新型清除蛋白受体的制作方法

专利名称：新型清除蛋白受体的制作方法
技术领域：
本发明是关于分离的人及小鼠的新型清除蛋白(scavenger)受体(在本说明书中分 别称为hSRCL-Pl和mSRCL-Pl，对两者不加区别的情况下只称SRCL-P1)的基因及蛋白 质，它们的相同体，变异体，修饰体及多型性变种(这些总称为衍生物)，它们的片段(以 下全称为SRCL-Pls)以及它们的检出方法。再有，关于含有SRCL-Pls的医药用、诊断 用、研究用的组合物，它们的制造方法及应用。还有关于SRCL-Pls蛋白质的激活剂和 拮抗剂，用SRCL-Pls的药物的筛选方法。更进一步关于构建含SRCL-Pls基因的载体， 用该构建的载体转化的转化细胞和关于针对SRCL-P1蛋白质的抗体及产生该抗体的 细胞。
背景技术：
作为动脉粥样硬化症的初期病变的病理学特征是泡沫细胞出现在动脉壁上增多 的现象。存在于巨噬细胞的细胞膜上的清除蛋白受体(以下简称SR)(Krieger，M.等人; Annu.Rev.Biochem.,63,601-637,1994)与LDL受体不同，缺乏胆固醇的负反馈调节，变 性的LDL(胆固醇与脂蛋白质的复合体是低密度脂白质)因为被积极地摄入细胞内，细 胞自身变成泡沫细胞而积累在血管内皮细胞下面。所以，巨噬细胞及其SR被认为在 形成动脉粥样硬化时起主要的作用。(Brown M, S.等人；Nature，343,508-509，1990, Kurihara， Y. A.等人；Current Opinion Lipidology， 2, 295-300,1991， Krieger, M.; TIBS, 17: 141-146,1992， Krieger， M.等人；J. Biol. Chem., 268(7),4569-4572, 1993)。因糖尿病产生的体内持续的高血糖，引起各种蛋白质的非酶促糖化。席夫碱-阿 吗多瑞(T ^卜''j )化合物经糖化过程产生最终产物美拉德反应后期产物(AGE: advanced glycation end products)。具有细胞障碍作用的AGE通过AGE受体结合于巨噬 细胞、血管内皮细胞、肝细胞、肾小球系膜细胞等，对机体施加恶劣的影响。例如AGE与巨噬细胞结合，促进TNF(Tumor Necrosis Factor肿瘤坏死因子)、 IL-l(Interleukin-l白细胞介素)及来自血小板的增殖因子(PDGF)等的细胞素的分泌，引 起以糖尿病性合并症为特征的细胞障碍，这一点已为人们所知。因为SR是与AGE的 摄取分解有关的受体之一(Araki, N.,等人;Eur.J.Biochem.，230,408-415,1995， Susuki,H. 等人；Circulation,92,1-428， 1995)，在SR双缺损小鼠中AGE的分解活性降低三分之一， 所以人们认为SR与糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜症、糖尿病性神经障碍等糖尿病 性合并症也有很深的关系。其次，在大鼠体内，因为饲喂过量的AGE白蛋白，和肾中 AGE的沉积，引起小球体硬化症(Vlassara, H.等人；Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 91, 11704-11708,1994)，所以推想，识另i」AGE的SR与小球体硬化症有深深的关联。再者，人们认为SR与早老性痴呆病也有关系。早老性痴呆病的病理学特征是p淀 粉样蛋白沉积的老人斑。有人报道，p淀粉样蛋白通过在小胶细胞上发现的SR产生激 活小胶细胞的活性氧而表达神经毒性(Nature, 382, 716-719， 1996)。作为SR的配体，因SR分子种类不同，而存在特异性上的差异，具有负电荷的配 体有，例如乙酰化LDL(AcLDL)氧化LDL(OxLDL)等的变性LDL、顺丁烯二酰化的BSA 等的变性蛋白质、多聚肌苷酸等的四螺旋核酸、葡聚糖硫酸和多聚岩藻糖等多糖类， 磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇等酸性磷脂类，内毒素(LPS)、 AGE、老化细胞及凋亡细 胞等。此外人们认为，SR还具有清除生物体内的各种变性物、病毒等异物和陈旧废 物的重要作用(Hamptom, R. Y.等人;Nature， 352, 342-344, 1991、 Tokuda， H.等人； Biochem. Biophys. Res. Commun., 196(1), 8-24， 1993、 Pearson, A. M.等人；J.Biol. Chem.,268, 3546-3554, 1993、 Dunne, D. W.等人;Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1863-1867, 1994、 Freeman, M. W.; Current Opinion in Lipidology， 5, 143-148, 1994)。在除巨噬细胞以外的肝类洞内皮细胞(Eskild, W.等人；Elsevier Biomedical N. Y.， 255-262， 1982)、血管内皮细胞(Baker， D. P.等人；Arteriosclerosis, 4， 248-255, 1984、 Bickel, R E.等人；J. Clin. Invest" 90, 1450-1457， 1992)、血管平滑肌细胞(Pitas， R. E. 等人;J. Biol. Chem., 265, 12722-12727, 1990、 Bickel, P. E.等人；J. Clin. Invest" 90, 1450-1457, 1992)、纤维芽细胞(Pitas, R. E.等人；J. Biol. Chem., 265， 12722-12727, 1990) 上都发现了SR。其次，SR可分类成SRA、 SRB、 SRC(Peason， A.等人；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4056-4060， 1995)、 FcyRIIB2 (Stanton, L. W.等人；J. Biol. Chem., 270, 22446-22451， 1992)以及macrosialin (CD68)(Ramprasad, M. P.等人；Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 92, 9580-9584, 1995)、人血管内皮OxLDL受体(LOX-l:类似植物凝集素的 氧化的LDL受体)(Sawamura, T.等人；Nature, 386， 73, 1997)， SRA可进一步分类成 SR-AI和SR-AII(Kodama,T.等人；Nature,343, 531-535,1990)及MARCO(—种新的巨噬细胞受体，具有胶原结构)(Elomaa, 0.等人；Cell, 80, 603-609， 1995)， SRB可进一 步分类成CD36(Endemann ， G.等人；J.Biol.Chem., 268,11811-11816,1993)和 SR-Bl(Acton,S丄.等人;J. Biol. Chem.,269，21003-21009， 1994)。SR-AI及SR-AII是均聚三体，是N末端在细胞内的内-外(inside-out)型贯穿膜的蛋白质。该蛋白质在细胞外部分可分辨出类似胶原蛋白的区段、a-螺旋区段和富含半 胱氨酸区段等构造上的数个区段(Rohrer， L.等人;Nature,343, 570, 1990、 Matsumoto,A. 等人；Proc.Natl.Acad.Sci. USA,87， 9133,1990)。类似胶原蛋白区段具有胶原蛋白特有 的(Gly-Xaa-Yaa)n构造(Xaa和Yaa可以是任何一种氨基酸残基)，这一区段有配体结合 部位的功能。a-螺旋区段则是每7个氨基酸向右旋转两圈的7肽重复序列，即a-螺 旋构造，每7个氨基酸有三条多肽，亮氨酸和异亮氨酸等疏水性氨基酸朝内侧，极性 氨基酸和糖链结合部位朝外侧(亮氨酸拉链)形成均聚三体。该区段的作用是维持均聚 三体的构造，并且，与变形LDL等配体结合并进入细胞内。由于核内体中的pH低，使 受体的三次构造改变，从而具有使配体解离的作用。该蛋白质的细胞质内区段具有和LDL受体和胰岛素受体中的NRXY顺序和铁 传递蛋白受体中的YXRF顺序相同的内吞作用信号特有的急转向(夕 < 卜夕一>)构造， 如果使这些顺序缺损，则内吞作用受到抑制。SR-AI和SR-AII是通过编码富含半胱氨酸的mRNA的两者择一地剪接产生的， SR-AI该区由110个氨基酸组成，SR-AII由17个氨基酸组成。已经发现至少在来自末梢 单球的巨噬细胞、肺胞巨噬细胞及肝K叩ffer细胞上有SR-AI和SR-AII，并且与生体 防御、动脉硬化、钙离子非依赖性的细胞接着等有关。(Krieger, M.等人； Annu.Rev.Biochem.,63，601-637,1994、 Wada,Y.等人；Ann. N. Y. Acad. Sci.， 748, 226-239， 1995、 Fraser,I.R等人；Nature,364,343， 1993)。其次，OxLDL存在于动脉硬化巢的巨噬 细胞内，在这种巨噬细胞的细胞膜上更多地发现SR-AI和SR-AII， SR-AI在转基因小 鼠中能抑制脂质负荷而引起的血中脂蛋白上升的现象，SR-AI和SR-AII对OxLDL的摄 取起重要的作用。另一方面，分类上属于SRA的MACRO和SR-AI有类似的构造，不存在a-螺旋区 段，其特征是具有长的胶原蛋白样的区段。发现于脾脏巨噬细胞和淋巴节巨噬细胞等 处的MACRO,由于其配体的特异性，被认为是作为针对细菌感染的生物体防御机构 发挥机能。铃木等人制作成功了SRA缺损的小鼠，他们用卡那霉素耐性基因置换了SR-AI 和SRA-II的共同部分的第四外显子(Suzuki,H,等人;Nature,386,292-296,1997)。 SRA缺损的小鼠和野生型比较表现出了免疫障碍，它们对李斯特菌和单纯疱疹病毒的感染率高。其次发生凋亡的T细胞的贪食现象与SRA有关系，SRA缺损的小鼠与野生型比 较，表现出贪食能力降低(Platt，N.等人；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93， 12456,1996)。还 有，SRA缺损小鼠与动脉硬化的动物模型的apoE缺损小鼠(Plump,A.S.等 人;Cel1，71,343，1992、 Zhag,S.H.等人;J.Clin.Invest.,94,937,1994)交配，得到了双重缺损 小鼠，有意思的是，它们的动脉硬化灶的面积也比apoE缺损小鼠的小(Suzuki,H.等 人;Nature,3 86,292-296,1997)。照这样，巨噬细胞机能的解明、动脉硬化、糖尿病性合并症以及AD、高p脂蛋 白血症、高胆固醇血症、高甘油三脂血症、低a脂蛋白血症、移植、动脉粥样硬化斑 切除和血管形成后再狭窄等各种疾患的发病机制的解明，然后其诊断、预防以及治疗 方法、还有为此可以开发利用的试药及医药，SR以及所有属于这一族的新型种类分 子的发现，使上述课题有了解决手段。另一方面，对生物体防御起着重要作用的补体系统，作为识别免疫球蛋白的分子， 已知有补体第一成分Cl活化的经典途径及细菌等异物为补体第三成分C3的直接 结合的第二途径。近年来加入到这些补体活化途径之中的已知有是血清凝集素的甘露 糖结合蛋白质(以下称MBP)，通过直接识别结合在异物表面的糖链而活化补体系统 的凝集素途径(Sato，T.等人;Int.Immunol. ，6,665-669,1994)。MBP是在Ca离子存在下与甘露糖以及N-乙酰葡萄糖胺等特异结合的C型 (外源)凝集素，其构造至少含有由(Gly-Xaa-Yaa)n组成的类似胶原蛋白的区域、糖链 识别区域(CRD)。与MBP相同，具有类似胶原蛋白区域和CRD的血清凝集素总称为 共同凝集素(3 >夕+ ^)(Malhotora,R.等人;Eur丄Immunol.,22,1437-1445，1992)，除 MBP以外还可以举出共同凝集素-43(CL-43)、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白 D(SP-D)以及牛粘合素(BKg)等。共同凝集素具有调理素活性，所以被认为与以细菌、 病毒为首的各种微生物的基础免疫有关系(Kawasaki,N.等人;J.Biochem.,106, 483-489,1989、 Ikeda， K.等人;J.Biol.Chem. 262,7451-7454,1987、 Ohta，M.等人；J.Biol. Chem"265,1980-1984,1990、 Summerfield,J.A.等人；Lancet,345，886,1995)。这类共同凝集素，如图l(a)所示，已知由含有(1)CRD和(2)类似胶原蛋白区域等特 征的基本构造构成(Malhotora,等人;Eur.J.Immunol.，22,1437-1445,1992)，这一基本构造 在类似胶原蛋白区域，由三螺旋形成的亚基，然后这种亚基形成3体、4体、6体等寡 聚体构造。最近有资料暗示共同凝集素与非特异免疫应答有关，例如有人报告，对于婴儿来 说，来自母亲的移行抗体和特有的防御系统不十分发达，在中和和排除各种微生物上 起重要作用(Super等人;Lancet,2,1236-1239,1989)。其次，关于这些共同凝集素在宿主的生体防御上的作用，例如由于MBP基因中的变异引起血中MBP浓度下降，宿主 变得易受感染，这样的研究结果己有人报告(Sumiya，等人;Lancet，337,1569-1570,1991)。 再有，有报告说，调理素作用不全的血清中MBP含量低(Madsen,H.O.等人;Immuno genetics,40,37-44,1994)，易发生细菌感染，(Garred，P.等人;Lancet,346,941 -943,1995)， 可以认为MBP对免疫机构有重要作用。本发明者曾发现，BKg和MBP能阻碍Hl和H3型的流感病毒A型感染和红 血球的凝集活性(Wakamiya等人；Glycoconjugate J.,8,235,1991 、 Wakamiya等 人;Biochem.Biophys.Res.Comm., 187,1270-1278,1992)。其次，在这之后获得了编码BKg 的 cDNA克隆，也发现了 BKg和 SP-D等的关连性(Suzuki等 人;Biochem.Biophys.Res.Comm" 191 ，33 5-342,1993)。共同凝集素可能是对阐明生物体防御机制有用的和作为生理活性物质有用的物 质，这一族新型分子种的发现，除对传染病的治疗外，对各种医疗领域乃至生物学领 域，人们也寄予很大的期望。发明内容本发明的目的是提供新型的清除蛋白受体，有可能用于阐明巨噬细胞和基础免疫 的机能、阐明动脉硬化、糖尿病性综合症、早老性痴呆病、高P脂蛋白血症、高胆固 醇血症、高甘油三酯血症、低ot脂蛋白血症、移植、动脉粥样硬化斑切除后和血管形 成后再狭窄、以及细菌感染症等各种疾病的发病机制，然后用于诊断、预防和治疗方 法以及用于为此开发的试药和医药。