用于多聚核苷酸检测和定量的设备的制作方法

专利名称：用于多聚核苷酸检测和定量的设备的制作方法
用于多聚核苷酸检测和定量的设备
本申请是申请号为03817245.3之中国专利申请的分案申请，原申请03817245.3 是根据专利合作条约的国际申请(PCT/US03/19518)进入中国国家阶段的国家申请。 发明领域
本发明涉及用于检测和定量多聚核苷酸的自动化设备。
背景技术：
基因组的介入已经在加速药物发现的步伐方面起作用。基因组技术已经在发现 新的药物耙点方面证实了它们的价值。该领域的进一步改进将提供更有效的工具， 使更快、更节约成本地开发潜在的药物。
药物发现过程包括以下几个步骤鉴定与疾病相关的潜在生化靶点，筛选活性 化合物，并进一步化学设计，临床前测试，最后进行临床试验。该过程的效率仍离 完美相去甚远花费在研究和开发过程基金中的金钱估计约75%都是走向失败。另 外，产品开发中失败发生地越晚，与该项目相关的损失也就越大。因此，有必要早 期消除将会发生的失败，以大大节省整个药物开发过程的成本。这样，原始分子耙 点的质量就成为了节省成本的药物开发的决定性因素。
能够影响靶点鉴定和证实有效性的一个方法是绘制转录谱。该方法对特定条件 下的基因表达进行比较例如疾病细胞和正常细胞之间、对照细胞和药物处理细胞 之间或治疗响应细胞和治疗耐受细胞之间的基因表达。该方法产生的信息可以直接 鉴别治疗所靶向的特定基因，重要的是显示疾病和治疗中涉及的生化途径。简要地 说，绘制转录图谱不仅提供生化靶点，还同时提供评估这些靶点质量的方法。另外， 和基于细胞的筛选联用，绘制转录图谱将大大改变药物发现领域。使用表型变化作 为功能细胞系统的标记物来筛选潜在药物历来都是成功的。例如，监测培养物中肿 瘤细胞的生长来鉴定抗癌药物。同样，细菌的生存能力被用于针对鉴定抗生素化合 物的分析中。通常在不知道靶向生化途径的前提下进行这种筛选。事实上，鉴定到 的有效化合物揭示出这种途径，并指出真正的分子耙点，使随后的下一代药物的合 理设计能够进行。
可以使用绘制转录图谱的现代化工具来设计新的筛选方法，这些筛选方法将利 用基因表达代替表型变化来评价药物的有效性。例如，这些方法描述在美国专利 No.5,262,311; 5,665,547; 5,599,672; 5,580,726; 6,045,988和5,994,076;以及Luehrsen et al. (1997)， Biotechniques， 22:168-74; Liang and Pardee (1998, Mol Biotechnol. 10:261-7)。对于诸如痴呆、轻度认知障碍、抑郁等中枢神经系统(CNS)疾病领域 中的药物发现来说，这类方法的价值是不可估量的，这些领域中表型筛选是不适用 的，但易于建立期望的转录谱，并将之与特定的疾病相联系。鉴定到的有效化合物 将揭示出潜在的分子过程。另外，该方法可有助于开发现有药物的改进形式，这种 改进的药物能同时作用于多个生化靶点，产生所需的药理效果。在这种情况下，和 根据对多靶点结合的优化进行筛选相比，转录应答的变化对药物作用是一种更好的 标记物。
在本发明之前，绘制转录谱最先进的方法是基于使用DNA微阵列的技术，举 例来说，这些技术评论在Greenberg， 2001 Neurology 57:755-61; Wu， 2001， J Pathol. 195:53-65; Dhiman et al., 2001， Vaccine 20:22-30; Bier et al" 2001 Fresenius J Anal Chem. 371:151-6; Mills et al" 2001， Nat Cell Biol. 3:E175-8中；并描述在美国专利 No.5,593,839; 5,837,832; 5,856,101; 6,203,989; 6,271,957和6,287,778中。DNA微 阵列是通过评价标记多聚核苷酸样品与结合在受试阵列表面上的DNA分子的杂交， 同时比较给定样品中几千种基因表达的方法，其中所述标记的多聚核苷酸样品通过 mRNA的逆转录获得。虽然现有技术提供有关转录变化的有价值的信息，但离完美 相去甚远，还存在有一些问题和缺陷。
