经复苏、转瓶扩增培养，传代到双层转瓶。培养条件371:，0)25%。b)病毒接种接种后35天，当MRC-5细胞生长到培养成单层时，接种CTN株毒种，接种MOI为0.0250.125。接毒后，换用添加rHSA0.35%的DMEM培养基维持液。培养温度34°C。c)病毒收液接毒后3天，开始收液，收液后继续换新鲜维持液，连续收液三次。分别采用单克隆抗体制备双抗体夹心ELISA法和小鼠滴定实验测定三次收液的G蛋白含量与病毒滴度，测定数据见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收获液的纯化纯化操作按照实施例2中纯化操作进行。制剂成品经检验，各项指标均符合中华人民共和国2005版药典要求。主要是NIH法测定疫苗效力为4.5IU/剂量，特别是，利用Elisa试剂盒法检测到酵母细胞宿主蛋白残留小于5ng/剂量。实施例6rHSA在VERO、MDCK和MRC-5细胞无血清培养基中应用根据VER0、MDCK(ATCCCCL-34)、MRC-5细胞培养营养代谢情况，在DMEM(Hyclone公司生产)培养基中分别添加氨基酸、植物蛋白水解物、重组人血清白蛋白、酯类等添加剂，制成VER0、MDCK、MRC-5细胞用无血清培养基。主要改进如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>酯类胆固醇5mg/l乙醇胺60ul/lLipidmixture(sigma，L5416)3ml/l采用上述配方配制成两种无血清培养基SFMI:添力口lg/1rHSASFMII:添加lg/1人血白蛋白。实验方案1:上述两种培养基用于VERO细胞传代培养，用含10%(v/v)血清的匿EM培养基作对照。实验结果连续传代50代，在上述三种培养基中细胞状态无明显差异，细胞活性均〉99%，细胞群体倍增时间为SFMI23小时、SFMI123.5小时，对照培养液为22小时，结果表明rHSA可替代血源白蛋白用于VERO细胞无血清培养基，二者性能无明显差异。实验方案2:采用上述SFMI、SFMII培养基进行MDCK细胞维持平行对照试验，以含5%(v/v)血清的DMEM培养液作对照。[O1OS]a)MDCK细胞接种6个2L转瓶。b)细胞长满单层后，换上述三种培养基，各2瓶，维持培养。[OWS]c)隔天换液。实验结果共维持42天，维持结束时细胞贴壁率SFMI为72.7%、SFMII为70.5%、对照为78.6%。表明rHSA可替代人血清白蛋白用于MDCK无血清维持培养，二者与含5%血清培养基无明显差别。实验方案3:采用上述SFMI、SFMII培养基进行MRC-5细胞维持平行对照进行试验。1)MRC-5细胞接种4个2L转瓶。2)细胞长满单层后，换上述两种培养基，各2瓶，维持培养。3)隔天换液。实验结果共维持30天，维持结束时细胞贴壁率SFMI为83.5%、SFMII为85.0%。表明rHSA可替代人血清白蛋白用于MRC-5细胞无血清维持培养。实施例7用重组人血清白蛋白做狂犬病疫苗的稳定剂水针剂层析纯化后的狂犬病毒颗粒收液抽取测定蛋白浓度样品后，立即加入终浓度为1%的rHSA作为保护剂，同时加入硫柳荥做防腐剂，终浓度<0.08mg/ml。根据蛋白质含量及抗原含量配制半成品，加入rHSA(终浓度1%)作为稳定剂，分装，成为液体制剂。测定效价为4.8IU/ml。对样品进行热稳定性试验37'C放置4周后，测定效价，结果为3.8IU/ml。冻干剂层析纯化后病毒颗粒收液根据蛋白质含量及抗原含量配制半成品，加入rHSA(终浓度2%)、麦芽糖等稳定剂，分装，冻干，成为冻干制剂。测定效价为4.6IU/支。对样品进行热稳定性试验37。C放置4周后，测定效价，结果为3.7IU/支。10权利要求一种可工业化的纯化rHSA的方法，包括将含rHSA的发酵液经过陶瓷膜处理，上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析，得到纯化rHSA，其特征是所述经高盐阳离子交换层析的溶液在经硼酸盐处理后，利用中空纤维柱进行过滤。2.根据权利要求1所述的方法，其中中空纤维的孔径为截留分子量100K-0.5um，优选为500K-0.2um。3.根据权利要求1所述的方法，其中弱阴离子交换层析使用的缓冲液包括醋酸钠、磷酸钠、氯化钠及辛酸钠等，优选为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和辛酸钠，浓度为10mM-200mM，优选50-100mM。4.权利要求1所述方法制备的rHSA，其具备下述特征蛋白纯度为99%_100%单体和二聚体，优选基本上100%单体和二聚体；宿主蛋白残留低于100ppm总蛋白，优选为10ppm总蛋白；多糖残留低于10ug/mgrHSA，优选为低于lug/mgrHSA;内毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，优选为0.5EU/mL(10%rHSA)。5.权利要求4所述的rHSA在病毒疫苗生产细胞VERO、MDCK或MRC-5细胞培养基中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其中rHSA的浓度为0.1%_10%，优选为0.1%_0.5%。7.根据权利要求5-6任一所述的用途，其中病毒的培养方法是转瓶工艺，微载体悬浮工艺或多聚酯片吸附的灌注工艺。8.根据权利要求5-6任一所述的用途，其中病毒疫苗为人用狂犬病疫苗。9.权利要求4所述的rHSA在制备人用狂犬病疫苗制剂中的用途，其中rHSA的浓度为0.1%_10%，优选0.5%-5%。10.根据权利要求9所述的用途，其中所述的狂犬病疫苗是水针或冻干剂。全文摘要本发明涉及一种重组人血清白蛋白(rHSA)的纯化方法，包括将含rHSA的发酵液经过陶瓷膜处理，上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析，得到纯化rHSA，其特征是，所述经高盐阳离子交换层析的溶液在经硼酸盐处理后，利用中空纤维进行过滤。本发明获得的rHSA可用于细胞培养法生产人用病毒疫苗，特别是狂犬病疫苗。文档编号C12N7/00GK101768206SQ200810080278公开日2010年7月7日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者任乐民,刘文献,李梅彦,杜力,王志明,贺建功,贾茜,赵伟,高健,魏敬双,黄顺军申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司