因此，本发明提供了(1) 一种蛋白质或其衍生物或片段，所述蛋白质具有SEQ ID NO: 2氨基酸号 l-742所示的742个氨基酸组成的氨基酸序列，或者，该蛋白质的氨基酸序列由SEQID NO: 2所示氨基酸序列中有一个或数个氨基酸缺失、置换或添加的氨基酸序列构成， 且该蛋白质和具有SEQ IDNO: 2氨基酸序列1-742所示氨基酸序列的蛋白质有相同 的性质；(2) —种分离的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQIDNO: l碱基号74-2299所示 的碱基序列、编码SEQ ID NO: 2中氨基酸号l-742所示的氨基酸序列或其片段的碱基 序列、或在严谨条件下与这些碱基序列或这些碱基序列的互补碱基序列杂交且编码与 具有SEQ ID NO: 2氨基酸号l-742所示氨基酸序列的蛋白质有相同性质的蛋白质的碱 基序列；(3) —种蛋白质或其衍生物或片段，所述蛋白质具有SEQ ID NO: 24氨基酸号l-618所示的氨基酸组成的氨基酸序列，或者，该蛋白质的氨基酸序列由SEQIDNO: 24所示氨基酸序列中有一个或数个氨基酸缺失、置换或添加的氨基酸序列构成，且该 蛋白质和具有SEQ ID NO: 24氨基酸序列1-618所示氨基酸序列的蛋白质有相同的性 质；(4) 一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQIDNO:23碱基号74-1933所 示的碱基序列、编码SEQIDNO:24氨基酸号l-618所示的氨基酸序列或其片段的碱基 序列、或在严谨条件下与这些碱基序列或这些碱基序列的互补碱基序列杂交且编码与 具有SEQ ID NO: 24氨基酸号1-618所示氨基酸序列的蛋白质有相同性质的蛋白质的 碱基序列；(5) —种蛋白质或其衍生物或片段，所述蛋白质具有SEQ ID NO: 4氨基酸号 l-742所示的742个氨基酸组成的氨基酸序列，或者，该蛋白质的氨基酸序列由SEQID NO: 2所示氨基酸序列中有一个或数个氨基酸缺失、置换或添加的氨基酸序列构成， 且该蛋白质和具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列l-742所示氨基酸序列的蛋白质有相同的 性质；(6) —种分离的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID NO: 3碱基号74-2299所示 的碱基序列、编码SEQ ID NO: 2氨基酸号l-742所示的氨基酸序列或其片段的碱基序 列、或在严谨条件下与这些碱基序列或这些碱基序列的互补碱基序列杂交且编码与具 有SEQ ID NO: 2氨基酸号l-742所示氨基酸序列的蛋白质有相同性质的蛋白质的碱基 序列；(7) 含有(2)、 (4)或(6)所述的多核苷酸为特征的载体；(8) 保持(2)、 (4)或(6)所述的多核苷酸的表达可能的转化细胞；(9) 培养用(2)或(4)所述的多核苷酸转化的细胞，收获产生的hSRCL-Pl蛋白质 为特征的蛋白质制造方法；(10) 培养用(6)中所述的碱基序列遗传转化的细胞，收获产生的mSRCL-Pl蛋白 质为特征的蛋白质制造方法；(11) (9)或(10)所述的制备方法，其中细胞是大肠菌、动物细胞或昆虫细胞；(12) SRCL-P1基因的表达水平被改变了的转基因非人动物；(13) (12)所述的转基因非人动物，其特征为SRCL-P1基因是编码SRCL-P1的 cDNA，基因组DNA或合成的DNA;(14) (13)所述的转基因非人动物，其特征为通过在基因表达调节部位引起变异 来改变表达水平；(15) —种剔除小鼠，它的mSRCL-Pl基因机能缺损；(16) 针对(l)、 (3)或(5)中所述的蛋白质或其片段的抗体；(17) (16)所述的抗体，其特征为多克隆抗体、单克隆抗体或肽抗体；(18) 针对(l)、 (3)或(5)中所记的蛋白质或其片段的单克隆抗体制作方法，其特 征为将(l)、 (3)或(5)中所述的蛋白质或其片段注入人以外的温血动物，选择抗体效价 被确认的该动物，取出脾脏或淋巴节，将它们含有的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融 合、制作出能产生单克隆抗体的杂交瘤；(19) 根据(16)或(17)中所述的抗体与SRCL-P1蛋白质或其片段的免疫结合而来的该蛋白质或其片段的定量方法；(20) 根据(16)或(17)中所述的抗体与SRCL-P1蛋白质或其片段的免疫结合而来的该蛋白质或其片段的检出方法；(21) 束U激(l)、 (3)或(5)中所述的蛋白质活性的激活剂；(22) 阻碍(l)、 (3)或(5)中所述的蛋白质活性或活性化的拮抗剂；(23) 应用(l)、 (3)或(5)中所述的蛋白质为特征的药物筛选方法；(24) 用(23)中所述的筛选方法获得的药物；(25) 以治疗与氧化LDL累积有关的病态为目的药物筛选方法，通过比较在候选 药物有或无的条件下(l)、 (3)或(5)中所述的蛋白质与氧化LDL的结合量可以做出评价， 当候选药物对该蛋白质与氧化LDL的结合有阻碍能力，则可鉴定出与氧化LDL累积有 关的病态的药物，以含有这样的工程为特征的药物筛选方法；(26) 通过(25)所述的筛选方法得到的药物；(27) 与氧化LDL累积有关的病态的治疗方法，应用(26)中所述的药物，具有以 阻碍SRCL-P1蛋白质或其片段与氧化LDL结合为特征的工程的方法；(28) 为治疗与氧化LDL累积有关的病态的医药组合物，含有(26)中所述的药物；(29) 和细胞上结合AGE有关的病态的治疗药物的筛选，通过比较(l)、 (3)或(5) 中所述的蛋白质在有或无候选药物的情况下与AGE的结合量，做出评价，根据候选 药物阻碍该蛋白质与AGE结合的能力，鉴定可用于治疗与细胞上结合AGE有关的病态 的药物的工程为特征的药物筛选方法；(30) 用(29)中所述的筛选方法得到的药物；(31) 与AGE结合于细胞有关的病态的治疗方法，应用(30)中所述的药物，以阻 碍SRCL-P1蛋白质或其片段与AGE结合的工程为特征的方法；(32) 含有(30)中所述的药物的医药组合物，其特征为与AGE结合细胞有关的病 态治疗用的医药组合物。


图1表示以前报告的主要的共同凝集素的基本构造和蛋白质的概况。 图2以前报告的3种共同凝集素的氨基酸序列的直线排列的前半部分。 图3表示和图2相同的直线排列的后半部分。图4(b)为测定本发明新型的清除蛋白受体的碱基序列所使用的各引物的名称， 表示顺序仪读出的碱基序列，图4(a)表示所得到的新型共同凝集素的ORF。图5 A:酵母，B:革兰氏阴性细菌(大肠杆菌，Escherichiacoli)或C:革兰氏 阳性细菌(金黄色葡萄球菌，Staphylococcus aureus)与表达hSRCL-Pl的细胞特异结合的情形。图6A:氧化LDL， B:甘露糖和C: AGE与表达hSRCL-Pl的细胞特异结合的情形。图7酵母在表达hSRCL-Pl的细胞内被摄取的情形。图8 A:健康人和B:小鼠的心脏血管内皮细胞中hSRCL-Pl被表达的情形。
具体实施方式
本发明人成功地克隆到了人和小鼠的新型SR。在新型SR(SRCL-P1)的C末端存 在着含有被认为与基础免疫有关的CRD的共同凝集素区段，其次，这种全部构造类似 SRA，特别是SR-A1。具体地说，靠N末端一侧至少含有亮氨酸重复4次的亮氨酸拉 链构造贯穿膜区段、ct-螺旋区段、类似胶原蛋白区段、颈区段、CRD区段。3个具有 上述特征的分子，由螺旋区形成a-螺旋、在类似胶原蛋白区段形成三螺旋，构成均聚 三体。其次，类似胶原蛋白区段在生理pH条件下，推测带有正电荷。还有，SRCL-P1 蛋白质具有多个糖链结合部位。使用本说明书时，所谓的hSRCL-Pl基因和mSRCL-Pl基因，除特别指出外，均 指含有SEQIDNO:l或3所示的核酸顺序的多核苷酸，它们的衍生物(相同体、变异 体、修饰体和多态变体)，以及它们的片段。其次，使用本说明书时，所谓的hSRCL-Pl 蛋白质和mSRCL-Pl蛋白质，除特别指出外，均指含有SEQ ID NO: 2或4所示的氨 基酸序列(多肽)，它们的衍生物、它们的片段。无论是天然的或是人工制作的，均包 含在本发明前面的记载中。可以举出hSRCL-Pl作为例子，它具有SEQIDNO:24所示的氨基酸的蛋白质(至 于SEQIDNO: l所示的蛋白质，是胶原蛋白区段的一部分和颈区段，即第483 606 号氨基酸残基缺失的变异体)，SEQIDNO: l所示的多核苷酸变异体的例子，可以举 出编码SEQ ID NO: 24的蛋白质的SEQ ID NO: 23所示的多核苷酸。10再有，本发明中也含有实际上与SEQIDNO: 2或4所示的氨基酸序列类似的氨基 酸序列及编码实际上与SEQ ID NO: 2或4所示的氨基酸序列类似的氨基酸序列的碱基 序列。并且也含有具有这些氨基酸序列的蛋白质。与SEQ ID NO: 2或4所示的氨基酸 序列实际上相似的氨基酸序列，和含SEQIDNO: 2或4所示的氨基酸序列的蛋白质具 有同样的性质，即是说，因为含有SR所特有的亮氨酸拉链构造的贯穿膜区段、ot-螺旋 区段、类似胶原蛋白区段，在具有活性、机能和三次构造的范围内，带有一个或数个 氨基酸置换、缺失、添加和/或插入等的改变的氨基酸序列。无论它们是天然的或是 人工制作的。其次，本发明也包含SEQIDNO: l或3之一的核酸顺序或其片段的核酸顺序、或 与它们互补的核酸顺序(以下称为特定顺序)、也包含严谨条件下能够杂交的核酸顺序。 在本发明中，所谓严谨条件是指，例如在含有5 xSSC、5XDenhard's溶液(0.1X BSA、 0.1%Ficoll400、 0.1%PVP)、 0.5% SDS和20 (ig/ml变性鲑精子DNA的溶液中，37。C保 温一夜，随后，在室温下用含0.1% SDS的2 x SSC洗净。使用适当的SSPE代替 SSC也很好。这样得到的核酸顺序，至少是特定的顺序，被认为具有50%的同源 性。特定顺序和严谨条件下可以杂交的核酸顺序所编码的蛋白质，推测多具有和 SRCL-P1蛋白质相同的性质，并且，只要具有和SRCL-P1蛋白质相同性质，本发明也 包括这样的蛋白质。特别是SEQIDNO:2所示hSRCL-Pl(氨基酸号1 742)的氨基酸序列是由742个 氨基酸组成的蛋白质，编码此蛋白质的碱基序列由2226个碱基组成。该顺序中存在 有亮氨酸拉链区段、a-螺旋区段、类似胶原蛋白区段、颈区段、CRD区段等特有的 氨基酸序列，即是说，存在有氨基酸号36 57所示的亮氨酸拉链区段、氨基酸号72 426(Coils Program)或81 431(Multicoil Program)所示的a-螺旋区段、氨基酸编号 443-589所示的类似胶原蛋白区段、氨基酸号590-606所示的颈部区段、氨基酸号607 742所示的CRD区段等。还可举出其它区段如氨基酸号63 742(TMHMM1.0 program)或者58 742 (TMpred program)所示的细胞外区段、氨基酸号1 39( TMHMM1.0 program)或1 37(TMpred program)所示的细胞内区段、氨基酸号 40 62 (TMHMM1.0 program)或38 57(TMpred program)所示的贯穿膜区段、氨基酸 号443 743的外源凝集素区段(结构域)等，还有，含有氨基酸号708 730所示的C 型凝集素基序。编码此蛋白质的碱基序列示于SEQIDNO: 1。其次，SEQIDNO:4所示的mSRCL-Pl(氨基酸号l 742)的氨基酸序列是由742 个氨基酸组成的蛋白质。编码此蛋白质的碱基序列由2226个碱基组成。该序列和序列 2所示的hSRCL-Pl相同，存在有亮氨酸拉链区段、a-螺旋区段、类似胶原蛋白区段、颈区段、CRD区段、C型凝集素基序等特征性的氨基酸序列。编码此蛋白质的碱基序列示于SEQIDNO: 3中。本说明书使用的所谓相同体是指同源性高的核酸顺序或氨基酸序列，至少在50% 以上，较好为70%以上，更好在90%以上。顺序中存在缺失和插入时，最好能进行帽 子(* ^ 、7 y)结合的同源性检査。例如，可以用多重直线排列(商品名SODHO，富 士通)的方法进行检查。其次，同源性检査的推导法可以用最严密的Sm池-Waterman 推导法。此外，可通过互联网利用FASTA和BLAST等。本说明书中使用的所谓变异体，可以举出，例如等位基因(allele)单核苷酸多 型性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)等。其次，在本发明的核酸顺序中也含有 密码子縮小范围内起变化的核酸顺序的变异。可以按照通常的方法利用合成的寡核苷 酸构成的引物，编码所希望的改变，使核酸顺序的密码子的一部分改变的，位置特异 的变异导入法等(Mark，D.R等人;Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,5662,1984)进行，本发明的 核酸顺序中也包括所得到的人工基因变异体。其次，也有超出密码子縮小范围的场合， 由变异的密码子翻译出变异的氨基酸，最好具有与正常氨基酸类似的性质。例如脂肪 族氨基酸的丙氨酸、颉氨酸、亮氨酸、以及异亮氨酸之间的变异，中性氨基酸有甘氨 酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、颉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺之间的变异，酸性氨基酸 有天冬氨酸和谷氨酸之间的变异，碱性氨基酸有精氨酸、赖氨酸以及组氨酸之间的变 异，有羟基的丝氨酸和苏氨酸之间的变异，有芳香环的苯丙氨酸和酪氨酸之间的变异 等，最好氨基酸的性质、功能和特性等都类似。本发明也包含这些人工的和天然的变 异的蛋白质。可以用PCR法引起特异位置上的变异，也可以使用人们熟知的其它方 法，引起任意位置上的变异。本说明书中使用的修饰体，例如乙酰基化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、 肉豆蔻酰基化、葡萄糖基化、羟化、磷酸化、硫酸化、甲酰基化、甲基化、聚乙二醇 化、脂质结合、核苷酸结合、金属结合(钙附加体等)、与多种蛋白质(白蛋白等)的融 合体、二聚体等的改变，都可用通常的方法进行。例如，因为大肠菌不能引起宿主的葡萄糖基化，所以在打算葡萄糖基化时最好用真核细胞进行。可以利用昆虫细胞，也 可以利用哺乳动物细胞进行翻译后的葡萄糖基化。本说明书中使用的多型性变种是指例如染色体DNA的构造以及形态上的差异 产生的多型性，由于某种基因的等位基因变化产生的多型性等。 一般真核生物的基因 多显示多型现象，由于这一现象， 一个或多个氨基酸也被置换，其次，这种场合下蛋 白质的活性仍保持着。因此，编码SEQIDNO:2或4任意一个显示的氨基酸序列的基因被人工改变，所得的编码蛋白质的基因，只要该蛋白质具有本发明的基因的特有的功能，本发明都包括在内。其次，SEQ ID NO: 2或4任意一个所显示的氨基酸顺序被 人工改变后得到的蛋白质，只要具有本发明的蛋白质的特征，都包括在本发明内。所 谓改变可理解为含有置换、缺失、添加和/或插入。本说明书中使用的所谓片段是指例如上述SRCL-P1具有的氨基酸序列中的任意 片段，可以举出细胞外片段和细胞内片段、贯通膜区段、亮氨酸拉链区段、a-螺旋区 段、类似胶原蛋白区段、颈部区段、CRD区段、类似共同凝集素区段、疏水性区段(颈 部区段、贯穿膜区段等)、亲水性区段(疏水性区段以外)等。再有可以举出这些片段被 融合的片段。例如可举出SEQ ID NO: 2所示的hSRCL-Pl的氨基酸序列缺失了贯穿膜 区段形成可溶性受体的由58乃至63号到742号的氨基酸片段、缺失CRD区段形成贯通 膜型清除蛋白受体的具有约1-606号氨基酸的片段、由亮氨酸拉链区段和cx-螺旋区段 构成的可溶性清除蛋白受体的约36号到426号乃至431号的氨基酸片段，还有，除去 CRD区段和颈部区段的第1-589号氨基酸的片段等。获得SRCL-P1基因的方法可以用任何方法获得本发明的SRCL-P1基因。例如，可以从表达该蛋白质的细胞 制取mRNA，再用常规方法转换成双链DNA，获得编码SRCL-P1的碱基序列。可用 异硫氰酸胍-氯化钙等方法抽提mRNA(Chirwin,等人；Biochemistry, 18， 5294, 1979)。 应用结合了寡聚(dT)的载体，例如聚蔗糖或胶乳粒，进行亲和层析等从总RNA提取 多聚(A)RNA。用所得的RNA做模板，用3'末端上有多聚(A)链的互补的寡聚(dT)或入 噬菌体引物，或者与SRCL-P1的氨基酸序列的一部分相对应的合成寡核苷酸作为引 物，进行逆转录酶反应(Mol.Cell Biol.，2,161,1982 、 Mol.Cell Bio1.,3，280,1983 、 Gene,25,263，1983)，这样得到的cDNA链，再用大肠杆菌RnaseH、大肠菌DNA聚合酶I、 大肠菌连接酶处理，通过变换成DNA，可得到双链的cDNA。可以将此cDNA重组 进质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体，转化进大肠菌，或体外包装之后转染进大肠菌， 建成cDNA文库。可以在这里使用的质粒载体只要能在宿主内复制，没有特别的限制。噬菌体载体， 只要能在宿主内增殖，也没有特别的限制。克隆用的载体，可以举出的有，pBR322、 pUC19、 XgtlO、人gtll等。其次，在提供免疫学筛选时最好有能够表达宿主内SRCL-P1 基因的启动子的载体。将cDNA重组进质粒的方法可参考Maniatis等人的方法(《分子克隆实验指 南》Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版)。其次，将cDNA重组入噬菌体载体的方法可参考Hyunh等人的方法(DNAClonging， a practical approach, 1， 49， 1985)。 前述将表达载体导入宿主细胞的方法，例如有脂聚胺、DEAE-葡聚糖、hanahan(〃 于"^)法、脂转染法、磷酸钙法由来的转染法、微注射法和电穿孔等方法(《分子克 隆实验指南》Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版)。体外包装可用市售的 试剂盒(Stratagene公司制、Amersham公司制)，简便易行。由上述制得的cDNA文库分离编码SRCL-P1蛋白质的cDNA的方法，可用一般 的cDNA筛选方法组合进行。例如，制作32P标记的探针，采用菌落杂交法 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72,3961,1975)、噬斑杂交法(《分子克隆实验指南》Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory,2,108,1989)可以 筛选出含有目的cDNA的克隆。其次，也可以用PCR法选择克隆。再者，在使用 表达cDNA的载体制作cDNA文库时可通过利用识别SRCL-P1的抗体来筛选目的 克隆。其次，用能表达SRCL-P1基因的细胞分离SRCL-P1基因的时候，例如，采用SDS 或蛋白酶K溶解该表达细胞，用酚处理，用核糖核酸酶消化没有用的RNA。用限制 酶消化得到的DNA，将所得的DNA片段用噬菌体或粘粒扩增制成文库。然后选择目 的克隆，就可以获得SRCL-Pl基因。可以应用马克萨姆-吉尔伯特法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74,560，1977)或桑格尔法 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463,1977)测定这样得到的DNA的碱基序列。可以用限 制酶等从上述得到的克隆中切出SRCL-Pl基因。