首先，该技术局限于存在于微阵列中的基因集合。目前的指纹技术能够在单个 芯片上放置10，000-15,000个基因，该数目基本上是特定细胞类型中所表达的基因数 目。由于细胞类型的多样性，需要建立对特定细胞类型的特定阵列。虽然理论上是 可能的，但该任务几乎不可能实现，因为需要在制造微阵列之前了解表达在这些细 胞中的基因集合。
另外，组织样品中转录物的数目要比细胞样品中的大，并超出微阵列的容量。 并且，基因表达的一些变化缘自替换式剪切，这进一步增加了待分析的转录物数。 克服这些困难的唯一可能是开发能够涵盖整个基因组，包括替换式剪切基因的多个 阵列。这种方法将大大增加单次实验的成本，并需要大量生物样品，可能大于能够 合理获得的量。
其次，现有技术DNA微阵列不提供定量的准确数据，必须通过独立的方法(例 如定量聚合酶链式反应(Q-PCR))来证实所观察到的基因表达变化。
最后，可能是特别令人感兴趣的稀有转录物不能通过使用现有技术领域的检测 技术的微阵列来检测。
毛细管电泳已被用来定量检测基因表达。Rajevic等人(2001， Pflugers Arch. 442(6 S叩pl 1):Rl卯-2)公开了使用7个引物对来同时检测大量癌基因表达的差异， 从而检测癌基因差异表达的方法。正义引物5，端标记有荧光染料。通过在ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer上进行毛细管电泳对多重荧光RT-PCR结果进行了分析。 Borson等人(1998， Biotechniques 25:130-7)描述了在联合定量竞争性逆转录PCR (QC-RT-PCR)与毛细管电泳(CE)进行产物快速分离和检测的基础上，进行低丰 度mRNA转录物可靠定量的策略。George等人(1997, J Chromatogr B Biomed Sci Appl 695:93-102)描述了应用毛细管电泳系统(ABI310)鉴定荧光差异显示生成的 EST模式。Odin等人(1999， J Chromatogr B Biomed Sci Appl 734:47-53)描述了一 种具有多色检测能力的自动化毛细管凝胶电泳，用于PCR扩增的cDNA的分离和定 量。
用于PCR扩增和CE的独立装置是可以得到的。例如，PCR仪可购自Applied Biosystems (Foster City, CA)、 Bio-Rad (Hercules, CA)、 Eppendorf (Westbury, NY), Roche (Indianapolis, IN)。 CE装置可购自Applied Biosystems (Foster City, CA)、 Beckman Coulter (Ful!erton， CA)和Spectrumedix Corporation (State College, PA)。
美国专利No. 6,126,804公开了使用一次性的小型装置现场鉴定微生物和DNA 片段的设备，该设备在一个小的手持包装±/中包含有集成的聚合酶链式反应(PCR) 酶反应孔、所附着的毛细管电泳(CE)通道、检测器和读取装置。但是，该设备是
专门为现场使用而设计的。另外，现有技术中尚未有装置能提供简单、灵敏的设备 来定量检测一个或多个样品中的基因表达谱。
为了克服这些局限性，本技术领域中需要开发替代设备来绘制转录谱，其将
(1)不需要在分析前事先了解表达的基因集合的序列，而在分析过程中/后其本身将 提供该信息；(2)测定表达转录物水平的定量变化；(3)检测稀有基因的表达；和
(4)是自动化的。在本技术领域中需要有一种简单而灵敏的设备来定量检测一个或 多个样品中的基因表达谱。

发明内容
本发明提供了一种绘制表达谱的设备，其包括扩增反应混合物中的多聚核苷 酸以产生扩增产物的扩增装置；通过第一连接装置连接到扩增装置的分析装置，所 述的第一连接装置能够将反应混合物中的部分样品从扩增装置转移到检测和定量扩 增产物的分析装置，其中所述的第一连接装置是机器手(robotic arm)。
在一个实施方案中，所述设备还包括通过第二连接装置连接到扩增装置的多聚 核苷酸提取装置，所述第二连接装置能够将提取的多聚核苷酸样品从多聚核苷酸提 取装置转移到扩增装置。
在另一个实施方案中，所述设备还包括级分收集器。
在一个优选的实施方案中，所述的级分收集器通过第四连接装置与分析装置相 连，能够收集定量产物。
在另一个实施方案中，所述设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中 序列鉴定仪通过第五连接装置和分析装置相连，所述的第五连接装置能够将定量产 物从分析装置转移到序列鉴定仪。
在另一个实施方案中，所述的设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其 中序列鉴定仪通过第五连接装置和级分收集器相连，所述的第五连接装置能够将收 集的产物从级分收集器转移到序列鉴定仪。
本发明还提供了一种绘制表达谱的设备，其包括扩增反应混合物中的多聚核 苷酸以产生扩增产物的扩增装置；通过第一连接装置连接到扩增装置的分析装置，
所述的第一连接装置能够将反应混合物中的部分样品从扩增装置转移到检测和定量
扩增产物的分析装置；通过第二连接装置连接到扩增装置的多聚核苷酸提取装置，
所述第二连接装置能够将提取的多聚核苷酸样品从多聚核苷酸提取装置转移到扩增装置。
在另一个实施方案中，所述设备还包括级分收集器。
在一个优选的实施方案中，所述的级分收集器通过第四连接装置与分析装置相 连，能够收集定量产物。
在另一个实施方案中，所述设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中 序列鉴定仪通过第五连接装置连接到分析装置，所述的第五连接装置能够将定量产 物从分析装置转移到序列鉴定仪。
在另一个实施方案中，所述的设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其 中序列鉴定仪通过第五连接装置连接到级分收集器，所述的第五连接装置能够将收 集的产物从级分收集器转移到序列鉴定仪。
本发明还提供了一种绘制表达谱的设备，其包括扩增反应混合物中的多聚核 苷酸以产生扩增产物的扩增装置；通过第一连接装置连接到扩增装置的分析装置， 所述的第一连接装置能够将反应混合物中的部分样品从扩增装置转移到检测和定量 扩增产物的分析装置；通过第三连接装置连接到分析装置的数据生成装置，所述的 第三连接装置能够将信号从分析装置转移到数据生成装置。
在一个实施方案中，所述设备还包括通过第二连接装置连接到扩增装置的多聚 核苷酸提取装置，所述的第二连接装置能够将提取的多聚核苷酸样品从多聚核苷酸 提取装置转移到扩增装置。
在一个实施方案中，所述设备还包括级分收集器。
在一个优选的实施方案中，所述的级分收集器通过第四连接装置连接到分析装 置，能够收集定量产物。
在另一个实施方案中，所述设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中 序列鉴定仪通过第五连接装置连接到分析装置，所述的第五连接装置能够将定量产 物从分析装置转移到序列鉴定仪。
在另一个实施方案中，所述的设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其 中序列鉴定仪通过第五连接装置连接到级分收集器，所述的第五连接装置能够将收 集的产物从级分收集器转移到序列鉴定仪。
本发明还提供了一种绘制表达谱的设备，其包括扩增反应混合物中的多聚核 苷酸以产生扩增产物的扩增装置；通过第一连接装置连接到扩增装置的分析装置， 所述的第一连接装置能够将反应混合物中的部分样品从扩增装置转移到检测和定量 扩增产物的分析装置；能够收集定量产物的级分收集器。
在一个优选的实施方案中，所述的级分收集器通过第四连接装置连接到分析装 置，能够收集定量产物。
在一个实施方案中，所述设备还包括通过第二连接装置连接到扩增装置的多聚 核苷酸提取装置，所述第二连接装置能够将提取的多聚核苷酸样品从多聚核苷酸提 取装置转移到扩增装置。