使用根据SRCL-P1碱基序列合成的引物，应用以SRCL-Pl表达细胞的多聚 (A)+RNA为模板的RT-PCR法进行筛选，也是可以的。其次，不用PCR，根据SRCL-P1 碱基序列制作合成探针，直接筛选cDNA文库，也可以得到目的cDNA。用这些方 法得到的基因中，可以通过测定基因碱基序列选择出本发明的基因。也可以用例如磷 亚胺酸酯法(Mattencci M.D.等人，J.Am.Chem.Soc.，130,3185,1981)等核酸化学合成的通 常方法制作本发明的基因。表达载体的制作方法本发明还涉及以含有SRCL-Pls核酸顺序为特征的载体。对于载体没有特别的限 制，只要能表达SRCL-Pls蛋白质的即可，质粒载体、RNA载体、DNA载体、病毒 载体、噬菌体载体等都可以使用。具体地，可以举出Irwitrogen公司生产的pBAD/His、 pRSETA、 pcDNA2.1 、 pTrcHis2A、 pYES2 、 pBlueBac4.5 、 pcDNA3.1 、 pSecTag2 、 Novagen 公司生产的pET、 pBAC、 Promega公司生产的pGEM、 Stratagene公司生产的pBluescriptII、 pBS、 Phagescript、 pSG、 pSV2CAT或者Pharmacia公司生产的pGEX、 pUC18/19、 pBPV、 pSVK3、 pSVL等。表达载体上连接的SRCL-Pls cDNA顺序和启动子有功能地连接着。关于启动 子，可以举出噬菌体的APL启动子、大肠菌的lac、 trp、 tac启动子、SV40早期和晚 期启动子、T7和T3启动子、逆转录病毒的LTR启动子。特别是，可以使用的真核 细胞启动子，有CMV启动子、HSV启动子、SV40早期和晚期启动子、逆转录病毒 的LTR启动子、RSV启动子、金属硫蛋白启动子。再有，表达载体也可以含有能 选择转化的宿主的特殊记号和增强子。记号有二氢叶酸还原酶基因、卡那霉素耐性 基因、氮苄青霉素耐性基因等。增强子有SV40增强子、巨细胞病毒的早期增强子-启动子、腺病毒增强子等。转化细胞的制作方法本发明提供上述载体中保存的本发明的这些碱基序列，并保持可能表达它们的转 化细胞。虽然本说明书所指的作为转化细胞用的宿主细胞最好是动物细胞和昆虫细 胞，但是可以举出能够表达本发明的表达载体中的SRCL-Pls蛋白质的所有细胞(包括 微生物)。本说明书中的动物细胞或昆虫细胞，可以举出分别来自人的细胞、来自果蝇或蚕 的细胞。例如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、Vero细胞、骨髓瘤细胞、HEK293 细胞、HeLa细胞、Jurkat细胞、小鼠L细胞、小鼠C127细胞、小鼠FM3A细胞、小鼠 纤维芽细胞、骨芽细胞、软骨细胞、S2、 Sf9、 Sf21、 HighFiveTM(注册商标)细胞等。 本说明书所指的微生物包括大肠菌或酵母等。可以用上面所述的方法导入这些宿主。本发明的SR表达细胞，可以用来分析有关动脉硬化发病的SR路径、通过此路 径被摄入细胞的被修饰的LDL的特异性。其次，可以用作分析以受体为媒介的物质 摄入细胞的模型。其次，本发明的细胞可以用于动脉硬化症治疗药物的开发，例如， LDL变性的抑制剂、酰基辅酶A、胆固醇酰基转移酶(ACAT)活性抑制剂等的开发过程 中，用于药物的筛选。还有可以应用于有糖链的人SR蛋白质的制造。此外，可以用 于以SR为媒介的异物或变性物的处理过程的实验系统，或者作为引起伴随变性白蛋 白的感染的B型病毒等的感染实验系统。获得蛋白质的方法本发明也涉及培养上述用本发明的碱基序列转化的细胞，提取产生的SRCL-P1， 制造SRCL-P1的方法。可以用本领域的人熟知的方法进行细胞培养，蛋白质分离还有精制。
本发明的蛋白质，其本身可以作为，容易分离、精制、识别的重组融合蛋白质被 表达。所谓重组融合蛋白质编码目的蛋白质的核酸顺序紧连在可能表达的蛋白质的N 末端或/和C末端的一恻并添加了适当的肽链的可被表达的蛋白质。为了使表达的蛋白 质的精制变容易，最好作为具有细胞分泌信号的融合蛋白质被表达。其次，从各种原 料精制蛋白质，例如从培养细胞、培养组织、转化细胞等产生蛋白质的原料，可以釆 用历来公认的方法，如硫酸铵沉淀法等盐析、用交联葡聚糖等的凝胶过滤法、离子交 换层析法、疏水性层析法、色素凝胶层析法、电泳法、透析、限制过滤法、亲和层析 和高速液相层析法。
基因利用方法
为了检出SRCL-P1基因，可以根据SEQIDNO: l或3任意一个所记载的碱基序列 设计探针。或者，可以设计为了扩增含有这些碱基序列的DNA和RNA用的引物。利 用给定的顺序设计探针和引物是本领域的从业人员日常进行的工作。可以通过化学合 成得到具有设定的碱基序列的寡核苷酸，然后在此寡核苷酸上添加适当的标记，则可 利用各种各样的杂交检测法。或者可以采用PCR那样的核酸合成反应。作引物用的寡 核苷酸至少有10个碱基，较好15-50个碱基的长度是理想的，用作探针的寡核苷酸， 全长达100个碱基较为理想。其次，因为也可以应用于编码SRCL-P1蛋白质的基因变 异的检出和SNP的检出等，可用来诊断SRCL-P1基因变异而产生的疾病。例如，推想 可以利用来诊断动脉硬化、糖尿病性合并症以及早老性痴呆病、高P脂蛋白血症、高 胆固醇血症、高甘油三酯血症、低oc-脂蛋白血症、移植、动脉切除及血管形成后再狭 窄、以及细菌感染等各种疾病。再有，因为SRCL-P1基因可被导入并表达，对于基因 治疗也是有用的。
再有，根据本发明提供的SRCL-Pl的cDNA碱基序列，也有可能取得基因组 中存在的SRCL-P1基因的启动子区、增强子区。具体地说，用日本专利公开公报平 6-181767、 (J. Immunol" 155,2477, 1995、 Proc. Natl. Acad. Sci， USA" 92,3561, 1995)等
同样的方法得到这些控制区是可能的。本说明书中所述的启动子区是指存在于转录开 始部位，调控基因表达的DNA区，所谓增强子区是指存在于内含子、5'不翻译区或3' 不翻译区的增强基因的表达的DNA区。
蛋白质利用方法
技术领域：
本发明的SRCL-Pls蛋白质有可能被利用来阐明巨噬细胞和基础免疫的机能，阐明动脉硬化、糖尿病性合并症和早老性痴呆病、高P脂蛋白血症、高胆固醇血症、高 甘油三酯血症、低OC-脂蛋白血症、移植、动脉切除及血管形成后再狭窄、以及细菌感 染等各种疾病的发病机制。另外，有可能用于这些疾病的诊断、预防以及治疗方法， 和为了医治这些疾病而开发利用试药和医药都成为可能。其次，可以用作抗原，制作
针对SRCL-Pls的抗体。而且也可用于激活剂和拮抗剂的筛选。 激活剂和拮抗剂
本发明也涉及刺激本发明的SRCL-P1的活性或活性化的激活剂。还涉及阻碍本发 明的SRCL-P1的活性或活性化的拮抗剂。拮抗剂的筛选可以使用作用于例如表达 SRCL-Pl蛋白质的细胞的候补抑制剂和OxLDL或抗体的竞争实验系统，根据OxLDL 的结合比例筛选候补抑制剂是可能的。此外，可以使用本领域公认的方法。其次，抑 制剂也包含能阻碍SRCL-P1基因的表达的反义核酸。其它筛选方法有测定因受体的活 化发生的细胞夕卜pH变化的方法(Science， 246,181-296,1989)。
利用筛选的拮抗剂可以作为药物对与氧化LDL的积累以及细胞与AGE结合有关 的疾病进行治疗、预防等处理。这种筛选方法是将本发明的SRCL-P1与氧化LDL或与 AGE的结合量，在有候补药物存在下和不存在下做比较，根据这种候补药物阻碍两者 结合的能力可以鉴定用于处理目的疾病的药物，这种筛选方法包括有鉴定药物工程为 特征。
转基因非人动物
本发明涉及SRCL-P1基因的表达水平有变化的转基因非人动物。这里所谓的 SRCL-Pl基因包括编码hSRCL-P14或SRCL-Pl的cDNA、基因组DNA或是合成DNA。 其次，基因的表达既包括转录也包括翻译各步骤。本发明的转基因非人动物，对于 SRCL-P1的功能或表达调节的研究对推想与SRCL-P1有关的疾病的机理的阐明，医药 品的筛选，安全性试验用的疾病模型动物的开发是有用的。
在本发明中，正常情况下，调节基因表达的几个重要部位(增强子、启动子、内 含子等)的一部分由于发生缺失、置换、添加和/或插入等的变异，和原来的基因表达 水平比较上升或下降，这样的人工修饰是可能的。这种变异的导入可以用众所周知的 方法进行，可以获得转基因动物。
所谓转基因动物，狭义上讲，是通过基因重组，外来基因被人为地导入生殖细胞 的动物，广义上讲，是使用反义RNA抑制了特定的基因的功能的反义转基因动物和用 胚性干细胞(ES细胞)使特定的基因被缺损的动物，包含被导入了点突变的DNA的动物，在个体发生的初期，外来基因被导入安定的染色体，作为遗传物质传递给子孙的 动物。
本说明书中所谓转基因动物应广义地理解为人以外的所有脊椎动物。本发明中的
转基因动物对于SRCL-P1的功能或表达调节的研究，对人体内表达的细胞有关的疾病
的机理的阐明，医药品的筛选，安全性试验用的疾病模型动物的开发是有用的。 转基因动物的制作方法是在相差显微镜下用微型吸管将基因直接导入前核期卵
子的核的方法(微注射法，美国专利4873191)、使用胚性千细胞(ES细胞)的方法等。此 外正在开发将基因插入反转录病毒载体或腺病毒载体，感染卵子的方法、其次，精子 介导的将基因导入卵子的精子载体法等。
所谓精子载体法，是使外来基因附着在精子上或者用电穿孔等方法导入精子之 后，再使卵子受精，将外来基因导入的基因重组法(M丄avitranoet等，Cel1,57,717,1989)。 或者可以用噬菌体Pl的cre/lox P重组酶系统和啤酒酵母的FLP重组酶系统等，在体内 进行部位特异的基因重组，其次，也有人报告使用反转录病毒将目的蛋白质的转基因 导入非人动物。
使用微注射法制作转基因动物的方法是按照下面介绍的方法进行的。 首先，由与表达调控有关的启动子、编码特定蛋白质的基因、和多聚A信号构成 的转基因是必要的。由启动子的活性左右着特定分子的表达样式和表达量。其次，由 于导入的转基因的拷贝数和在染色体上的导入部位，制作的转基因动物在系统间的不 同，要确认在各系统间的表达样式和表达量。为了判明非翻译区和因为剪接而发生的 表达量的变化，最好预先在多聚A信号之前导入剪接内含子顺序。导入受精卵的基因， 尽可能使用纯度高的，这一点是重要的。作为使用的动物，采取受精卵用的小鼠(5-6 周龄)、交配用的雄小鼠、假妊娠的雌小鼠、结扎了输精管的雄小鼠等都可以用。
为了高效率地得到受精卵，最好也使用促性腺激素诱发排卵。回收受精卵，用微
注射法将微注吸管中的基因注入卵子的雄性前核。将注射过的卵子移入准备好的动物 (假妊娠的小鼠等)的输卵管， 一只动物约移植10 15个卵子。之后，为了确认诞生的 小鼠是否有导入的转基因，从尾部前端抽出基因组DNA ，用分子杂交法或PCR法检 出转基因，或者用阳性筛选法，即只有在发生了同源重组时，插入的记号被激活，才 可能应用这一方法。再有，为了确认转基因的表达，可使用RNA-DNA杂交法或 RT-PCR法检出来自转基因的转录产物。或者利用针对蛋白质或其片段的特异抗体进 行Western印迹。
缺损小鼠本发明的缺损(敲除，knock out)小鼠是指SRCL-Pl基因的功能经处理而丧失的小 鼠。所谓缺损小鼠是通过同源重组技术，使任意的基因破坏，其功能缺损的转基因小 鼠。利用ES细胞进行同源重组，选择一方等位基因改变了的、破坏了的胚性干细胞， 可以制作缺损小鼠。例如，在受精卵的胚盘胞及桑椹期，注入基因，经过操作的胚性 干细胞，得到了来自胚性干细胞的细胞和来自胚的细胞混合的嵌合体小鼠。这种嵌合 体小鼠(所谓嵌合体是指基于两个以上的受精卵的体细胞形成的单一个体)和正常小鼠 交配，可以制成一方的等位基因完全改变、破坏的杂合结合体小鼠。此外杂合接合体 小鼠相互交配，可制得同型接合体小鼠。
所谓同源交换，是指碱基序列相同或非常类似的两个基因之间，通过基因交换机 制发生交换。选择发生了同源交换的细胞可以使用PCR。使用插入基因的一部和期 待插入的区域的一部作为引物进行PCR，能产生扩增产物的细胞就可以判明发生了同 源交换。其次，在胚干细胞中表达基因重组的场合，导入的基因上结合了卡那霉素耐 性基因，导入后可通过卡那霉素耐性选择细胞，使用公认的方法及改进的方法可以容 易地进行选择。
抗体制作方法
技术领域：
本发明还提供识别SRCL-P1或其片段的抗体。本发明的抗体包括针对，例如 具有SEQ ID NO: 2或4任意一个记载的氨基酸序列的蛋白质或其片段的抗体。制作 SRCL-P1或其片段的抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、肽抗体)或抗血清，可以使 用本发明的SRCL-P1或其片段等作为抗原，按照本领域的人们公认的抗血清制作技术 操作。特别是，能够调控SRCL-P1功能的抗体(例如能识别CRD、类似胶原蛋白区段 和a-螺旋区段等的抗体)作为含有抗体的医药品是有用的。
将本发明的SRCL-P1或其片段本身、或者和稀释剂、载体一道注射到温血动物的 可能因注射而产生抗体的部位。为了注射时产生的抗体高，也可以注射完全的弗氏佐 剂和不完全的弗氏佐剂。通常每1 6周注射一次，共注射2 10次。可以使用的温血 动物有，例如猴子、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、鸡等。小鼠和大鼠就 很好用。大鼠以Wistar和SD系的为好，小鼠以BALB/c、 C57BL/6和ICR系的为好。
制作产生单克隆抗体的细胞时，从抗原免疫后的温血动物(例如小鼠)选择抗体效 价已测定的个体，在最后一次免疫后的2 5天采取脾或淋巴节作为抗原，将它们所含 的产生抗体细胞和骨髓瘤细胞融合，用这种方法可以制作产生单克隆抗体的杂交瘤。 可以用下述的方法测定抗血清的抗体效价，即用标记的SRCL-P1与抗血清反应，然后 测定与抗体结合了的标记剂活性。可以按照人们熟知的方法进行融合操作，例如Keller和Milstein法(Nature，256,495,1975)及其改进方法(J.Immunol.Method,39,285,1980 、 Eur丄Biochem., 118,437， 1981 Nature, 285, 446， 1980)。聚乙二醇(PEG)和仙台病毒等可 以用作融合促进剂，PEG就很好。再有，为了提高融合效率可以适当地添加植物凝 集素、多聚-L-赖氨酸、或者DMSO。
骨髓瘤细胞有X-63Ag8、 NS-1、 P3U1、 SP2/0、 AP-1等，最好用SP2/0。使用的 产生抗体细胞(脾脏细胞)数与骨髓瘤细胞数的最佳比例为1: 20 20: l，添加 PEG(PEG1000 PEG6000最好)的浓度为10 80%， 20 40°C，最好30 37。C培养1 10分钟，可进行高效率的细胞融合。可以使用各种方法筛选产生抗SRCL-P1抗体的 杂交瘤，例如，将SRCL-P1抗原直接或者与载体共同吸附在固相上(如微型平皿)添加 杂交瘤培养上清，然后加上被放射性物质和酶等标记了的抗免疫球蛋白的抗体(细胞 融合使用的细胞是小鼠细胞时，使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或者加蛋白A接合在固相 上抗SRCL-P1抗体的检出方法，可以举出在吸附了抗免疫球蛋白的抗体或蛋白A的固 相上添加杂交瘤培养上清，加入用放射性物质或酶等标记的SRCL-P1等，检出结合在 固相上的抗SCRL-P1的单克隆抗体。
选择和克隆抗SRCL-P1单克隆抗体可按照本领域人们熟知的或者按照下述方法 进行。利用添加了通常的HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺苷)的动物细胞用的培养基 进行。挑选、克隆及育种用的培养基可利用能使杂交瘤生长发育的那种培养基，例如 含1 20%，最好是10 20X牛胎儿血清的RPM1培养基、含1 10%的牛胎儿血清 的GIT培养基、或培养杂交瘤用的无血清培养基等。培养温度最好在37 X:左右。培 养时间通常为5天 3周，最好1 2周。通常在5% 二氧化碳气体下进行培养。杂 交瘤培养上清的抗体效价，可以用上述测定抗血清中的抗SRCL-P1抗体效价的同样方 法测定。这就是说，可利用放射免疫检测(RIA)法、酶免疫测定法(ELISA)、荧光免疫 检测法(FIA)、噬斑测定法、凝集反应法等，下面介绍的ELISA方法很好。
可以按照以下方法进行ELISA法筛选。将像处理免疫抗原同样的方法处理过的 蛋白质固定在ELISA平板的各个孔的表面。然后为防止非特异吸附，将BSA、 MSA、 OVA、 KLH、明胶、或脱脂乳等在各孔中固化。在这些孔中添加杂交瘤培养上清液， 放置一定时间进行免疫反应。用PBS等作为洗漆液洗净各孔。在洗涤液中最好添加 表面活性剂。添加酶标二次抗体并放置一定时间。标记酶可用P-半乳糖苷酶、碱性 磷酸酶、过氧化物酶等。用相同的洗涤液将各孔洗净后添加标记酶的底物溶液，进行 酶反应。添加的杂交瘤培养上清液中存在目的抗体时，就会发生酶反应，并且底物溶 液的颜色起变化。
可用通常的半固体琼脂法和极限稀释法等本领域公认的方法进行克隆，具体地说，在确认了上述方法产生了目的抗体的孔之后，进行克隆操作，获得单个克隆。最 好使用极限稀释法作为克隆方法，即稀释杂交瘤时，预期平均每个培养平板的一个孔 形成一个群落。在用极限稀释法克隆时，为了提高群落形成能力，可利用支持细胞，
也可以添加白细胞介素6等细胞增殖因子。此外，还可利用FACS和单细胞操作法。
克隆化的杂交瘤最好培养在无血清培养基中。并在此上清液中加入适量的抗体。这样 获得的单一的杂交瘤，用摇瓶和细胞培养装置进行大量培养、在动物的腹腔内培养(J.