在另一个实施方案中，所述的设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其 中序列鉴定仪通过第五连接装置连接到级分收集器，所述的第五连接装置能够将收 集的产物从级分收集器转移到序列鉴定仪。
本发明还提供了一种绘制表达谱的设备，其包括扩增反应混合物中的多聚核 苷酸以产生扩增产物的扩增装置；通过第一连接装置连接到扩增装置的分析装置， 所述的第一连接装置能够将反应混合物中的部分样品从扩增装置转移到检测和定量 扩增产物的分析装置；鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中序列鉴定仪通过第五 连接装置连接到分析装置，所述的第五连接装置能够将定量产物从分析装置转移到 序列鉴定仪。
在一个实施方案中，所述设备还包括通过第二连接装置连接到扩增装置的多聚 核苷酸提取装置，所述第二连接装置能够将提取的多聚核苷酸样品从多聚核苷酸提 取装置转移到扩增装置。
在一个实施方案中，所述设备还包括级分收集器。
在一个优选的实施方案中，所述的级分收集器通过第四连接装置连接到分析装 置，能够收集定量产物，其中所述的级分收集器还通过另一个第五连接装置连接到
序列鉴定仪，所述的第五连接装置能够将收集的产物从级分收集器转移到序列鉴定 仪。
在一个实施方案中，所述的扩增装置和分析装置还能够进行多聚核苷酸的序列鉴定。
本发明还提供了一种绘制表达谱的设备，其包括扩增反应混合物中的多聚核 苷酸以产生扩增产物的扩增装置；检测和定量扩增产物的毛细管电泳仪，其中所述 毛细管电泳仪的毛细管浸在反应混合物中，将反应混合物的部分样品从扩增装置转 移到毛细管电泳仪。
在一个实施方案中，所述设备还包括通过第二连接装置连接到扩增装置的多聚 核苷酸提取装置，所述第二连接装置能够将提取的多聚核苷酸样品从多聚核苷酸提 取装置转移到扩增装置。
在另一个实施方案中，所述设备还包括级分收集器。
在一个优选的实施方案中，所述的级分收集器通过第四连接装置和毛细管电泳 仪相连，以收集定量产物。
在另一个实施方案中，所述设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中 序列鉴定仪通过第五连接装置连接到毛细管电泳仪，所述的第五连接装置能够将定 量产物从毛细管电泳仪转移到序列鉴定仪。
在另一个实施方案中，所述的设备还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其 中序列鉴定仪通过第五连接装置连接到级分收集器，所述的第五连接装置能够将收 集的产物从级分收集器转移到序列鉴定仪。
在另一个实施方案中，所述的扩增装置和毛细管电泳仪能够进行多聚核苷酸的 序列鉴定。
在本发明的设备中，所述的扩增装置优选是聚合酶链式反应(PCR)扩增装置。 还优选的是，在每个PCR循环结束时，第一连接装置能够将反应混合物的部
分样品从扩增装置转移到分析装置。
优选的是，反应混合物包含一个或多个PCR扩增引物，所述引物与反应管内
壁或微滴定板的孔内壁化学连接。 在本发明的设备中，所述的扩增装置还优选能够进行逆转录以产生cDNA。 优选的是，用于逆转录的一个或多个引物与反应管内壁或微滴定板孔的内壁化 学连接。
优选的是，所述设备能够检测和定量一种或多种荧光标记物所产生的信号。 在本发明的某些实施方案中，第一、第二、第四或第五连接装置是机器手。 在本发明的其他实施方案中，第一、第二、第四或第五连接装置是管或通道。 在本发明的某些实施方案中，第一、第二、第四和第五连接装置为单一的连接
装置，例如将样品从一个装置转移到另一个装置的机器手。
在一个实施方案中，在第一、第二、第四或第五连接装置上施加电流，使之能
够进行转移。
在本发明的设备中，分析装置优选为毛细管电泳仪。
优选的是，所述设备中的多聚核苷酸提取装置能够从一种或多种生物材料中分 离总RNA或mRNAo
本发明将在下列方面发现广泛的用途，如生物学和生物医药研究；治疗试剂和 诊断标记物的鉴定；经过遗传修饰的细胞和生物有机体的分析；未知疾病的鉴定； DNA的分析和生物样品的鉴定。这些应用的非限制性例子包括定量PCR、实时PCR、 DNA测序、绘制转录谱和基因型分析。