Immunl. Meth., 53, 313， 1982)等方法都可得到单克隆抗体。在摇瓶培养时，可用含0 20X的FCS的细胞培养用的培养基(IMDM、 DMEM、 RPMI 1640及MEM等)。在动
物腹腔内培养时，最好使用细胞融合时使用的骨髓瘤细胞由来的动物及同一种动物、 同系统动物或缺损胸腺的裸小鼠。预先给予姥鲛垸等矿物油然后移植杂交瘤。1 2 周后腹腔内骨髓瘤细胞增殖，可以得到含单克隆抗体的腹水。
用本发明的单克隆抗体，因为能选择地识别SRCL-P1上的特异表位，可以不和其 它蛋白质发生交叉反应。 一般在构成这种蛋白质的氨基酸序列中，至少5个以上连续 的氨基酸，最合意地是7 10个氨基酸顺序才呈现出表位，这样就可以说是此蛋白质 显示了固有的表位。所以由SEQIDNO: 2和4任意一个记载的氨基酸进行选择，并且 至少连续5个氨基酸残基构成的氨基酸序列的肽组成的表位，能被单克隆抗体认识， 对本发明来说，就称为hSRCL-Pl和mSRCL-Pl特异的单克隆抗体。如果从SEQIDNO: 2和4记载的氨基酸序列之间找出保守的氨基酸序列，则可以选择出SRCL-P1共同的 表位。或者如果是含对各顺序特异的氨基酸序列领域，则可能选择出能识别各种蛋白 质的可能的单克隆抗体。
抗SRCL-P1单克隆抗体的分离和精制，可以采用和多克隆抗体的分离精制同样的 免疫球蛋白的分离精制法。人们熟知的精制法，如盐析法、酒精沉淀法、等电点沉淀 法、电泳法、硫铵沉淀法、用离子交换剂(如DEAE)的吸附洗脱法、超离心法、凝胶 过滤法、将抗原结合在固相上或用蛋白A或蛋白G等活性吸附剂仅仅提取抗体，获得 结合并解离的抗体的特异精制法，这样的方法都可以应用。为了防止精制过程中形成 凝集物以及抗体效价降低，可以添加如人血清白蛋白，浓度在0.05 2%。此外也可 以添加甘氨酸、a-丙氨酸、等氨基酸类，特别是赖氨酸、精氨酸和组氨酸等碱性氨基 酸、葡萄糖和甘露醇等糖类或氯化钠等盐类。在有IgM抗体的场合，因为知道特别容 易凝集，也可以用(3-丙氨酸内酯和无水醋酸处理。
本发明的多克隆抗体可以按照本领域人们熟知的，根据这些方法衍生出来的方法 制作。例如用免疫抗原(蛋白质抗原)本身，或它们与载体蛋白质的复合体，和制作上 述单克隆抗体的方法相同，对温血动物免疫，由该免疫动物可以提取针对本发明的蛋白质或其片段的抗体的血清，通过分离精制，可以制作出抗体。关于免疫温血动物使 用的抗原和载体-蛋白质复合体。载体蛋白质的种类和载体-半抗原的混合比，在载体 上偶联的免疫半抗原，对于抗体的效率若是好的话，什么样的物质以什么样的比例偶 联都可以，例如牛血清白蛋白和牛血清球蛋白、血蓝蛋白等，对半抗原l的重量比，
采用约0.1 20，最佳约1 5的比例，进行偶联。其次，半抗原和载体偶联时，可以
应用各种縮合剂，可使用戊二醛、碳化二亚胺、马来酰亚胺活性酯、含有巯基、二硫 代吡啶基的活性酯试药等。将縮合产物本身或与载体、稀释剂一道注入温血动物的可 能产生抗体的部位。为了提高注射产生抗体的能力，最好还注入完全弗氏佐剂和不完
全弗氏佐剂。通常每2 6周注射一次，共注射3 10次。从上述方法免疫的温血动物 的血液、腹水等，最好从血液，提取多克隆抗体。测定抗血清中多克隆抗体的效价， 可以用和上述测定血清中抗体效价样同的方法。多克隆抗体的分离精制可以按照与分 离精制上述单克隆抗体所用相同的免疫球蛋白分离精制法进行。
利用抗体的方法
可以利用针对SRCL-P1或其片段的单克隆抗体以及多克隆抗体，诊断与治疗和表 达SRCL-P1的细胞有关联的疾病。因为这些抗体与本发明的SRCL-P1或其片段能免疫 结合，所以可利用这些抗体测定SRCL-P1或其片段。具体地说，用这些抗体测定 SRCL-P1或其片段的方法，可以举出例如，三明治法，其特点是检出不溶性载体上结 合的抗体与标记的抗体和SRCL-P1或其片段反应生成的三明治错体，和竞争法，其特 点是标记的SRCL-P1与受检材料中的SRCL-P1或其片段与抗体发生竞争性反应，从抗 体与反应的标记抗体量测定受检材料中的SRCL-P1或其片段。
利用三明治法测定SRCL-P1或其片段可用二步法或一步法，二步法是首先在固定 化抗体与SRCL-P1或其片段反应之后，洗涤以完全除去未反应物，添加标记的抗体， 使形成固定化抗体-SRCL-Pl标记抗体， 一步法是将固定化抗体、标记抗体及SRCL-P1 或其片段同时混合。
测定中使用的不溶性载体有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙 烯酸酯、尼龙、聚縮醛、氟树脂等合成树脂、纤维素、琼脂糖等多糖类、玻璃、金属 等。不溶性载体的形状可以采用浅盘状、球状、纤维状、棒状、盘状、容器状、蜂窝 状、管状等各种形状。吸附了抗体的载体，在适宜的叠氮化钠等防腐剂的存在下，保 存于冷处。
关于抗体的固层化可以使用人们熟知的化学结合法或物理吸附法。化学结合法， 可以举出例如戊二醛法、N-琥珀酰-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-縮酸酯以及N-琥珀酰甲基_2-马来酰亚胺乙酰酯等的马来酰亚胺法、l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二 亚胺盐酸等碳化二亚胺法、此外，也可以用马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯 法、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸法、双重氮化联苯胺法、二棕榈基赖氨酸 法等。或者先使被检出物质与表位不同的第二抗体反应，形成复合体，将针对此抗体 的第三抗体用上述方法固层化也可能捕捉到被检物质。
使用酶、荧光物质、发光物质、放射性物质、以及金属螯合剂等作标记物质都很 好。酶，可以举出，例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、苹果酸脱氢酶、 葡萄球菌核酸酶、d-5-固醇异构酶、a-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、西洋山嵛 菜过氧化物酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶、乙酰胆碱酯酶等。荧光物质，可以举出，例如荧 光素异硫氰酸酯、藻胆色素蛋白、碱性蕊香红、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻青蛋白、 邻酞醛等。发光物质，可以举出，例如异鲁米诺尔、光泽精、鲁米诺尔、芳香族丙烯 镜酯、咪唑啉、丙烯二镜盐及其修饰酯、萤光素、萤光素酶、水母发光蛋白等、放射 性物质可列举有1251、 127I、 131I、 14C、 3H、 32P、 3SS等。不止这些，凡免疫测定上可以 使用的方法都没有特别的限制。其次，抗体上结合了生物素、二硝基酚、吡哆醛或荧 光胺那样的低分子半抗原也很好。使用西洋山嵛菜过氧化物酶作为标记酶更好。这个 酶能和多个底物反应，用过碘酸法容易将它结合在抗体上。
标记物是酶时，为了测定其活性，根据需要用显色剂作底物。用过氧化物酶时， 用11202作底物，显色剂可用2,2'-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑磺酸)铵盐(ABTS)、 5-氨 基水杨酸、邻苯二胺、4-氨基安替比林、3,3'，5,5'-四甲基联苯胺等。用碱性磷酸酶时， 底物可用邻硝基磷酸苯酯、对硝基磷酸苯酯，用(5-D-半乳糖苷酶时，底物用荧光素-二-((5-D-半乳糖吡喃苷)、4-甲基伞形酸苯基-p-D-半乳糖吡喃苷等。本发明还包括前述 的单克隆抗体、多克隆抗体以及试剂盒化的试药类。
偶联剂可用N，N'-邻苯二马来酰亚胺、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己垸酸-N-琥珀酰 亚胺酯、6-马来酰亚胺己酸-N-琥珀酰亚胺酯、4,4'-二硫代吡啶以及人们熟知的其它偶 联剂。这些偶联剂与酶及抗体反应，可根据各偶联剂的性质进行。其次，根据情况可 用抗体的片段作为抗体，例如Fab'、 Fab、 F(ab')2。其次，不论多克隆抗体还是单克隆 抗体都可经同样的处理获得酶标抗体。用上述偶联剂得到的酶标抗体，若用亲和层析 等公认的方法精制，可成为灵敏度很高的免疫测定系统。精制的酶标抗体、加上硫柳 汞或甘油等作稳定剂，或冷冻干燥后保存于暗处。
测定对象没有限制，只要是含有SRCL-P1的试料即可，如血浆、血清、血液、尿、 组织液、脑脊髓液等体液。各种细胞、组织等。人用抗体的制作方法
在人体内制作对任意抗原免疫的抗体，理论上是不可能的。其次，将小鼠单克隆 抗体注入人体，因为对人是异种蛋白，有发生各种副作用的危险。因此，把抗体应用 于人时，最好用对人抗原性低的抗体。
人的单克隆抗体的制作方法，除了细胞融合法以外，还有用Epstein-Bar病毒 (EBV)遗传转化的方法，还有把这种转化的细胞与亲细胞融合的方法，利用基因工程 的嵌合抗体，制作人用的抗体等。所谓嵌合抗体是指将不同种动物的免疫蛋白基因片 段连接制成的抗体。所谓人用抗体是指将小鼠等对人是异种的抗体，加以改变，把H 链和L链的互补性决定部(CDR)以外的一次构造，用人抗体的对应部分的一次构造置 换了的抗体。
嵌合抗体的制作方法如下，首先将小鼠免疫，由此小鼠单克隆抗体的基因切出与 抗原结合的抗体可变部(V区)，使与来自人骨髓瘤的抗体恒定部(C区)基因结合，制作 成嵌合基因。这种嵌合基因如果在宿主细胞中表达，就可产生人-小鼠-单克隆抗体。 由于嵌合抗体对人抗原性小，可用做注入人体的治疗性和摄像诊断用的单克隆抗体。 与抗体有关的公认的技术见于特开平05-304989号、特开平04-330295号、W09106649、 特开昭63-036786号、特公平06-98021号等。
其次，最近开发出了比嵌合抗体更有用的是人用抗体。人用抗体是指仅将抗体分 子的抗原结合部位(CDR: Complementary determining reagion，互补决定区)的基因顺序 移到了人的抗体基因上(CDR嫁接)，除了抗体分子的CDR外，整个分子都是人抗体。 由于本抗体比人-小鼠嵌合抗体，小鼠抗体部分少，抗原性小，因而安全性高。制作 人单克隆抗体用的亲细胞是人/小鼠杂合骨髓瘤SHM-D 33株(ATCC CRL 1668)或者 RF-S1株可获得与小鼠亲细胞同样高的融合效率。用这些亲细胞得到的杂交瘤，无饲 喂细胞也可以克隆，IgG型抗体比较稳定，而且可以大量生产。亲细胞的培养用添加 T15%FCS的ERDF培养基，其它操作与小鼠的情况是相同的。其次，制作IgG型的 人单克隆抗体时最好采用末梢血液的被抗原充分感应了的人淋巴球。如果难以取得被 抗原充分感应了的淋巴球，也可在体外进行抗原的感应。在日本，现在正在进行针对 成年人T细胞白血病的人用抗体的临床试验。关于人用抗体的制造方法及其有关的技 术可以利用例如美国Genentech公司(W09222653 、 W09845332 、 WO9404679 、 WO9837200 、 WO9404679)和英国Celltech公司(W09429451 、 W09429351 、 WO9413805、 WO9306231、 WO9201059、 W09116927、 W09116928、 WO9109967、 W08卯1974、 WO8901783)等公开的技术。采用上述的方法可以有效地将本发明的抗体人化，在给予人的场合非常有用。 组合物
SRCL-P1多核苷酸、或蛋白质以及抗体物质、而且SRCL-P1的拮抗物等，与氧化 LDL(变性LDL)累积有关的病态，例如从动脉粥样硬化症等的动脉硬化开始、与AGE 结合到细胞上有关的小球体硬化症等的障碍、糖尿病性合并症、以及AD、高(3脂蛋白 血症、高胆固醇血症、高甘油三脂血症、低a脂蛋白血症、移植、动脉切除以及血管 形成后再狭窄、以及细菌感染症等各种疾病的诊断、预防和治疗方法，以及可应用的 试药和医药的开发。其次，也可以和公认的医药合用或配合应用。例如动脉粥样硬化 症的治疗药、可以和ACAT抑制剂、HMG-CoA还原酶阻碍剂、脂质调节剂、胆汁酸 调节剂合用或配合应用。
本发明的医药组合物可含有SRCL-P1多核苷酸和蛋白质、刺激SRCL-P1活性或活 化的物质或阻碍物质，针对SRCL-P1蛋白质的抗体等物质(以下称SRCL-P1关连物质)。 SRCL-P1关连物质可以直接或用水稀释后使用，可以配合各种药品、非医药品使用。 这种场合中该物质的配合量，要根据制品作适当的选择，通常全身给药时，可以用人 体重量的0.001~50%、最好是重量的0.01~10%，少于0.001%就不认为可能满足促进泪 液分泌作用，其次，超过50%时制品本身的稳定性以及香味等特性可能受到损害。
除前述的口服和静脉内给药以外还可以选择经粘膜、皮肤、肌肉内、皮下、直肠 内、眼局部等给药途径。
本发明的SRCL-P1关连物质可以盐的形式含在制剂中。药剂学容许的盐，可以举 出，例如无机碱、有机碱等碱的盐、无机酸、有机酸、碱性或酸性氨基酸等的酸附加 盐等。无机碱可以举出，例如钠、钾等碱金属、钙、镁等碱土金属、铝、铵等、有机 碱可以举出，例如乙醇胺等一级胺、二乙基胺、二乙醇胺、二环己基胺、N，N'-二苄 基乙二胺等二级胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、皮考啉、三乙醇胺等三级胺。无机酸 可以举出，例如盐酸、溴氢酸、硝酸、硫酸、磷酸等。有机酸可以举出，例如蚁酸、 醋酸、乳酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、安息香酸、柠檬酸、琥珀 酸、苹果酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。碱性氨基酸例如可列举精氨 酸、赖氨酸、鸟氨酸等。酸性氨基酸可列举天冬氨酸、谷氨酸等。
口服时的剂型有散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸齐U、锭齐U、酏齐U、悬浮剂、乳剂和糖 浆剂等，可以适当选择。另外，在这些制剂中可施加缓释、稳定、易崩解、难崩解、 肠溶化、易吸收等修饰。另外，口腔内局部给予时的剂型有咀嚼剂、舌下剂、颊剂、 锭剂、软膏剂、贴布剂、液剂等，可按需选择。并且，这些制剂可施加缓释、稳定、易崩解、难崩解、肠溶化、易吸收等修饰。
关于上述剂型，可以采用人们熟知的给药系统(DDS)技术。本说明书所述的DDS
制剂是指处方化制剂，局部适用制剂(糖锭、圆片形锭、舌下锭等)，控制药物释放制 剂、肠溶制剂和胃溶性制剂等，给药途径，生物药效率，副作用等都加以考虑的是指 最适宜的制剂形态的制剂。
DDS的基本构成要素有药物、药物释放的模数、数量和治疗方案构成，至于各构 成要素，特别是停止释放时能使血中浓度迅速下降的半减期短的药物最好，给药部位 的生体组织不反应的量最好，再有，设定期间中维持最佳的药物浓度的治疗方案最好。 药物释放的模数基本上有药物储藏库、释放控制部、能源及放出孔或释放表面。这些 基本构成要素不必完全齐备，可以适当增加或减少，可以选择最佳的情况。
DDS中可以使用的材料有高分子材料、环化糊精诱导体、卵磷脂等。高分子材料 有不溶性高分子材料(聚硅酮、乙烯-醋酸乙烯酯的共聚物、乙烯-乙烯醇的共聚物、乙 基纤维素、醋酸纤维素等)，水溶性高分子材料和羟基凝胶形成的高分子(聚丙烯酰胺、 聚羟基甲基丙烯酸乙酯交联体、聚丙烯交联体、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、水溶性纤维 素衍生物、交联泊洛沙姆、甲壳质、壳聚糖等)、缓溶性高分子(乙基纤维素、甲基乙 烯基醚-无水马来酸共聚体的部分酯等)、胃溶性聚合物(羟基丙基甲基纤维素、羟基丙 基纤维素、焦糖钠、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯.甲基丙 烯酸甲酯共聚物等)、肠溶性聚合物(羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸邻苯二甲 酸纤维素、羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯、羧甲基乙基纤维素、丙烯酸类聚合物等)、 生物分解性聚合物(热凝固或交联的白蛋白、交联的明胶、胶原、纤维蛋白、聚丙烯 酸氰酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚-p-羟乙酸、聚己内酯等)，可根据剂型适当选择。
特别是，聚硅酮、乙烯-醋酸乙烯酯共聚合体、乙烯-乙烯基乙醇的共聚合体、甲 基乙烯基醚-无水马来酸共聚合体的部分酯可以用于药物释放的控制，醋酸纤维素可 以用作浸透压泵的材料，乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、甲基 纤维素可以用作缓释剂的膜材料，聚丙烯基交连体可以用作口腔粘膜或眼粘膜附着剂 使用。
其次，根据剂型(口服齐U、注射剂、座剂、等人们熟知的剂型)，在制剂中可以加 入溶剂、赋形剂、包衣剂、基剂、结合剂、润滑剂、分散剂、助溶剂、悬浊化剂、粘 稠剂、乳化剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、无痛化剂、保存剂、矫味剂、芳香剂、着
色剂等。
本发明举出各种具体例子加以说明，但是对这些并没有特别的限制。 [溶剂]精制水、注射用水、生理盐水、花生油、酒精、甘油，[赋形剂]淀粉类、乳糖、葡萄糖、白糖、结晶纤维素、硫酸钙、碳酸钙、滑石、二氧化钛、岩藻糖、木 糖醇、[包衣剂]白糖、明胶、醋酸、邻苯二酸、纤维素以及上述高分子，(基剂)凡士 林、植物油、聚乙二醇、水包油乳剂性基剂、油包水乳剂性基剂，(结合剂〕淀粉及 其衍生物，纤维素及其衍生物、明胶、精氨酸钠、角豆树胶、阿拉伯树胶等天然高分 子化合物、聚乙酰吡咯烷酮等的合成高分子化合物、糊精、羟基丙基淀粉，(润滑剂〕 硬脂酸及其盐类、滑石、蜡类、小麦淀粉、聚乙二醇、加氢植物油、蔗糖脂肪酸酯、 聚乙烯二醇，〔分散剂〕淀粉及其衍生物、琼脂、明胶粉、碳酸氢钠、纤维素及其衍 生物、焦糖钙、羟基丙基淀粉、羧甲基纤维素及其盐类、以及其偶联体、低置换型羟 基丙基纤维素，(助溶剂〕环化糊精、乙醇、丙烯二醇、聚乙烯二醇，(悬浊化剂〕阿 拉伯树胶、角豆树胶、精氨酸钠、单硬脂酸铝、柠檬酸、各种表面活性剂，(粘稠剂〕 焦糖钠、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、角豆树胶、 阿拉伯树胶、精氨酸钠，〔乳化剂)阿拉伯树胶、胆固醇、角豆树胶、甲基纤维素、 各种表面活性剂、卵磷脂，(稳定剂〕亚硫酸氢钠、抗坏血酸、生育酚、螯合剂、惰 性气体、还原性物质，〔缓冲剂)磷酸氢钠、醋酸钠、硼酸，(等渗化剂)氯化钠、葡 萄糖，(治痛剂〕盐酸普鲁卡因、利多卡因、苄基醇，(保存剂〕苯甲酸及其盐类、对
氧苯甲酸酯类、氯代丁醇、逆性石碱、苄基醇、酚、thyromesale、〔调味剂〕白糖、 糖精、甘草精、山梨醇、木糖醇、甘油、(芳香剂〕橙皮酊、玫瑰油、〔着色剂)水溶 性食用色素、色淀染料。
实施例
以下是关于本发明的新型清除蛋白受体用实施例依次作详细的说明，但是当然不 可以用这些实施例的揭示内容对本发明做出限定的解释。
就是，EST数据库的检索(实施例1)，筛选用探针的制作(实施例2),来自人胎盘 的cDNA文库的筛选(实施例3)，新型人清除蛋白受体的碱基序列的确定(实施例4)， 和新型小鼠清除蛋白受体的cDNA的获得(实施例5)，其次，瞬间表达新型人清除蛋白 受体的转染体的制作方法(实施例6和7)，稳定表达新型人清除蛋白受体转染体的制作 方法(实施例8和9)，新型人清除蛋白受体的结合特异性的验证(实施例IO)，贪食能力 的证明(实施例ll)，然后，血管内皮细胞中表达的证明(实施例12)，因为对以上这些 结果都做了举例证明，以下加以说明。
实施例l: EST数据库的检索
通过比较已知的共同凝集素，即人MBP，人SP-A和人SP-D的氨基酸序列(参看图2
和3，图中,确认相同的氨基酸残基部分已用方框圈起)对分子间保守性高的区域进行检索。结果表明人MBP的氨基酸序列中从第220号到第246号的27个氨基酸(图3,白框圈出 部分，SEQ ID NO: 5)的保守性高，做成几个相当于这一区域的相似顺序，并进行 EST(Expressed Sequence Tags)数据库检索。使用的EST数据库是1996年10月11日的， 含676750条顺序。
结果得到了数个含有和上述27氨基酸的序列同源性高的氨基酸序列。对所得数据 的氨基酸序列进行GenBank/EST数据库检索，以判定各是已知或未知的物质，相似顺 序为
Glu-Lys-Cys-Val-Glu-Met-Tyr-Thr-Asp-Gly-Lys-Trp-Asn陽Asp-Arg-Asn-Cys-Leu-Gl n-Ser-Arg-Leu-Ala-Ile-Cys-Glu-Phe(SEQ ID NO: 6)，用此氨基酸序列检索时得到的顺 序中，得到了两个数据，它们含有同源性高的未知氨基酸序列(登录号W72977和 R74387)。它们分别来自胎盘和胎儿心脏，它们是显示新型共同凝集素的碱基序列的 一部分的克隆。
所以，这中间，购自ATCC(American Type Culture Collection)的来自胎儿心脏的 克隆(I.M.A.G.E. Consortium Clone ID 34472)，被用来制作为筛选以下新型清除蛋白受 体所用的探针。
实施例2:筛选用探针的制作
用引物(Parmacia公司制M13 Universal Primer(SEQ ID NO: 7， 5'-荧光素 -cgacgttgtaaaacgacggccagt-3')和M13 反向引物(SEQ ID NO: 8 ， 5'-荧光素 <&§8&&&0&§"&1§&03'))测定了上述克隆的插入DNA碱基序列。
将这一碱基序列的读码框和共同凝集素的氨基酸序列作比较，由此得出可以读取 的相当于氨基酸序列的碱基序列，使用Applied Biosystems公司制造的392ADNA/RNA 合成仪制作了相当于这一部分的地高辛(DIG)标记的cDNA探针用的引物(反向引物， caatctgatgagaaggtgatg(SEQ ID NO: 9)禾口正向引物，acgaggggctggatgggacat(SEQ ID NO: 10)。用PCRDIG探针合成试剂盒(Bohringer-Manheim公司制)进行了DIG标记。反应 组成如下，质粒DNA(克隆W72977,50ng/ul):2(il(100ng),10x缓冲液5|il, 25mMMgCl2: 5pl, dNTP(PCR标记混合物)5jil，20mM反向引物2.5|il,20mM正向引物5pl, H20: 28)^1，Taq聚合酶0.5|al)。用阿透公司生产的PCR仪进行PCR反应，92°C l分钟，55 °C l分钟，72°C 2分钟，循环35次。
实施例3:人胎盘cDNA文库的筛选
首先，用以下方式进行了人胎盘的噬菌体cDNA文库的效价测定.用mLB培养基(含10mMMgSO4和0.2%麦芽糖的LB培养基(lg胰酶水解胨，0.5g酵母提取物， 0.5g NaCl/100ml)在37。C培养了 16小时的大肠杆菌(Escherichia coli)Y1090r-0.2ml用SM 缓冲液(5.8g NaCl、 2g MgS04.7H20、 2M Tris-HCl(pH 7.5) 25 ml、 5ml 2%明胶/L)阶 段稀释了的cDNA文库O.lml 37。C培养15分钟，然后加入2.5 ml LB-上层琼脂糖 (0.75%琼脂糖/LB培养基)并混合均匀，倒在90mm直径的LB培养基平板(岩城硝 子公司制)(1.5%琼脂/LB培养基)。室温下15分钟令其固化，42。C保温5小时，将 各平板的噬斑计数后，通过计算求出噬菌体的数据。结果数据是2.1X101()pfb/ml。就 这样测定了效价的cDNA文库，利用实施例2制作的探针按以下过程进行了筛选。
用mLB培养基37。C培养了 16小时的大肠杆菌(Escherichia coli)Y1090r-0.6ml和用 SM缓冲液稀释的cDNA文库lx105 pfu 37。C保温15分钟，然后加入7.5 ml LB上层琼 脂糖(0.75%琼脂糖)并混合均匀。将它铺在140 mn^LB培养基方形平板(日水制药社制) 上，制作10个平皿，室温15分钟使之固化，42t:培养5小时。确认噬斑形成后，再复 印至尼龙膜上。用Nytran 13N (Schleicher and Schuell Co.)进行复印。将12.5cm x 9.0cm 滤膜在蒸馏水中浸10分钟润湿，然后在Whatman 3MM纸上除去多余水分，将滤 膜放在形成了噬斑的平板上。放置2分钟后，剥下滤膜，风干IO分钟。用0.2M NaOH/1.5MNaCl将噬菌体DNA变性2分钟，用0.4M Tris-HCl(pH7.6)/2x SSC中和2 分钟，用2xSSC洗净2分钟。然后用GS GENE LINKER(Bio-Rad制)进行紫外线照 射，将噬菌体DNA固定在滤膜上。杂交和信号的检出按以下方法进行。用2xSSC将 滤膜浸湿，用Whatman 3MM纸除去多余水分，移入杂交袋和杂交溶液(5 x SSC, 1% 封闭剂，0.1% N-月桂酰肌氨酸，0.02% SDS)68。C预杂交1小时。接下来除去袋中的 杂交溶液，袋中加入含DIG标记的cDNA探针10ng/ml的杂交溶液，55'C杂交16小 时。杂交终了后，将滤膜用2 x SSC/0.1% SDS溶液室温洗涤5分钟，洗2次，55°C 下，用0.5x SSC/0.1% SDS溶液洗15分钟，洗2次。然后用DIG缓冲液I(lOOmM Tris-HCl， 150 mMNaCl (pH 7.5))处理1分钟，除去SDS，用DIG缓冲液11(1%封 闭剂，DIG缓冲液I)处理30分钟将滤膜封闭。用DIG缓冲液I洗l分钟，然后加 入用DIG缓冲液II稀释5000倍的碱性磷酸酶标记抗体(Bohringer-Manheim公司制> 溶液，室温进行30分钟抗体反应之后，用DIG缓冲液I室温下洗15分钟，洗2次。 用DIG缓冲液III (100 mM Tris-HCl， 100 mM NaCl (pH 9.5), 50 mM MgCl2 )处理3 分钟提高Mg^的浓度，当加入NBT/BCIP (和光纯药社制)的DIG缓冲液III显色 时，得到了 10个阳性克隆。从平板上把相当于这些克隆的噬斑切下来加到装了 lml SM缓冲液的试管中，搅拌10分钟后用SM缓冲液作阶段稀释，将此稀释液O.lml 和用mLB培养基37。C培养了16小时的大肠杆菌(Escherichia coli)Y1090r-0.2ml混合，37。C培养15分钟。然后将混合液加到2.5 ml LB-上层琼脂糖中并混合均匀，铺 在90 mm直径的LB培养基平板上面，制作10个平板，室温15分钟令固化，42 'C培养5小时，得到了几个噬斑，与第一次筛选一样地进行了第二次筛选。
实施例4:新型人清除蛋白受体碱基序列的测定
从平板上切出第二次筛选得到的阳性克隆中被认为是合适的克隆的噬斑，加到装 入了200(il蒸馏水的试管中，室温搅拌30分钟之后，15000rpm离心分离5分钟得 到上清。以得到的上清作模板，用TaKaRaLAPCRKitVer.2(保酒造社制)，通过PCR 扩增插入的DNA。 PCR反应的组成如下(上清27 nl, 10x LA PCR缓冲液II(不含 Mg2+ ): 5 25 mM MgCl2 : 5 pi, dNTP混合物:8 20uM lgtll反向弓I物(SEQ ID NO: 11， 5'-ttgacaccagaccaactggtaatg-3'): 2.5 20 uM人gtll正向引物(SEQ ID NO: 12， 5'-ggtggcgacgactcctggagcccg-3'): 2.5 (il, LA Taq聚合酶:0.5 pi, H20添加至总体积50 fil)。使用Applied Biosystem公司制的Gene Amp PCR系统9600进行PCR反应，98 °C20秒，68°C5分钟为一循环，进行30循环。PCR产物经1%琼脂糖电泳确认后， 从凝胶切出精制。精制时使用了 Pharmacia公司生产的Sephaglas Band Prep Kit试 剂盒。
切出的DNA片段被重组进了 Irwitrogen公司生产的TA克隆试剂盒的 pCR2.1载体。重组的载体被转化进了 Invitrogen公司生产的TA克隆试剂盒含有的 TOP10F'细胞。用LB培养基(100 pg/ml氨苄青霉素)培养转化体，用碱SDS法抽 出了各克隆含有的3种质粒DNA。
用限制酶切断被认为合适的所得的DNA，将各DNA片段重组进了 pUC18载体，转化进了 XLl-Blue细胞。用LB培养基(100 |ig/ml氨苄青霉素)培养 转化体，用碱SDS法抽出质粒。由CL-P1-2-1得到了含EcoRI-HindIII片段、Hind III-EcoRI片段的质粒，由CL-Pl-3-4得到了含EcoRI-BamHI片段、BamH I-Sma I片 段、SmaI-HindIII片段、Kpnl-Sau3AI片段、Sau3AI-EcoRI片段、EcoRI-Kpnl片 段、EcoRI-Smal片段的质粒，由CL-P1-3-7得到了含EcoRI-BamHI片段、BamH I隱SmaI片段、SmaI-HindIII片段、Kpnl-Sau3AI片段、Sau3A
I-EcoRI片段、EcoRI-Kpnl片段、KpnI-EcoRI片段的质粒。使用AutoRead Sequening Kit(Pharmacia公司生产)带有的M13 Universal Primer(SEQ ID NO: 7)、 M13 Reverse Primer(SEQ ID NO: 8)和用DNA7RNA合成仪作成的FITC (Pharmacia公司 生产FluorePrime)标记的以下引物，用Pharmacia公司生产的AutoRead Sequencing Kit和A丄F.自动合成仪测定了全部的碱基序列。HPP 1: 5'-荧光素-cgtgaaaatgaatggaagtgg-3' (SEQ ID NO: 13)、 HPP 2: 5'-荧光素-ttttatccattgctgttcctc-3' (SEQ ID NO: 14)、 HPP 3: 5'-荧光素-ctggcagtccccgaggtccag-3' (SEQ ID NO: 15)、 HPP 5: 5'-荧光素-gctggtccccccggagagcgt-3'(SEQ ID NO: 16)。
以上实施的顺序测定的概略示于图4。图4(a)表示获得的清除蛋白受体的共同凝 集素构造部分的ORF ，其中的G-X-Y(G表示甘氨酸，X和Y可以是任何一种氨基 酸残基)表示类似胶原蛋白区。然后，图4(b)表示上述各引物的名称，用顺序仪读取的 碱基序列(用箭形符号表示)以及M13 Universal primer (用U表示)和M13 Reverse primer(用R表不)。
其次，用CapSitecDNA ，决定了含有此顺序的转录开始点的5'末端区的碱基 序列。
根据Cap Site cDNA人肝(NIPPON GENE公司生产)使用添上的IRC2 Primer(5'-caaggtacgccacagcgtatg-3'(SEQ ID NO: 17)禾卩用Applied Biosy stems公司生产 的392ADNA/RNA合成仪合成的TGP1 Primer (5'-tcttcagtttccctaatccc-3' (SEQ ID NO: 18))进行第一次PCR。反应混合物总液量50(il，含有LAPCR Buffer n(不含Mg2。、 2.5mMMgCl2 、各200 的dATP、 dCTP、 dGTP禾口dTTP (以上保酒造社制)l pi : Cap Site cDNA Human Liver, 0.5 (iM IRC2 Primer(以上NIPPON GENE公司生产)以及 0.5 pMTGPI Primer。 PCR的条件为，热变性95°C20秒，60。C退火20秒，伸长反应 72"C20秒，进行35个循环，再，包括重复反应前95'C热变性5分钟，最后72"C伸 长反应10分钟。第一次PCR终了后，进行嵌套PCR。取第一次PCR产物1 fil做 模板，引物用添上的2RC2引物(5'-gtacgccacagcgtatgatgc-3'(SEQ IDNO: 19))及合成 的TGP2引物(5'-cattcttgacaaacttcatag-3' (SEQ ID NO: 20))(用和合成TGP1 Primer同 样的方法合成)，用和第一次PCR相同的反应组成、条件(但是循环次数为25次)进 行。以上的PCR反应用保酒造社生产的TaKaRa PCR Thermal Cycler 480进行。得到 的PCR产物经琼脂糖电泳确认后，从凝胶中切出条带，-8(TC冻结10分钟，15000rpm 离心分离10分钟后，取上清用酒精沉淀精制。
将精制的DNA片段重组进了 Novagen公司生产的pT7BlueVector,将此载体 转化进了感受态细胞XL1-Blue。用LB培养基(100 pg/ml氨苄青霉素)培养转化体， 用碱 SDS法抽出质粒，用Pharmacia公司生产的AutoRead S叫uencing Kit和A. L. F. DNA Sequencer测定了碱基序列。引物用AutoRead Sequencing Kit附带的Ml3 Universal Primer (SEQ ID NO: 7)和Ml 3 Reverse Primer(SEQ ID NO: 8)。
然后，为了确认N末端，合成了得到的cDNA克隆N末端部分的顺序上游方向的引物5'-atcttgctgcagattcgtgac-3'(SEQ ID NO: 21)，对胎盘来的cDNA文库(Clontec 公司生产)进行了筛选。筛选用合成的上游方向的引物5'-atcttgctgcagattcgtgac-3'(SEQ ID NO: 21)和载体上含有的一部分引物人gt11 5'测序引物5'-gactcctggagcccg-3'(SEQ ID NO:22)进行PCR。配制的反应液含2.5mMMgCl2、 1 xLAPCRBuffer II(不含Mg2+)、 2U TaKaRa LA Taq、 2种引物5'-atcttgctgcagattcgtgac-3'(SEQ ID NO: 21)、入gtll 5'测序 引物5'-gactcctggagcccg陽3'(SEQIDNO: 22)各0.2 (iM、胎盘来的cDNA文库1 pl、 加水至总量50 ^、 94。C2分钟进行一个循环、94°C30秒、60°C30秒、72。Cl分30秒 进行50个循环。
将得到的cDNA用琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭溶液(O.l (ig/ml)染色、用 紫外线灯确认电泳图形，发现相当于约600bp的插入顺序被扩增了出来。因此将此 扩增的部分从琼脂糖凝胶切出、-S(rC冻结10分钟、15000 rpm离心分离10分钟后， 取上清，用酒精沉淀精制。将精制的DNA片段重组进Novagen公司生产的pT7Blue Vector,将此载体转化进了大肠菌XL1-Blue的感受态细胞。用LB培养基(50 |ig/ml 氨苄青霉素)培养转化体，用碱SDS法抽出质粒，用PEAppliedBiosystems公司生 产的DNA Sequencing Kit和序列分析仪ABI PRISM 377测定了碱基序列。引物用 Pharmacia公司生产的AutoRead Sequencing Kit附带的Ml3 Universal Primer(SEQ ID NO: 7)和M13 Reverse Primer(SEQ ID NO: 8)。
已弄清楚，得到的碱基序列是比N末端一侧的604碱基更长的顺序。由以上结果 确认，这里得到的hSRCL-Pl的cDNA含有2628碱基，具有2226碱基的ORF(翻译 解读框)(SEQIDNO: 1)， SEQIDNO:2所示的742个氨基酸是编码的氨基酸。
接下来，用GenBank数据库进行DNA和氨基酸相同性的检索，得到的氨基酸 序列，和以前发现的共同凝集素/清除蛋白受体终归有所不同，发现是新型的蛋白质 顺序。
其次，得到了SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的第483 606号氨基酸缺失， 由SEQIDNO:23所示的碱基序列的第74 1933号得到编码的突变体(SEQ ID NO: 24)。
实施例5:新型小鼠清除蛋白受体的cDNA的获得
使用和hSRCL-Pl同样的方法，进行了小鼠肝脏cDNA文库的筛选，得到了 mSRCL-Pl基因。所得mSRCL-Pl的cDNA克隆含有2637碱基，具有2226碱基的 ORF(翻译解读框)(SEQIDNO:3)， SEQIDNO:4表示的742氨基酸，可以确认是编 码的氨基酸。实施例6: hSRCL-Pl的瞬间表达载体pEGFP-Nl-hSRC-Pl的构建 首先，SEQ ID NO: 1所示的hSRCL-Pl的开始密码到终止密码，使用 ccgctcgagcggtcaccatgaaagacgact碱基序歹U (SEQ ID NO: 25)做成的弓|物禾口 tccccgcggtaatgcagatgacagtactgt碱基序列(SEQ ID NO: 26)做成的引物、以人胎盘由来的 cDNA文库做模板，通过PCR(TaqKaRa公司生产TaKaRa Thermal Cycler MP)进行 了扩增。将得到的hSRCL-Pl cDNA和pT7Blue T-Vector(Novagen公司生产)连接，并 转化进了大肠菌XL1-Blue。由得到的克隆精制了含hSCRL-Pl cDNA的质粒。用序 列分析仪确认了所得质粒的碱基序列之后，用限制酶Xhol和SacII消化正确无误的 质粒，用同样的酶消化精制的pEGFP-Nl 载体(Clontech公司生产)，进行了连接。 连接的质粒被转化进大肠菌XL1-Blue之后，培养得到的克隆，精制质粒，被认为是 瞬间表达载体pEGFP-Nl-hSRCL-P 1 。
实施例7:用瞬间表达系统表达hSRCL-Pl
用实施例6中得到的表达载体pEGFP-N 1 -hSRCL-P 1和LIPOFECTAMINE 2000(LF2000)Reagent(GIBCOBRL公司生产)，试验了在CHO细胞中瞬间表达。首先， 准备了 LF2000 Reagent溶液(LF2000 Reagent 12 nl、 Nutrient Mixture F-12 Ham(Ham's F-12培养基(Sigma公司生产)))0.2 ml，室温培养5分钟之后，和载体溶液0.2 ml (pEGFP-Nl-hSRCL-Pl载体4吗、Ham's F-12培养基)混合，培养20分钟。然后添 加在35mm培养皿中用2 ml Ham's F-12培养基(含5% FCS)培养至高密度的CHO 细胞。37°C、 5%C02下培养4小时之后，换上新培养基，再继续37t:5。/。C02下 培养20小时。用Olympus公司生产的倒立型系统显微镜1X70的荧光观察系统， 进行GFP的荧光像的观察，以确认有无表达。这样得到的细胞被认为是瞬间表达 hSRCL-Pl的细胞。
实施例8:制作hSRCL-Pl的稳定表达细胞株用的载体pcDNA3.1/Myc-His A-hSRCL-Pl的构建
首先，SEQ ID NO: 1所示的hSRCL-Pl的开始密码到终止密码中取 aatgcggccgcaccatgaaagacgacttcgcagag碱基序列(SEQ ID NO: 27)用作弓l物，和取 gctctagaccgcggtaatgcagatgacagtac碱基序列(SEQ ID NO: 28)用作引物，以来自人胎盘 的cDNA文库作模板，进行了 PCR (TaKaRa公司生产Takara Thermal Cycler MP) 扩增。将得到的hSRCL-Pl cDNA禾卩pT7Blue T-Vector(Novagen公司生产)连接，并转化进了大肠菌XL1-Blue。由得到的克隆精制了含hSCRL-Pl cDNA的质粒。用序列 分析仪确认了所得质粒的碱基序列之后，用限制酶Notl和SacII消化正确无误的质 粒，用同样的酶消化精制的pcDNA3.1/Myc-His A载体(Invitrogen公司生产)，进行 了连接。连接的质粒被转化进大肠菌XL1-Blue之后，培养得到的克隆，精制质粒， 被认为是稳定表达载体pcDNA3.1/Myc-His A-hSRCL-Pl 。
实施例9: hSRCL-Pl的稳定表达细胞株的制成
用实施例 8中得到的表达载体 pcDNA3.1/Myc-His A-hSRCL-Pl和 LIPOFECTAMINE2000(LF2000)Reagent(GIBCOBRL公司生产)，试验了hSRCL-Pl的 稳定表达。首先，准备了 LF2000 Reagent溶液0.5.ml(LF2000 Reagent 30 pl、 Ham's F12培养基)，室温培养5分钟之后，和载体溶液0.5ml(载体10吗、Nutrient Mixture F-12 Ham(Ham's F-12培养基)(Sigma公司生产))混合，培养20分钟。然后添加在 25cm3摇瓶中用5 ml Ham's F-12培养基(含5% FCS)培养至高密度的CHO细胞。 37°C、 5%C02下培养4小时之后，换上新培养基，再继续37"5%<302下培养20 小时。然后将培养基换用Ham's F-12培养基(含5% FCS、 0.4 mg/ml Geneticin (GIBCOBRL公司生产))，接着培养10天。中间更换一次培养基。
通过此10天的药物选择，只有转化的细胞生存并增殖，而非转化细胞死亡了。为 了从得到的转化细胞中获得高表达的细胞，使用细胞分选仪(Becton Dikinson公司生 产)进行分选。首先将细胞表面表达了hSRCL-Pl的细胞进行染色。用5mlPBS(-)洗转 化的25cm3摇瓶的细胞两次之后，用EDTA solution 0.02% (Nakalitesk公司生产)0.3 ml将细胞剥下，悬浮在10mlPBS(-)中，4。C下、200 xg离心7分钟，除去上清。添 加用2 % FCS/PBS(-)稀释10倍的抗myc抗体(Invitrogen公司生产)50 )iil到剩下的 细胞，将细胞好好地悬浮之后，4"C下培养20分钟。然后，添加2X FCS/PBS(-)10ml并 悬浮之后，4'C下、200 xg离心7分钟，除去上清，洗净细胞。在剩下的细胞中添加 用2 % FCS/PBS(-)稀释10倍的第二抗体Alexa488标记抗小鼠IgG(H+L)溶液 50^1，将细胞好好地悬浮之后，4'C下培养20分钟。然后，添加2 % FCS/PBS(-)10 ml并悬浮之后，4°C下、200 xg离心7分钟，除去上清，洗净细胞。剩下的细胞悬 浮在2 % FCS/PBS(-)0.5 ml中，作为分选的样本。将样本通过细胞分选仪附带的5 ml试管(Becton Dickson公司生产)然后加到细胞分选仪上。同样方法处理没有转化的 CHO细胞作为对照样本，选出比对照样本荧光强度高10倍的细胞。取96孔细胞培养 平板，每孔放入100 fil Ham's F-12培养基(含5% FCS、 0.4 mg/ml Geneticin)和平均 放入一个细胞。37 °C、 5% C02下进行培养，培养一周后，再每孔加100 |il培养液，继续培养一周。由于用Geneticin的药物选择作用，将增殖起来的克隆分成两份，在 12孔和24孔细胞培养用平板中继代培养。这时，除了一个孔中由二个以上细胞增 殖的克隆以外，以9: 1的细胞比播种于12孔和24孔细胞培养用平板。37°C、 5% CCb下进行培养，当12孔平板的细胞达到高密度时，再将每个克隆与分选时同样的方 法染色后送入FACSCalibur(BectonDickinson公司生产)，测定表达量。确认了表达量 高的克隆之后，取分别对应的24孔平板的细胞作为稳定表达细胞株 (CHO/hSRCL-Pl)。
实施例10: hSRCL-Pl的结合特异性
用实施例9得到的稳定表达细胞株(CHO/hSRCL-Pl)试验了hSRCL-Pl对(l)酵 母(Zymosan A Bioparticles 、 Molecular Probes公司生产)、革兰氏阴性细菌(Escherichia coli Bioparticles、 Molecular Probes公司生产)或革兰氏卩日性细菌(Staphylococcus aureus Bioparticles、 Molecular Probes公司生产)、(2)氧化LDL(2'0 mg/ml LDL添加50^iM CuS04反应24小时，再对PBS(-)透析过)、(3)AGE-HAS (AGE-人血清白蛋白、按 照Ikeda,K.等人.,Biochemistry 35(24),8075-8083(1996)的方法处理)、或者(4)甘露糖 (a-D-甘露糖BP-探针,生化工业社生产)或岩藻糖(ot-L-岩藻糖BP探针、生化工业社生 产)的结合特异性。
首先，1 x 105 CHO/hSRCL-Pl细胞播种于35 mm平皿(松浪玻璃公司生产)中， 37 °C、5% C02下培养3天。培养在2mlHam'sF-12培养基(含5% FCS、 0.4 mg/ml Geneticin)中进行。3日后用含2% FCS的Minimum Essential Medium Alpha Medium(aMEM/2% FCS)l ml洗两次，然后添加含有25 jig/ml酵母、25 |ag/ml革兰 氏阴性细菌、25|ug/ml革兰氏阳性细菌、5pg/ml氧化LDL、 10吗/mlAGE、或10 (ig/ml甘露糖或10 pg/ml岩藻糖的aMEM/2%FCS各1 ml， 4'C下反应3小时，然 后用l mlaMEM/2%FCS洗5次。
用以下方法确认结合。首先，关于(2)、 (3)和(4)，分别添加抗氧化磷酸乙酰胆碱 抗体(2)，抗HSA抗体(BIOSYS公司生产)(3)， streptavidin,Alexa594 conjugate (molecular Probes公司生产)(4)各用otMEM/2n/。FCS稀释100倍的溶液1 ml，然后4 'C培养30 分钟，之后，用lmlocMEM/2。/。FCS洗3次。其次，从(1)到(4)全部都添加4%多聚 甲醛/PBS(-)溶液0.2 ml，室温培养20分钟进行固定，用lml TBSC(宝酒造社制 TBS(Tris-Buffered Saline)其中添加了粉末状CaCl2并用灭菌蒸馏水调整最终浓度为5 mM)洗3次。然后，关于(2)和(3)，与第二抗体进行反应。这就是说分别添加用25 % BlockAce(大日本制药社制)/TBS稀释200倍的若丹明标记抗小鼠IgM Muchain(Chemicon International公司生产)(2)和Alexa 594抗山羊IgG (H+L)(Molecular Probe公司生产)(3)溶液1 ml，接着室温培养30分钟，然后用1 ml TBSC洗3次。 然后用SlowFade Light Antifade Kit(Molecular Probe公司生产)将(l)至U (4)装片，在 荧光显微镜下观察样本。使用Olympus公司生产的倒立型系统显微镜IX70的荧光观 察系统进行荧光像的观察。分别地将(1)的结果表示于图5(A:酵母、B:革兰氏阴性细 菌(Escherichia coli)、禾卩C:革兰氏阳性细菌(Staphylococcus aureus))(2)到(4)的结果表 示于图6(A:氧化LDL、 B:甘露糖、和C: AGE)。这些图清楚地表明，所有(l)到 (4)，在稳定表达hSRCL-Pl的CHO细胞上，都能观察到特异的结合像，使用微生物的 图5A到C中显示的结果，hSRCL-Pl的染色的地方(各左图，绿色染色)和各种微生 物存在的地方(各中央图，红色染色)是重叠的(Overlap，各右图)，表明了各种微生物 对hSRCL-Pl的特异结合。
还有，在瞬间表达hSRCL-Pl的细胞上(参见实施例7)，也同样得到显示特异结合 的结果。
实施例11:借助于hSRCL-Pl的吞噬作用结合物被摄入细胞内 用实施例7和9得到的hSRCL-Pl的瞬间表达细胞和稳定表达细胞株，观察了实 施例10中所用的各种结合物的细胞内摄取。改良了实施例10中记载的方法，与结 合物反应温度用37 °C，确认了结合物的摄入。染色后，用Olympus公司生产的共 焦点激光显微镜，通过三维图像处理，观察了向细胞内摄取的状态。用瞬间表达细胞 对酵母得到的结果，表示于图7，证明了酵母(红色染色)被摄取进表达hSRCL-Pl(绿 色染色)的细胞内。并且，用稳定表达细胞株也得到了同样的结果。
实施例12:用血管内皮细胞证明SRCL-P1的表达
为了确认hSRCL-Pl的组织内表达的部位，使用来自健康人和小鼠心脏的石腊包 埋切片(Novagen公司生产)，按照以下的操作，做了荧光免疫染色。
在石腊包埋切片载片的染色瓶中，在二甲苯中室温下浸泡10分钟，浸3次，进 行脱石腊处理。然后在室温下在100%-90%-80%-70%酒精中顺次各浸10分钟，在 PBS(-)溶液中浸10分钟，进行水合作用。
其次，为了抑制组织切片中内因性过氧化物酶活性，将切片在含有3%过氧化 氢的PBS(-)溶液中室温下浸泡10分钟，然后室温下浸泡在封闭剂(大日本制药社制) 中1小时，进行封闭处理。
接下来在保湿箱中，将抗hSRCL-Pl家兔多克隆抗体(IgG部分、100 pg/ml)100 pl作为第一抗体，涂布在组织切片上，室温下反应30分钟。在染色瓶中将第一抗体浸