将参照附图进一步解释本发明，其中在多个附图中相同的结构用相同的附图标 记来表示。所示的附图不按比例绘制，其重点通常是为了说明本发明的原理。
图1是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64和分析装置68组成，所述的分析装置68通过第一连接装置66和扩 增装置64相连。
图2是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由多聚核苷酸提取装置20、扩增装置64和分析装置68组成。第一连接装置66将扩 增装置64和分析装置68连接，而第二连接装置40将多聚核苷酸提取装置20和扩
增装置64连接。
图3是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64、分析装置68和数据生成装置120组成。第一连接装置66将扩增装 置64和分析装置68连接，第二连接装置40将多聚核苷酸提取装置20和扩增装置 64连接，第三连接装置80将分析装置68和数据生成装置120连接。
图4是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64和分析装置68组成。扩增装置64能够在扩增反应之前进行多聚核苷 酸的逆转录。第一连接装置66将扩增装置64和分析装置68连接。
图5是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64和分析装置68组成。分析装置68能够进行数据生成。第一连接装置 66将扩增装置64和分析装置68连接。
图6是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64和分析装置68组成，它们都位于同一个机壳60中。机壳60中的第 一连接装置66将扩增装置64和分析装置68连接。
图7是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由多聚核苷酸提取装置20、扩增装置64、分析装置68和数据生成装置120组成。 第一连接装置66将扩增装置64和分析装置68连接，第二连接装置40将多聚核苷 酸提取装置20和扩增装置64连接，第三连接装置80将分析装置68和数据生成装 置120连接。
图8是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64、分析装置68和级分收集器160组成。第一连接装置66将扩增装置 64和分析装置68连接，第四连接装置140将分析装置68和级分收集器160连接。
图9是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64、分析装置68和序列鉴定仪200组成。第一连接装置66将扩增装置 64和分析装置68连接，第五连接装置180将扩增装置64和序列鉴定仪200连接。
图10是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64、分析装置68、级分检测器和序列鉴定仪200组成。第一连接装置66
将扩增装置64和分析装置68连接，第四连接装置140将分析装置68和级分收集器 160连接，第五连接装置180将级分收集器160和序列鉴定仪200连接。
图11是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64和分析装置68组成，其中分析装置68还充当序列鉴定仪200。第一 连接装置66将扩增装置64和分析装置68连接。
图12是根据本发明的一个实施方案绘制表达谱的一种设备的示意图。设备10 由扩增装置64、分析装置68、序列鉴定仪200和数据生成装置120组成。第一连接 装置66将扩增装置64和分析装置68连接，第五连接装置180将扩增装置64和序 列鉴定仪200连接，第三连接装置80将序列鉴定仪200和数据生成装置连接。
图13是使用根据本发明的某些实施方案的设备绘制表达谱过程的示意图。
虽然上述

了本发明的优选实施方案，如讨论部分所提到的，本发明的 其他实施方案也可加以考虑。本文通过代表性方式而非限制性方式给出了本发明的 说明性实施方案。本领域的技术人员可以设计许多其他属于本发明原理的范围之内 的改动和实施方案。
具体实施例方式
本文使用了下列术语和定义
本文所用的"样品"指从其天然环境中分离且包含多聚核苷酸的生物材料。根 据本发明的"样品"可以由纯的或分离的多聚核苷酸组成，或可以包含生物样品， 如含有多聚核苷酸的组织样品、生物流体样品或细胞样品。生物流体包括但不局限 于血液、血浆、唾液、尿液、脑脊液、灌洗液和白血球电泳法(leukophoresis)样品。 本发明的样品可以是包含多聚核苷酸的任何植物、动物、细菌或病毒材料，或源自 它们的任意材料。
本文所用的"制备的样品"指为了分离或合成多聚核苷酸，即DNA (如基因组 DNA或cDNA)或RNA (如总RNA或mRNA)的目的来源于样品的制备物。
本文所用的"部分样品(aliquot)"指从制备的完整样品或反应混合物中取出的 样品体积。部分样品的体积小于样品或反应混合物的总体积，优选为lnl-5pl的体积。
在本发明的一个实施方案中，对于取出的各部分样品来说，加入包含反应所必需试 剂(如缓冲液、盐、核苷酸和聚合酶)的等体积反应缓冲液。
本文所用的"连接装置"指连接两个仪器、能够将流体和/或信号从一个仪器转 移到另一个仪器的装置。
本文所用的"机器手"指将样品、包含样品的管或板从一个位置物理转移到另 一个位置的装置，优选由微处理器控制。每个位置可以是根据本发明有用的模块设 备中的一个单元。根据本发明一个有用的机器手的例子是Mitsubishi RV-E2 Robotic Arm。控制机器手的软件通常可从机器手厂商获得。
本文所用的"反应室"指用于放置正在进行或将要进行反应(例如，扩增反应 或提取过程)的反应物的流体室。"反应室"可以包括任意的合适材料，即表现出最 小非特异性吸收的材料，或处理后表现出最小非特异性吸收的材料，例如包括但不 局限于玻璃、塑料、尼龙、陶瓷或其组合。"反应室"可以和至少一个连接装置连接， 所述的连接装置用于转移材料激出反应室。
本文所用的"表达"指在细胞或无细胞系统中生成蛋白质或核苷酸序列，包括 从编码所述产物的DNA转录成RNA产物，转录后修饰和/或翻译成蛋白质产物或多 肽，以及可能的翻译后修饰。
本文所用的"绘制表达谱"指检测多个样品间表达谱差异。
本文所用的"表达谱差异"指基因表达的量(即丰度)和质的差异。如果在一 个样品中通过检测多聚核苷酸的已知方法(例如，电泳)检测到了某个基因的表达， 而在另一个样品中未检测到其表达，则存在有"表达谱差异"。或者，如果两个样品 间基因表达量的差异(即增加或降低)为约20%、约30%、约50%、约70%、约 卯％、约100% (约2倍)或更多，直至并包括约1.2倍、2.5倍、5倍、10倍、20 倍、50倍或更多，则存在有"表达谱差异"。两个样品间具有表达谱差异的基因是在 两个样品中差异表达的基因。
本文所用的"多个"指两个或多个。根据本发明，多个可以是3个或更多，100 个或更多，或者1000个或更多，例如最多达对应于样品中所有mRNA的cDNA的 数目。
本文所用的"扩增产物"指部分特定多聚核苷酸序列和/或其互补序列的多拷贝 多聚核苷酸，核苷酸序列对应于模板多聚核苷酸序列和其互补序列。根据本发明的 "扩增产物"可以是DNA或RNA，可以是双链或单链。
本文所用的"合成"和"扩增"可以互换使用，指产生特定多聚核苷酸序列的 拷贝或增加特定多聚核苷酸序列的拷贝数或量的反应。可以不加限制地通过聚合酶 链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、特异多聚核苷酸基扩增(NSBA)的体 外方法或本领域所公知的其他方法进行。例如，多聚核苷酸扩增可以是使用聚合酶 和一对寡核苷酸引物生成含量大于起始存在量的任意特定多聚核苷酸序列的过程， 即生成靶多聚核苷酸序列或耙多聚核苷酸的过程。