在洗净液(Tris-HCl: pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween20)中，室温下缓慢振荡10分 钟，洗3次，然后与作为第二抗体的POD (过氧化物酶)标记抗家兔IgG羊抗体 (Boehringer Mannheim公司生产)以5 U/ml浓度，和第一抗体时同样地反应，并洗净。 然后将Biotinyl Tyramide Amplification Reagent(NEN(商标名)、Life Science Products 公司生产)涂布在切片上，室温反应10分钟，和第一抗体时同样地洗净。AvidinAlexa Fluor(商标名)488 conjugate(Molecular Products公司生产)l mg/ml,用PBS(-)溶液稀释 100倍，取此溶液100 ^ ，在保湿箱中涂布在载玻片上的组织切片上，室温下反应30 分钟，和第一抗体时同样地洗净后，用Slowfade Light Antifade Kit(Molecular Products 公司生产)装片，用荧光显微镜(Nikon公司生产)观察样本。另外用正常兔血清代替第 一抗体进行反应，进行了同样处理的载玻片作为阴性对照。
这一结果，正如图8所示，A:健康常人和B:小鼠的，心脏血管内皮细胞染色 像观察(各左图)，阴性对照的这样的染色像(各右图)则完全看不到。因此证明了 SRCL-P1在心脏中在血管内皮细胞中表达，在这里表明了有关氧化LDL和AGE等与 血管壁结合的可能性。
发明的效果
本发明的SRCL-P1蛋白质，因为具有SR构造和共同凝集素构造，所以被认为 是显示这些特有的效果的物质，有可能利用来阐明巨噬细胞和基础免疫的机能、阐明 动脉硬化、糖尿病性合并症和早老性痴呆病、高P脂蛋白血症、高胆固醇血症、高甘 油三酯血症、低a脂蛋白血症、移植、动脉硬化手术和血管形成后再狭窄、阐明细菌 感染症等各种疾病的发病机制，然后用于诊断、预防和治疗方法以及用于为此开发的 试药和医药。序列表
〈110〉扶桑药品工业株式会社
<120>新型清除蛋白受体
<130〉 01P211WO
<160> 28
<210〉 1 <211> 2628 <212> DNA
<213>智人(Homo Sapiens)
<220>
<221〉 CDS
<222〉 (74). (2299)
<400〉 1
ggggggacga cttcctcggc tgcgcggcgc tcgcgcggag ctccccggcc ggcggtgcgt 60 ccccacggtc acc atg aaa gac gac ttc gca gag gag gag gag gtg caa 109 Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gin 1 5 10
tec ttc ggt tac aag egg ttt ggt att cag gaa gga aca caa tgt acc 157 Ser Phe Gly Tyr Lys Arg Phe Gly lie Gin Glu Gly Thr Gin Cys Thr
15 20 25
肌a tgt aaa aat aac tgg gca ctg aag ttt tct ate ata tta tta tac 205 Lys Cys Lys Asn Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser lie lie Leu Leu Tyr
30 35 40
att ttg tgt gcc ttg eta aca ate aca gta gcc att ttg gga tat aaa 253 lie Leu Cys Ala Leu Leu Thr lie Thr Val Ala lie Leu Gly Tyr Lys 45 50 55 60
gtt gta gag aaa atg gac aat gtc aca ggt ggc atg gaa aca tct cgc 301 Val Val Glu Lys Met Asp Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Thr Ser Arg
65 70 75
caa acc tat gat gac a_ag etc acs gca gtg gaa agt gac ctg aaa aaa 349 Gin Thr Tyr Asp Asp Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys
80 85 90
tta ggt gac caa act ggg aag aaa get ate age acc aac tea gaa etc 397 Leu Gly Asp Gin Thr Gly Lys Lys Ala lie Ser Thr Asn Ser Glu Leu
95 100 105
tec acc ttc aga tea gac att eta gat etc cgt cag caa ctt cgt gag 445 Ser Thr Phe Arg Ser Asp lie Leu Asp Leu Arg Gin Gin Leu Arg Glu
110 115 120
att aca gaa aaa acc age aag aac aag gat acg ctg gag aag tta cag 493 lie Thr Glu Lys Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gin 125 130 135 140
gcg age ggg gat get ctg gtg gac agg cag agt caa ttg aaa gaa act 541 Ala Ser Gly Asp Ala Leu Val Asp Arg Gin Ser Gin Leu Lys' Glu Thr
145 150 155
ttg gag aat aac tct ttc etc ate acc act gta aac aaa acc etc cag 589Leu Glu Asn Asn Ser Phe Leu lie Thr Thr Val Asn Lys Thr Leu Gin
160 165 170
gcg tat犯t ggc tat gtc acg aat ctg cag caa gat acc age gtg etc 637 Ala Tyr Asn Gly Tyr Val Thr Asn Leu Gin Gin Asp Thr Ser Val Leu
175 180 185
cag ggc 38t ctg cag 33c C33 3tg tat tct cat aat gtg gtc ate atg 685 Gin Gly Asn Leu Gin Asn Gin Met Tyr Ser His Asn Val Val lie Met
190 195 200
aac etc aac aac ctg aac ctg acc cag gtg cag cag agg aac etc ate 733 Asn Leu Asn Asn Leu Asn Leu Thr Gin Val Gin Gin Arg Asn Leu lie 205 210 215 220
acg aat ctg cag egg tct gtg gat gac aca age cag get ate cag cga 781 Thr Asn Leu Gin Arg Ser Val Asp Asp Thr Ser Gin Ala lie Gin Arg
225 230 235
ate aag aac gac ttt caa aat ctg cag cag gtt ttt ctt caa gcc aag 829 lie Lys Asn Asp Phe Gin Asn Leu Gin Gin Val Phe Leu Gin Ala Lys
240 245 250
aag gac acg gat tgg ctg aag gag aaa gtg cag age ttg cag acg ctg 877 Lys Asp Thr Asp Trp Leu Lys Glu Lys Val Gin Ser Leu Gin Thr Leu
255 260 265
get gcc aac aac tct gcg ttg gcc aaa gcc aac aac gac acc ctg gag 925 Ala Ala Asn Asn Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu
270 275 280
gat atg aac age cag etc aac tea ttc aca ggt cag atg gag aac ate 973 Asp Met Asn Ser Gin Leu Asn Ser Phe Thr Gly Gin Met Glu Asn lie 285 290 295 300
acc act ate tct caa gcc aac gag cag aac ctg aaa gac ctg cag gac 1021 Thr Thr lie Ser Gin Ala Asn Glu Gin Asn Leu Lys Asp Leu Gin Asp
305 310 315
tta cac aaa gat gca gag aat aga aca gcc ate aag ttc aac caa ctg 1069 Leu His Lys Asp Ala Glu Asn Arg Thr Ala lie Lys Phe Asn Gin Leu
320 325 330
gag gaa cgc ttc cag etc ttt gag acg gat att gtg aac ate att age 1117 Glu Glu Arg Phe Gin Leu Phe Glu Thr Asp lie Val Asn lie lie Ser
335 340 345
aat ate agt tac aca gcc cac cac ctg egg acg ctg acc age aat eta 1165 Asn lie Ser Tyr Thr Ala His His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu
350 355 360
aat gaa gtc agg acc act tgc aca gat acc ctt acc aaa cac aca gat 1213 Asn Glu Val Arg Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp 365 370 375 380
gat ctg acc tec ttg aat aat acc ctg gcc aac ate cgt ttg gat tct 1261 Asp Leu Thr Ser Leu Asn Asn Thr Leu Ala Asn lie Arg Leu Asp Ser
385 390 395
gtt tct etc agg atg caa caa gat ttg atg agg teg agg tta gac act 1309 Val Ser Leu Arg Met Gin Gin Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr
400 405 410
gaa gta gcc aac tta tea gtg att atg gaa gaa atg aag eta gta gac 1357 Glu Val Ala Asn Leu Ser Val lie Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp
415 420 425
tec aag cat ggt cag etc ate aag aat ttt aca ata eta caa ggt cca 1405 Ser Lys His Gly Gin Leu lie Lys Asn Phe Thr lie Leu Gin Gly Pro430435440
ccgggccccaggggtCC3ggtgac卿teccagggaccccct1453
ProGlyProArgGlyProArgGlyAspArgGlySerGinGlyProPro
445450455460
ggcCC3actggc犯cggacagaaaggagag卿gggcctgga1501
GlyProThrGlyAsnLysGlyGinLysGlyGluLysGlyGluProGly
465470475
CC3cctggccctgcgggtgsg聊ggcCC3attggsCC3getggtccc1549
ProProGlyProAlaGlyGluArgGlyProlieGlyProAlaGlyPro
480485490
ccccgtggcggcaaaggatctaaaggctecC3gggccccaaa1597
ProGlyGluArgGlyGlyLysGlySerLysGlySerGinGlyProLys
495500505
ggcteccgtggtteccctggg犯gcccggccctCElgggccccagtggg1645
GlySerArgGlySerProGlyLysProGlyProGinGlyProSerGly
510515520
gacggccccccgggcccaggcaaagagggaetccccggccct1693
AspProGlyProProGlyProProGlyLysGluGlyLeuProGlyPro
525530535540
ggccctcctggcttcC3gg卵cttcagggc8CCgttggggagcct1741
GinGlyProProGlyPheGinGlyLeuGinGlyThrValGlyGluPro
545550555
ggggtgcctggaccteggggactgccaggcttgcctgggggc1789
GlyValProGlyProArgGlyLeuProGlyLeuProGlyValProGly
560565570
ggcccc卿ggcccccccggccctcctggcCC3teagcg1837
MetProGlyProLysGlyProProGlyProProGlyProSerGlyAla
575580585
gtggtgcccctggccctgC3gaatg邓3CCccgccggaggac1885
ValValProLeuAlaLeuGinAsnGluProThrProAlaProGluAsp
590595600
aatggctgcccgcctC3Ctgg朋gttcgsc3肌tgctactat1933
AsnGlyCysProProHisTrpLysAsnPheThrAspLysCysTyrTyr
605610615620
tttteagttgagaaag肌atttttgaggatgcaaagcttttctgtgaa1981
PheSerValGluLysGluliePheGluAspAlaLysLeuPheCysGlu
625630635
aagtctteacatcttgttttcact卿gaggeiacagc幼2029
AspLysSerSerHisLeuValPhelieAsnThrArgGluGluGinGin
640645650
tggaaaaaaC3ggtagggagagagcactggateggcetc2077
TrplieLysLysGinMetValGlyArgGluSerHisTrplieGlyLeu
655660665
gacteagagcgtgsa33ttgg朋gtggctggeitgggtct2125
ThrAspSerGluArgGluAsnGluTrpLysTrpLeuAspGlyThrSer
670675680
CC3gactacaaaaattggaaagetggacagccgtggggtcat2173
ProAspTyrLysAsnTrpLysAlaGlyGinProAspAsnTrpGlyHis
685690695700
ggccatgggcca_ggagaagactgtgetgggttgatttatgetgggcag2221
GlyHisGlyProGlyGluAspCysAlaGlyLeulieTyrAlaGlyGin
705 710 715tgg aac gat ttc caa tgt gaa gac gtc aat aac ttc att tgc gaa aaa Trp Asn Asp Phe Gin Cys Glu Asp Val Asn Asn Phe lie Cys Glu Lys
720 725 730
gac agg gag aca gta ctg tea tct gca tta t肌cggactg tgatgggatc Asp Arg Glu Thr Val Leu Ser Ser Ala Leu
735 740 acatgagcaa attttcagct ctcaaaggca aaggacactc ctttctaatt gcatcacctt ctcatcagat tgaa肌肪aa aaaagcactg肌aacca3tt actg肪aaaa aattgscagc tagtgttttt taccatccgt cattacccaa agacttggga actaaaatgt tccccagggt gatatgetga ttttcattgt gcacatggac tgaatcacat agattctcct ccgtcagtaa ccgtgcgatt atacaaatta tgtcttccaa agtatggaac actccaatca gaaaaaggtt atcatcccg
<210> 2 <211> 742 <212> PRT
<213>智人(Homo Sapiens) <220〉
〈223〉从核苷酸序列推导出的新型人清除蛋白受体的氨基酸序列. 〈400> 2
Met Lys A印Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gin Ser Phe Gly Tyr
15 10 15
Lys Arg Phe Gly lie Gin Glu Gly Thr Gin Cys Thr Lys Cys Lys Asn
20 25 30
Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser lie lie Leu Leu Tyr lie Leu Cys Ala
35 40 45
Leu Leu Thr lie Thr Val Ala lie Leu Gly Tyr Lys Val Val Glu Lys
50 55 60
Met Asp Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Thr Ser Arg Gin Thr Tyr Asp 65 70 75 80
Asp Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Asp Gin
85 90 95
Thr Gly Lys Lys Ala lie Ser Thr Asn Ser Glu Leu Ser Thr Phe Arg
100 105 110
Ser Asp lie Leu Asp Leu Arg Gin Gin Leu Arg Glu lie Thr Glu Lys
115 120 125
Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gin Ala Ser Gly Asp
130 135 140
Ala Leu Val Asp Arg Gin Ser Gin Leu Lys Glu Thr Leu Glu Asn Asn 145 150 155 160
Ser Phe Leu lie Thr Thr Val Asn Lys Thr Leu Gin Ala Tyr Asn Gly
165 170 175
Tyr Val Thr Asn Leu Gin Gin Asp Thr Ser Val Leu Gin Gly Asn Leu
180 185 l卯
Gin Asn Gin Met Tyr Ser His Asn Val Val lie Met Asn Leu Asn Asn
195 200 205
Leu Asn Leu Thr Gin Val Gin Gin Arg Asn Leu lie Thr Asn Leu Gin
210 215 220
Arg Ser Val Asp Asp Thr Ser Gin Ala lie Gin Arg lie Lys Asn Asp 225 230 235 240
2269
2319
2379 2439 2499 2559 2619 2628<formula>formula see original document page 42</formula>Gin Met Arg Glu
Asn Trp 690 Gly Glu 705
Gin Cys
Val
Asn 675 Lys
Asp Glu Val Leu Ser
Gly 660 Glu
Ala
Cys
Asp
Ser 740
Arg
Trp
Gly
Ala
Val 725 Ala
Glu
Lys
Gin
Gly 710 Asn
Leu
Ser
Trp
Pro 695 Leu
Asn
His Trp 665 Leu Asp 680
Asp Asn lie Tyr Phe lie
lie
Gly
Trp
Ala
Cys 730
Gly
Thr
Gly
Gly 715 Glu
Leu
Ser
His 700 Gin
Lys
Thr
Pro 685 Gly
Trp
Asp
Asp 670 Asp
His
Asn
Arg
Ser
Tyr
Gly
Asp
Glu 735
Glu
Lys
Pro
Phe 720 Thr
<210〉 3 <211> 2637 <212> DNA
〈213〉小鼠(Mus musculus)
〈220〉
〈221> CDS
〈222〉 (92). . (2317)
<400> 3
gacgctagga ctggaacgct gaaggctgcc atgggcgtgc agtgagagac actggtacga 60 cttctccggg cggagcgtgt cctcagtcac c atg aaa gac gac ttt gca gag 112
Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu 1 5
gaa gag gag gtg cag tec ttc ggt tac aag agg ttt ggt att cag gag 160 Glu Glu Glu Val Gin Ser Phe Gly Tyr Lys Arg Phe Gly lie Gin Glu
10 15 20
ggg aca cag tgt acc aaa tgt aaa aat aac tgg gca ctg aag ttt teg 208 Gly Thr Gin Cys Thr Lys Cys Lys Asn Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser
25 30 35
att gta tta tta tac att ctg tgt gcc tta ctg acc ate aca gta gcc 256 lie Val Leu Leu Tyr lie Leu Cys Ala Leu Leu Thr lie Thr Val Ala 40 45 50 55
att ttg gga tat aaa gtt gta gag aaa atg gac aat gtc aca gat ggc 304 lie Leu Gly Tyr Lys Val Val Glu Lys Met Asp Asn Val Thr Asp Gly
60 65 70
atg gag aca tct cac cag act tat gac aac aaa etc act get gtg gaa 352 Met Glu Thr Ser His Gin Thr Tyr Asp Asn Lys Leu Thr Ala Val Glu
75 80 85
agt gac ctg aag aaa tta ggg gat caa get ggg aag aaa get eta agt 400 Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Asp Gin Ala Gly Lys Lys Ala Leu Ser
90 95 100
acc aac tct gag ctt tct acc ttc aga tea gat att ctg gat etc cgt 448 Thr Asn Ser Glu Leu Ser Thr Phe Arg Ser Asp lie Leu Asp Leu Arg
105 110 115
caa caa ctt cag gag ate aca gaa aaa acc age aag aac aaa gat acg 496 Gin Gin Leu Gin Glu lie Thr Glu Lys Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr 120 125 130 135
ctg gag aag ttg caa gca aat ggg gac tea ttg gtt gat agg cag agt 544Leu Glu Lys Leu Gin Ala Asn Gly Asp Ser Leu Val Asp Arg Gin Ser
140 145 150
cag ctg aag gaa act ctg cag aat aat tct ttc etc att acc acc gtc 592 Gin Leu Lys Glu Thr Gin Asn Asn Ser Phe Uu lie Thr Thr Val
155 160 165
aac aaa aca etc cag gca tat aat ggc tat gtc aca aat ctg caa caa 640 Asn Lys Thr Leu Gin Ala Tyr Asn Gly Tyr Val Thr Asn Leu Gin Gin
170 175 180
gat act agt gtg etc cag ggc aa_t ctg cag age caa atg tat tct cag 688 Asp Thr Ser Val Leu Gin Gly Asn Leu Gin Ser Gin Met Tyr Ser Gin
185 190 195
age gtg gtt ate atg aac etc aac aac ctg aac eta acc cag gtt cag 736 Ser Val Val lie Met Asn Leu Asn Asn Leu Asn Leu Thr Gin Val Gin 200 205 210 215
cag agg aac ctt ate tea aat ctg cag cag tct gtg gat gac aca age 784 Gin Arg Asn Leu lie Ser Asn Leu Gin Gin Ser Val Asp Asp Thr Ser
220 225 230
ctg gcc ate cag cga att aag aat gat ttc caa aat ctg cag cag gtt 832 Leu Ala lie Gin Arg lie Lys Asn Asp Phe Gin Asn Leu Gin Gin Val
235 240 245
ttc ctt caa gcc aag犯g gac acc ga_t tgg eta aag gaa aaa gta cag 880 Phe Leu Gin Ala Lys Lys Asp Thr Asp Trp Leu Lys Glu Lys Val Gin
250 255 260
age ttg cag aca ttg get gcc aac aac tct gcc ctg gcc aaa gcc aac 928 Ser Leu Gin Thr Leu Ala Ala Asn Asn Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn
265 270 275
￡ta_t gac acc eta gag gat atg aat age cag etc age tea ttc aca ggt 976 Asn Asp Thr Leu Glu Asp Met Asn Ser Gin Leu Ser Ser Phe Thr Gly 280 285 290 295
cag atg gac aac att acc act ate tea cag gcc aac gag cag age ctg 1024 Gin Met Asp Asn lie Thr Thr lie Ser Gin Ala Asn Glu Gin Ser Leu
300 305 310
aaa gac ctt cag gac tta cac aag gat aca gaa aat aga aca get gtc 1072 Lys Asp Leu Gin Asp Leu His Lys Asp Thr Glu Asn Arg Thr Ala Val
315 320 325
aag ttc age caa ctt gag gaa cgc ttc cag gtc ttt gag aca gat att 1120 Lys Phe Ser Gin Leu Glu Glu Arg Phe Gin Val Phe Glu Thr Asp lie
330 335 340
gtg aac ate att age aac ate age tac aca gcc cat cac ctg agg aca 1168 Val Asn lie lie Ser Asn lie Ser Tyr Thr Ala His His Leu Arg Thr
345 350 355
ctg acc age aat ctg aat gat gtt agg acc aca tgc aca gac eicc ttg 1216 Leu Thr Ser Asn Leu Asn Asp Val Arg Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu 360 365 370 375
acc aga cac acg gat gac ctg acc tec ttg aat aac aca eta gtc aac 1264 Thr Arg His Thr Asp Asp Leu Thr Ser Leu Asn Asn Thr Leu Val Asn
380 385 390
ate cgc ttg gat tct att tct etc agg atg cag caa gac atg atg a_gg 1312 lie Arg Leu Asp Ser lie Ser Leu Arg Met Gin Gin Asp Met Met Arg
395 400 405
tea aag tta gac act gaa gtg gcc aac tta tea gtg gtt atg gaa gag 1360 Ser Lys Leu Asp Thr Glu Val Ala Asn Leu Ser Val Val Met Glu Glu410 415 420
atg aaa ctg gtt gac tec aag cac ggt cag etc ate aag aac ttt acc 1408 Met Lys Leu Val Asp Ser Lys His Gly Gin Leu lie Lys Asn Phe Thr
425 430 435
att eta caa ggt cct cct ggc ccc aga ggt cca aaa ggt gac aga gga 1456 lie Leu Gin Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly 440 445 450 455
tct cag gga cca cct ggt cca act ggc aac aag gga cag aaa gga gag 1504 Ser Gin Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Asn Lys Gly Gin Lys Gly Glu
460 465 470
aag gga gag cct ggt cca cct ggc cct gcg ggt gag agg ggc aca att 1552 Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Thr lie
475 480 485
gga cca gtc ggc cct cct gga gag cgt ggc age aaa gga tec aaa ggc 1600 Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly
490 495 500
tea csg ggt ccc犯a gga tct cgt ggg tec cca ggg aag cct ggc cct 1648 Ser Gin Gly Pro Lys Gly Ser Arg Gly Ser Pro Gly Lys Pro Gly Pro
505 510 515
caa gga cct agt ggg gac cca gga cca cca ggt cca cca ggc aag gat 1696 Gin Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp 520 525 530 535
gga etc cct ggc cct cag ggc cct cct ggc ttc cag gga eta cag ggc 1744 Gly Leu Pro Gly Pro Gin Gly Pro Pro Gly Phe Gin Gly Leu Gin Gly
540 545 550
act gtg ggt gag cct gga gta cct gga cct egg ggg ttg cca ggc ttg 1792 Thr Val Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu
555 560 565
cca ggg gtg cca ggc atg cct ggg cct aag gga cca cct ggc cct cca 1840 Pro Gly Val Pro Gly Met Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro
570 575 580
ggc ccc tea gga gca atg gag cca ttg get ctg cag aat gaa cca acc 1888 Gly Pro Ser Gly Ala Met Glu Pro Leu Ala Leu Gin Asn Glu Pro Thr
585 590 595
cca gca tea gag gtc aac gga tgt ccg cct cac tgg aag aac ttc aca 1936 Pro Ala Ser Glu Val Asn Gly Cys Pro Pro His Trp Lys Asn Phe Thr 600 605 610 615
gat aaa tgc tac tat ttt tea ttg gaa aaa gaa att ttt gaa gat get 1984 Asp Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Leu Glu Lys Glu lie Phe Glu Asp Ala
620 625 630
aag ctt ttc tgt gaa gac aaa tct tec cat etc gtt ttc ata aac tea 2032 Lys Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser His Leu Val Phe lie Asn Ser
635 640 645
sga gaa gaa csg caa tgg eita肪a sag cat acc gtg ggg sga gas age 2080 Arg Glu Glu Gin Gin Trp lie Lys Lys His Thr Val Gly Arg Glu Ser
650 655 660
cat tgg ate ggc etc aca gac tea gaa cag gaa age gaa tgg aag tgg 2128 His Trp lie Gly Leu Thr Asp Ser Glu Gin Glu Ser Glu Trp Lys Trp
665 670 675
eta gac ggg tea cct gtt gat tetc aaa aac tgg aaa get gga caa cca 2176 Leu Asp Gly Ser Pro Val Asp Tyr Lys Asn Trp Lys Ala Gly Gin Pro 680 685 690 695gat aac tgg ggc agt ggc cat ggg cca gga gaa Asp Asn Trp Gly Ser Gly His Gly Pro Gly Glu
700 705 att tac gca gga cag tgg aat gac ttc cag tgt lie Tyr Ala Gly Gin Trp Asn Asp Phe Gin Cys
715 720 ttc att tgt gag aag gaa agg gag gca gta cca Phe lie Cys Glu Lys Glu Arg Glu Ala Val Pro
730 735 taacagcatg atataatagc agaaacatat tttctgatgc tcgtttttga ttccatcact tctcaccaga ttgaatggaa ttcaaaataa atggacacct actgcacaat aacccaagga cccaagttga tatattgatt tccagtgtac aaatggactg ccattaacca tagaatttat gcaaagtata tctttccaaa
<210〉 4 <211> 742 <212> PRT
〈213〉小鼠(Mus musculus)
<220>
<223〉从核苷酸序列推导出的新型人清除蛋白受体的氨基酸序列.
gac tgt get ggc ttg 2224 Asp Cys Ala Gly Leu 710
gat gaa ate aat aac 2272 Asp Glu lie Asn Asn 725
tea tec ata tta 2317 Ser Ser lie Leu 740
ctctgaaagc egaagaatge 2377 aaagctctga aaagtagtta 2437 ctagggggct aaaatgetec 2497 aategcatag attttctcag 2557 tatggaatgc tccaatcaga 2617
2637
<400> 4 Met Lys 1
Lys
Asn
Leu
Met 65 Asn
Ala
Ser
Thr
Ser 145 Ser
Tyr
Gin
Leu
Arg
Trp
Leu 50 Asp
Lys
Gly
Asp
Ser 130 Leu
Phe
Val
Ser
Asn
Asp
Phe
Ala 35 Thr
Asn
I>eu
Lys
lie 115 Lys
Val
Leu
Thr
Gin 195 Leu
Asp
Gly 20 Leu
lie
Val
Thr
Lys 100 Leu
Asn
Asp
lie
Asn 180 Met
Thr
Phe 5
lie
Lys
Thr
Thr
Ala 85 Ala
Asp
Lys
Arg
Thr 165 Leu
Tyr
Gin
Ala
Gin
Phe
Val
Asp 70 Val
Leu
Leu
Asp
Gin 150 Thr
Gin
Ser
Val
Glu
Glu
Ser
Ala 55 Gly
Glu
Ser
Arg
Thr 135 Ser
Val
Gin
Gin
Gin
Glu
Gly
lie 40 lie
Met
Ser
Thr
Gin 120 Leu
Gin
Asn
Asp
Ser 200 Gin
Glu
Thr 25 Val
Leu
Glu
Asp
Asn 105 Gin
Glu
Leu
Lys
Thr 185 Val
Glu 10 Gin
Leu
Gly
Thr
Leu 90 Ser
Leu
Lys
Lys
Thr 170 Ser
Val Arg Asn
Val
Cys
Leu
Tyr
Ser 75 Lys
Glu
Gin
Leu
Glu 155 Leu
Val
lie
Leu
Gin
Thr
Tyr
Lys
60
His
Lys
Leu
Glu
Gin 140 Thr
Gin
Leu
Met
lie
Ser
Lys
lie 45 Val
Gin
Leu
Ser
lie 125 Ala
Leu
Ala
Gin
Asn 205 Ser
Phe
Cys 30 Leu
Val
Thr
Gly
Thr 110 Thr
Asn
Gin
Tyr
Gly 190 Leu
Asn
Gly 15 Lys
Cys
Glu
Tyr
Asp 95 Phe
Glu
Gly
Asn
Asn 175 Asn
Asn
Leu
Tyr
Asn
Ala
Lys
Asp 80 Gin
Arg
Lys
Asp
Asn 160 Gly
Leu
Asn
GinGin 225 Phe
Trp
Ser
Gin
Gin 305 Thr
Gin
Thr
Thr
Ceu 385 Met
Leu
Gin
Gly
Asn 465 Ala
Gly
Ser
Pro
Gly 545 Pro
Lys
Ala
Pro
Lys
210 Ser
Gin
Leu
Ala
Leu 290 Ala
Glu
Val
Ala
Thr 370 Asn
Gin
Ser
Leu
Pro 450 Lys
Gly
Ser
Pro
Gly 530 Phe
Arg
Gly
Leu
His 610 Glu
Val
Asn
Lys
Leu 275 Ser
Asn
Asn
Phe
His 355 Cys
Asn
Gin
Val
lie 435 Lys
Gly
Glu
Lys
Gly 515 Pro
Gin
Gly
Pro
Gin 595 Trp
lie
Asp
Leu
Glu 260 Ala
Ser
Glu
Arg
Glu 340 His
Thr
Thr
Asp
Val 420 Lys
Gly
Gin
Arg
Gly 500 Lys
Pro
Gly
Leu
Pro 580 Asn
Lys
Phe
Asp
Gin 245 Lys
!>ys
Phe
Gin
Thr 325 Thr
Leu
Asp
Leu
Met 405 Met
Asn
Asp
Lys
Gly 485 Ser
Pro
Gly
Leu
Pro 565 Gly
Glu
Asn
Glu
Thr 230 Gin
Val
Ala
Thr
Ser 310 Ala
Asp
Arg
Thr
Val 390 Met
Glu
Phe
Arg
Gly 470 Thr
Lys
Gly
Lys
Gin 550 Gly
Pro
Pro
Phe
Asp
215 Ser
Val
Gin
Asn
Gly 295 Leu
Val
lie
Thr
Leu 375 Asn
Arg
Glu
Thr
Gly 455 Glu
lie
Gly
Pro
Asp 535 Gly
Leu
Pro
Thr
Thr 615 Ala
Leu
Phe
Ser
Asn 280 Gin
Lys
Lys
Val
Leu 360 Thr
lie
Ser
Met
lie 440 Ser
Lys
Gly
Ser
Gin 520 Gly
Thr
Pro
Gly
Pro 600 Asp
Lys
Ala
Leu
Leu 265 Asp
Met
Asp
Phe
Asn 345 Thr
Arg
Arg
Lys
Lys 425 Leu
Gin
Gly
Pro
Gin 505 Gly
Leu
Val
Gly
Pro 585 Ala
Lys
Leu
lie
Gin 250 Gin
Thr
Asp
Leu
Ser 330 lie
Ser
His
Leu
Leu 410 Ceu
Gin
Gly
Glu
Val 490 Gly
Pro
Pro
Gly
Val 570 Ser
Ser
Cys
Phe
Gin 235 Ala
Thr
Leu
Asn
Gin 315 Gin
lie
Asn
Thr
Asp 395 Asp
Val
Gly
Pro
Pro 475 Gly
Pro
Ser
Gly
Glu 555 Pro
Gly
Glu
Tyr
Cys
220 Arg
Lys
Leu
Glu
lie 300 Asp
Leu
Ser
Leu
Asp 380 Ser
Thr
Asp
Pro
Pro 460 Gly
Pro
Lys
Gly
Pro 540 Pro
Gly
Ala
Val
Tyr 620 Glu
lie
Lys
Ala
Asp 285 Thr
Leu
Glu
Asn
Asn 365 Asp
lie
Glu
Ser
Pro 445 Gly
Pro
Pro
Gly
Asp 525 Gin
Gly
Met
Met
Asn 605 Phe
Asp
Lys
Asp
Ala 270 Met
Thr
His
Glu
lie 350 Asp
Leu
Ser
Val
Lys 430 Gly
Pro
Pro
Gly
Ser 510 Pro
Gly
Val
Pro
Glu 590 Gly
Ser
Lys
Asn Asp 240 Thr Asp 255
Asn Asn
Asn Ser
lie Ser
Lys Asp 320 Arg Phe 335
Ser Tyr
Val Arg
Thr Ser
Leu Arg 400 Ala Asn 415
His Gly
Pro Arg
Thr Gly
Gly Pro 480 Glu Arg 495
Arg Gly
Gly Pro
Pro Pro
Pro Gly 560 Gly Pro 575
Pro Leu Cys Pro Leu Glu Ser Ser625 630 635 640
His Leu Val Phe lie Asn Ser Arg Glu Glu Gin Gin Trp lie Lys Lys
645 650 655
His Thr Val Gly Arg Glu Ser His Trp lie Gly Leu Thr Asp Ser Glu
660 665 670
Gin Glu Ser Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Ser Pro Val Asp Tyr Lys
675 680 685
Asn Trp Lys Ala Gly Gin Pro Asp Asn Trp Gly Ser Gly His Gly Pro
690 695 700
Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu lie Tyr Ala Gly Gin Trp Asn Asp Phe 705 710 715 720
Gin Cys Asp Glu lie Asn Asn Phe lie Cys Glu Lys Glu Arg Glu Ala
725 730 735
Val Pro Ser Ser lie Leu 740
〈210> 5 〈211> 27 <212> PRT <213>人工序列
〈220〉
<223>迄今报道的三个共同凝集素的共有序列. <400> 5
Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gin Trp Asn Asp Val Pro
15 10 15
Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe 20 25
<210> 6 <211> 27 <212〉 PRT <213>人工序列
<220〉
〈223>可与新的共同凝集素杂交的修饰的共同凝集素的共有序列. <400> 6
Glu Lys Cys Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Lys Trp Asn Asp Arg Asn
15 10 15
Cys Leu Gin Ser Arg Leu Ala lie Cys Glu Phe 20 25
<210〉 7 <211> 24 <212〉醒 <213>人工序列
<220〉
<223>用于测序的M13通用引物序列. <400> 7cgacgttgta aaacgacggc cagt 24
<210〉 8 <211> 17 <212〉 DNA <213>人工序列
〈220>
<223>用于测序的M13反向引物序列. <400> 8
caggaaaca gctatgac 17
<210> 9 <211〉 21 <212>腿 <213>人工序列
<220>
<223〉用于筛选新的共同凝集素的反向引物的序列. <400> 9
caatctgatg agaaggtgat g 21
<210> 10
<211> 21
〈212> DNA 〈213>人工序列
〈220>
〈223>用于筛选新的共同凝集素的正向引物的序列.
<400〉 10
acgaggggct gga/tgggaca t
〈210〉 11
<211> 24
<212> DNA <213〉人工序列
<220>
<223>用于测序的人gtll反向引物的序列. <400> 11
ttgacaccag accaactggt aatg
21
24
<210〉 12 <211〉 24 <212> DNA <213>人工序列
<220>〈223>用于测序的入gtll正向引物的序列. <400> 12
ggtggcgacg actcctggag cccg 24
<210〉 13 <211〉 21 〈212〉 ■ 〈213〉人工序列
<220>
<223>用于筛选新的共同凝集素的引物的序列. <■〉 13
cgtgaaaatg aatggaagtg g 21
<210> 14 <211> 21 〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223>用于筛选新的共同凝集素的引物的序列. <400〉 14
ttttatccat tgctgttcct c 21
<210> 15 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223>用于筛选新的共同凝集素的引物的序列. <400> 15
ctggcagtcc ccgaggtcca g 21
<210〉 16 〈211〉 21 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>用于筛选新的共同凝集素的引物的序列. <400〉 16
gctggtcccc ccggagagcg t 21
<210> 17 <211> 21 <212>腿<213>人工序列 〈220〉
<223〉用于Cap位点测序的1RC2引物的序列. <400> 17
caaggtacgc cacagcgtat g 21
<210〉 18 <211〉 20 <212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<223>用于Cap位点测序的合成的TGP1引物的序列. 〈400〉 18
tcttcagttt ccctaatccc 20
〈210> 19
<211> 21
<212> DNA 〈213〉人工序列
<220>
<223>用于Cap位点测序的2RC2引物的序列. 〈400〉 19
gtacgccaca gcgtatgatg c 21
〈210〉 20 <211〉 21 <212> DNA <213>人工序列
〈220>
〈223〉用于Cap位点测序的合成的TGP2引物的序列. <400> 20
cattcttgac aaacttcata g 21
〈210〉 21 <211〉 21 〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223>引物序列. <400> 21
atcttgctgc agattcgtga c 21<210〉 22 <211〉 15 <212〉腿 <213>人工序列
〈220〉
<223> Xgtll 5'测序引物的序列. 〈400〉 22
gactcctgga gcccg 15
〈210〉 23 <211> 2262 <212>腿
<213〉智人(Homo Sapiens)
〈220> <221> CDS
<222> (74).. (1933) 〈400〉 23
ggggggacga cttcctcggc tgcgcggcgc tcgcgcggag ctccccggcc ggcggtgcgt 60 ccccacggtc acc atg aaa gac gac ttc gca gag gag gag gag gtg caa 109 Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gin 1 5 10
tec ttc ggt tac aag egg ttt ggt att cag gaa gga aca caa tgt acc 157 Ser Phe Gly Tyr Lys Arg Phe Gly lie Gin Glu Gly Thr Gin Cys Thr
15 20 25
aaa tgt aaa aat aac tgg gca ctg aag ttt tct ate ata tta tta tac 205 Lys Cys Lys Asn Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser lie lie Leu Leu Tyr
30 35 40
att ttg tgt gcc ttg eta aca ate aca gta gcc att ttg gga tat aaa 253 lie Leu Cys Ala Leu Leu Thr lie Thr Val Ala lie Leu Gly Tyr Lys 45 50 55 60
gtt gta gag aaa atg gac aat gtc aca ggt ggc atg gaa aca tct cgc 301 Val Val Glu Lys Met Asp Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Thr Ser Arg
65 70 75
caa acc tat gat gac aag etc aca gca gtg gaa agt gac ctg aaa aaa 349 Gin Thr Tyr Asp Asp Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys
80 85 90
tta ggt gac caa act ggg aag aaa get ate age acc aac tea gaa etc 397 Leu Gly Asp Gin Thr Gly Lys Lys Ala lie Ser Thr Asn Ser Glu Leu
95 100 105
tec acc ttc aga tea gac att eta gat etc cgt cag caa ctt cgt gag 445 Ser Thr Phe Arg Ser Asp lie Leu Asp Leu Arg Gin Gin Leu Arg Glu
110 115 120
att aca gaa aaa acc age aag aac aag gat acg ctg gag aag tta cag 493 lie Thr Glu Lys Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gin 125 130 135 140
gcg age ggg gat get ctg gtg gac agg cag agt caa ttg aaa gaa act 541 Ala Ser Gly Asp Ala Leu Val Asp Arg Gin Ser Gin Leu Lys Glu Thr145 150 155
ttg gag aat aac tct ttc etc ate acc act gta犯c aaa acc etc cag 589 Leu Glu Asn Asn Ser Phe Leu lie Thr Thr Val Asn Lys Thr Leu Gin
160 165 170
gcg tat aat ggc tat gtc acg aat ctg cag caa gat acc age gtg etc 637 Ala Tyr Asn Gly Tyr Val Thr Asn Leu Gin Gin Asp Thr Ser Val Leu
175 180 185
cag ggc aat ctg cag犯c caa atg tat tct cat aat gtg gtc ate atg 685 Gin Gly Asn Leu Gin Asn Gin Met Tyr Ser His Asn Val Val lie Met
190 195 200
aac etc aac aac ctg aac ctg acc cag gtg cag cag agg aac etc ate 733 Asn Leu Asn Asn Leu Asn Leu Thr Gin Val Gin Gin Arg Asn Leu lie 205 210 215 220
acg fiat ctg cag egg tct gtg gat gac aca age cag get ate cag cga 781 Thr Asn Leu Gin Arg Ser Val Asp Asp Thr Ser Gin Ala lie Gin Arg
225 230 235
ate aag aac gac ttt caa aat ctg cag cag gtt ttt ctt caa gcc aag 829 lie Lys Asn Asp Phe Gin Asn Leu Gin Gin Val Phe Leu Gin Ala Lys
240 245 250
aag gac acg gat tgg ctg aag gag aaa gtg cag age ttg cag acg ctg 877 Lys Asp Thr Asp Trp Leu Lys Glu Lys Val Gin Ser Leu Gin Thr Leu
255 260 265
get gcc aac aac tct gcg ttg gcc aaa gcc aac犯c gac acc ctg gag 925 Ala Ala Asn Asn Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu
270 275 280
gat atg aac age cag etc a_a_c tea ttc aca ggt cag atg gag肌c ate 973 Asp Met Asn Ser Gin Leu Asn Ser Phe Thr Gly Gin Met Glu Asn lie 285 290 295 300
acc act ate tct caa gcc aac gag cag aac ctg aaa gac ctg cag gac 1021 Thr Thr lie Ser Gin Ala Asn Glu Gin Asn Leu Lys Asp Leu Gin Asp
305 310 315
tta cac aaa gat gca gag aat aga aca gcc ate aag ttc aac caa ctg 1069 Leu His Lys Asp Ala Glu Asn Arg Thr Ala lie Lys Phe Asn Gin Leu
320 325 330
gag gaa cgc ttc cag etc ttt gag acg gat att gtg aac ate att age 1117 Glu Glu Arg Phe Gin Leu Phe Glu Thr Asp lie Val Asn lie lie Ser
335 340 345
aat ate agt tac aca gcc cac cac ctg egg acg ctg acc age aat eta 1165 Asn lie Ser Tyr Thr Ala His His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu
350 355 360
aat gaa gtc agg acc act tgc aca gat acc ctt acc aaa cac aca gat 1213 Asn Glu Val Arg Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp 365 370 375 380
gat ctg acc tec ttg aat aat acc ctg gcc aac ate cgt ttg gat tct 1261 Asp Leu Thr Ser Leu Asn Asn Thr Leu Ala Asn lie Arg Leu Asp Ser
385 390 395
gtt tct etc agg atg caa caa gat ttg atg agg teg agg tta gac act 1309 Val Ser Leu Arg Met Gin Gin Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr
400 405 410
gaa gta gcc aac tta tea gtg att atg gaa gaa atg aeig eta gta gac 1357 Glu Val Ala Asn Leu Ser Val lie Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp 415 420 425tec aag cat ggt cag etc ate aag a_at ttt aca ata eta caa ggt cca 1405 Ser Lys His Gly Gin Leu lie Lys Asn Phe Thr lie Leu Gin Gly Pro
430 435 440
ccg ggc ccc agg ggt cca aga ggt gac aga gga tec cag gga ccc cct 1453 Pro Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Asp Arg Gly Ser Gin Gly Pro Pro 445 450 455 460
ggc cca act ggc aac aag gga cag aaa gga gag犯g ggg gag cct gga 1501 Gly Pro Thr Gly Asn Lys Gly Gin Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly
465 470 475
cca cct ggc cct gcg ggc tgc ccg cct cac tgg aag aac ttc aca gac 1549 Pro Pro Gly Pro Ala Gly Cys Pro Pro His Trp Lys Asn Phe Thr Asp
480 485 490
aaa tgc tac tat ttt tea gtt gag aaa gaa att ttt gag gat gca肌g 1597 Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Val Glu Lys Glu lie Phe Glu Asp Ala Lys
495 500 505
ctt ttc tgt g肌gac aag tct tea cat ctt gtt ttc ata aac act aga 1645 Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser His Leu Val Phe lie Asn Thr Arg
510 515 520
gag gaa c恥c肌tgg ata犯a aaa cag atg gts ggg aga gag age cac 1693 Glu Glu Gin Gin Trp lie Lys Lys Gin Met Val Gly Arg Glu Ser His 525 530 535 540
tgg ate ggc etc aca gac tea gag cgt gaa aat gaa tgg aa_g tgg ctg 1741 Trp lie Gly Leu Thr Asp Ser Glu Arg Glu Asn Glu Trp Lys Trp Leu
545 550 555
gat ggg aca tct cca gac tac aaa aat tgg aaa get gga_ cag ccg gat 1789 Asp Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Lys Asn Trp Lys Ala Gly Gin Pro Asp
560 565 570
aac tgg ggt cat ggc cat ggg cca gga gaa gac tgt get ggg ttg att 1837 Asn Trp Gly His Gly His Gly Pro Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu lie
575 580 585
tat get ggg cag tgg aac gat ttc caa tgt gaa gac gtc aat aac ttc 1885 Tyr Ala Gly Gin Trp Asn Asp Phe Gin Cys Glu Asp Val Asn Asn Phe
590 595 600
a_tt tgc gaa aaa gac agg gag aca gta ctg tea tct gca tta 1933 lie Cys Glu Lys Asp Arg Glu Thr Val Leu Ser Ser Ala Leu 605 610 615
taacggactg tgatgggatc acatgagcaa attttceigct ctcaaaggca aaggacactc 1993 ctttctaatt gcatcacctt ctcatcagat tgaaaaaaaa a肌agcactg aaaaccaatt 2053 actgaaaaaa aattgacagc tagtgttttt taccatccgt cattacccaa agacttggga 2113 actaaaatgt tccccagggt gatatgetga ttttcattgt gcacatggac tgaatcacat 2173 agattctcct ccgtcagtaa ccgtgcgatt atacaiaatta tgtcttccaa agtatggaac 2233 actccaatca gaaaaaggtt atcatcccg 2262
〈210〉 24 <211〉 618 〈212〉 PRT
〈213〉智人(Homo Sapiens) 〈220>
〈223〉从核苷酸序列推导出的新的突变的人清除蛋白受体的氨基酸序列. 〈400〉 24Met 1
Lys
Asn
Leu
Met
65
Asp
Thr
Ser
Thr
Ala 145 Ser
Tyr
Gin
Leu
Arg 225 Phe
Trp
Ser
Gin
Gin 305 Ala
Gin
Thr
Thr
Leu 385 Met
L_ys
Arg
Trp
Ceu 50 Asp
Lys
Gly
Asp
Ser 130 Leu
Phe
Val
Asn
Asn 210 Ser
Gin
Leu
Ala
Leu 290 Ala
Glu
Leu
Ala
Thr 370 Asn
Gin
Asp
Phe
Ala 35 Thr
Asn
Leu
Lys
lie 115 Cys
Val
Leu
Thr
Gin 195 Leu
Val
Asn
Lys
Leu 275 Asn
Asn
Asn
Phe
His 355 Cys
Asn
Gin
Asp
Gly 20 Leu
lie
Val
Thr
Lys 100 Leu
Asn
Asp
lie
Asn 180 Met
Thr
Asp
Leu
Glu 260 Ala
Ser
Glu
Arg
Glu 340 His
Thr
Thr
Asp
Phe 5
lie
Lys
Thr
Thr
Ala 85 Ala
Asp
Lys
Arg
Thr 165 Leu
Tyr
Gin
Asp
Gin 245 Lys
Lys
Phe
Gin
Thr 325 Thr
Leu
Asp
Leu
Ala
Gin
Phe
Val
Gly 70 Val
lie
Leu
Asp
Gin 150 Thr
Gin
Ser
Val
Thr 230 Gin
Val
Ala
Thr
Asn 310 Ala
Asp
Arg
Thr
Ala 390 Leu Met 405
Glu
Glu
Ser
Ala 55 Gly
Glu
Ser
Arg
Thr 135 Ser
Val
Gin
His
Gin 215 Ser
Val
Gin
Asn
Gly 295 Leu
lie
lie
Thr
Leu 375 Asn
Arg
Glu
Gly
lie 40 lie
Met
Ser
Thr
Gin 120 Leu
Gin
Asn
Asp
Asn 200 Gin
Gin
Phe
Ser
Asn 280 Gin
Lys
Lys
Val
Leu 360 Thr
lie
Ser
Glu
Thr 25 lie
Leu
Glu
Asp
Asn 105 Gin
Glu
Leu
Lys
Thr 185 Val
Arg
Ala
Leu
Leu 265 Asp
Met
Asp
Phe
Asn 345 Thr
Lys
Arg
Arg
Glu 10 Gin
Leu
Gly
Thr
Leu 90 Ser
Leu
Lys
Lys
Thr 170
Ser
Val
Asn
lie
Gin 250 Gin
Thr
Glu
Leu
Asn 330 lie
Ser
His
Leu
Val
Cys
Leu
Tyr
Ser 75 Lys
Glu
Arg
Leu
Glu 155 Leu
Val
lie
Leu
Gin 235 Ala
Thr
Leu
Asn
Gin 315 Gin
lie
Asn
Thr
Asp 395 Leu Asp 410
Gin Thr
Tyr
Lys 60 Arg
Lys
Leu
Glu
Gin 140 Thr
Gin
Leu
Met
lie 220 Arg
Lys
Leu
Glu
lie 300 Asp
Leu
Ser
Leu
Asp 380 Ser
Thr
Ser
Lys
lie 45 Val
Gin
Leu
Ser
lie 125 Ala
Leu
Ala
Gin
Asn 205 Thr
lie
Lys
Ala
Asp 285 Thr
Leu
Glu
Asn
Asn 365 Asp
Val
Glu
Phe
Cys 30 Leu
Val
Thr
Gly
Thr 110 Thr
Ser
Glu
Tyr
Gly 190 Leu
Asn
Lys
Asp
Ala 270 Met
Thr
His
Glu
lie 350 Glu
Leu
Ser
Val
Gly 15 Lys
Cys
Glu
Tyr
Asp 95 Phe
Glu
Gly
Asn
Asn 175 Asn
Asn
Leu
Asn
Thr 255 Asn
Asn
lie
Lys
Arg 335 Ser
Val
Thr
Leu
Tyr
Asn
Ala
Lys
Asp 80 Gin
Arg
Lys
Asp
Asn 160 Gly
Leu
Asn
Gin
Asp 240 Asp
Asn
Ser
Ser
Asp 320 Phe
Tyr
Arg
Ser
Arg 400 Ala Asn 415Leu Gin
Gly
Asn 舰 Ala
Phe
Asp
Trp
Thr 545 Pro
Gly
Trp
Asp
Ser
Leu
Pro 450 Lys
Gly
Ser
Lys
lie 530 Asp
Asp 565 His
Asn
Arg 610
Val
lie 435 Arg
Gly
Cys
Val
Ser 515 Lys
Ser
Tyr
Gly
Asp 595 Glu
lie Met Glu Glu 420
Lys Asn Phe Thr
Gly Asp Arg Gly 455
Gin Lys Gly Glu 470
Pro Pro His Trp 485
Glu Lys Glu lie 500
Ser His Leu Val
Lys Gin Met Val 535
Glu Arg Glu Asn 550
Lys Asn Trp Lys 570
Pro Gly Glu Asp 580
Phe Gin Cys Glu
Thr Val Leu Ser 615
Met
lie 440 Ser
Lys
Lys
Phe
Phe 520 Gly
Glu
Ala
Cys
Asp 600 Ser
Lys 425 Leu
Gin
Gly
Asn
Glu 505 lie
Arg
Trp
Gly
Ala 585 Val
Ala
Leu Val Asp Ser Lys His Gly 430
Gin Gly Pro Pro Gly Pro Arg 445
Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly 460
Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro 475 480 Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr 490 495 Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu 510
Asn Thr Arg Glu Glu Gin Gin 525
Trp lie Gly Leu
Glu Ser His 540
Lys Trp Leu
555 Gin Pro Asp
Gly Leu lie
Asn Asn Phe
Leu
Asp Gly Thr Ser 560
Asn Trp Gly His 575
Tyr Ala Gly Gin 590
lie Cys Glu Cys 605
<210> <211> <212〉 <213>
25 30 DNA
人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增hSRCL-PI的引物序列. <400> 25
ccgctcgagc ggtcaccatg aaagacgact
<210> <211〉 <212〉 <213〉
26 30 DNA
人工序列
<220〉
<223>用于PCR扩增hSRCL-Pl的引物序列. <400〉 26
tccccgcggt aatgcagatg acagtactgt
<210〉 27 <211> 35 <212> DNA
30
30<213>人工序列 〈220〉
<223>用于PCR扩增hSRCL-Pl的引物序列. <400〉 27
aatgcggccg caccatgaaa gacgacttcg cagag 35
〈210〉 28 <211> 32 <212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
〈223>用于PCR扩增hSRCL-Pl的引物序列. 〈400> 28
gctctagacc gcggtaatgc agatgacagt ac 3权利要求
1.一种蛋白质，所述蛋白质由SEQ ID NO24所示氨基酸序列的氨基酸号1-618的618个氨基酸组成。
2. —种分离的多核苷酸，所述多核苷酸由SEQIDNO:23所示核苷酸序列中碱基 号74-1933的核苷酸序列组成。
3. —种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
4. 一种转化细胞，其特征在于，它携带了权利要求2所述的多核苷酸。
5. —种制备蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括培养用权利要求2所述的多 核苷酸转化的细胞，收获产生的hSRCL-Pl蛋白质的步骤。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其中所述细胞是大肠杆菌、动物细胞或昆虫 细胞。
7. —种药物筛选方法，其特征在于，该方法使用权利要求l所述的蛋白质。
8. —种药物筛选方法，该方法是以治疗与氧化LDL累积有关的病态为目的药物 的筛选方法，其特征在于，该方法包括，通过比较在候选药物有或无的条件下权利要 求1所述的蛋白质与氧化LDL的结合量来做出评价，当候选药物对该蛋白质与氧化 LDL的结合有阻碍能力，则鉴定出治疗与氧化LDL累积有关的病态的药物。
9. 一种药物筛选方法，该方法是治疗和细胞上结合AGE有关的病态的药物的 筛选方法，其特征在于，该方法包括，通过比较权利要求l所述的蛋白质在有或无候 选药物的情况下与AGE的结合量，做出评价，根据候选药物阻碍该蛋白质与AGE 结合的能力，鉴定出用于治疗与细胞上结合AGE有关的病态的药物。
全文摘要
本发明提供可能利用来阐明巨噬细胞和基础免疫的机能、阐明动脉硬化、糖尿病性合并症、血管形成后再狭窄、细菌感染症等的各种疾患的发病机制、及其诊断、预防和治疗方法、以及为此开发试药和医药的，具有SR构造和共同凝激素构造的新型清除蛋白受体、具有顺序号2、4或24的氨基酸顺序的蛋白质或具有和它们相同性质的蛋白质，或者，它们的衍生物或片段和含有编码这些蛋白的碱基顺序的分离的多核苷酸、和抗体、拮抗体等的关联分子。还公开了使用它们的治疗方法。
文档编号C12N15/12GK101319010SQ20081009527
公开日2008年12月10日 申请日期2001年2月8日 优先权日2000年2月14日
发明者若宫伸隆 申请人:扶桑药品工业株式会社