本文所用的术语"级分收集"指用于收集来自缓慢流动源，如色谱柱或电泳仪 的液体样品的装置，其中液体的组成随时间而变化。 一般来说，级分收集器包括能 够支持多个分离收集管的支架面，和能够选择性将液体样品导向各个收集管的分配 头。通过这种方式，样品的不连续液体级分被收集到各个管中进行后续的分析或使 用。在毛细管电泳中，可以通过将毛细管的末端和电极浸在含有液体的收集管中、 施加电流使多聚核苷酸洗脱到收集管中进行级分收集。
本文所用的术语"序列鉴定仪"指能够鉴别多聚核苷酸的核苷酸序列的仪器， 即DNA测序仪器。
本文所用的"标记物"或"可检测标记物"指能够用来提供可检测(优选可定 量)信号并可以可操作连接到多聚核苷酸的任意原子或分子。标记物可以提供能够 通过荧光、放射性、比色、比重测定、X射线衍射或吸收、磁力、酶活性、质谱、结 合亲和力、杂交射频、纳米晶体等检测的信号。本发明的引物可被标记以使扩增反 应产物可通过"检测"可检测标记物而被"检测"。"定性或定量"检测指在标记物 所产生的信号量(强度)或数目的基础上进行可视或自动化分析。
本文所用的"分离的"或"纯化的"多聚核苷酸指已经从其正常细胞(例如， 染色体)环境取出或在非天然环境中合成(例如人工合成)的天然存在序列。因此， "分离的"或"纯化的"序列可以在无细胞溶液中，或在不同的细胞环境中。术语 "纯化的"并非意味着序列是仅存在核苷酸，而是指基本不含与之天然结合的非核苷酸或多聚核苷酸材料(约卯-95%纯度，直到99-100%纯度)，因而区分于分离的 染色体。
本文所用的"cDNA"指在RNA依赖的DNA聚合酶(例如，逆转录酶)作用 下从RNA模板生成的互补或拷贝多聚核苷酸。"cDNA克隆"指携带在克隆载体中， 与目的RNA分子互补的双链DNA序列。
本文所用的"基因组DNA"指染色体DNA,与拷贝自RNA转录物的互补DNA 相对。本文所用的"基因组DNA"可以是单一细胞中存在的所有DNA,或者是单一 细胞中DNA的一部分。
本发明涉及绘制基因表达谱的自动化设备。该设备能够提供对多个样品以及一 个样品的髙通量表达分析。因而单一自动化仪器包括在单一系统中传统上由技术员 使用移液器、孵箱、多聚核苷酸扩增装置、分析装置(例如，凝胶电泳系统)和数 据获得系统所完成的功能。本发明的设备能够进行扩增产物的检测、分析、定量和/ 或可视化。
除非指明，本发明的实施采用分子生物学、微生物学的传统技术和重组DNA 技术，这些技术是本领域技术人员所公知的，在文献中作有解释。例如，参见 Sambrook， Fritsch & Maniatis, 1989， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed.， 1984); Polynucleotide Hybridization (B.D. Harnes & S.J. Higgins， eds.， 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal， 1984);和a series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc); Short Protocols In Molecular Biology, (Ausubel et al" ed.， 1995)。本发明 的实施还涉及美国专利No. 5,965,409; 5,665,547; 5,262,311; 5,599,672; 5,580,726; 6,045,998; 5，994，076; 5,962,211; 6,217,731; 6,001,230; 5,963,456; 5,246,577; 5,126,025; 5,364,521和4,985,129中所公开的技术和组合物。这里上下文中所提到的所有专利、 专利申请和出版物都通过引用并入本文。
本发明的绘制基因表达谱的设备如图1中10所示。设备10由扩增装置64和分 析装置68组成，所述的分析装置68通过第一连接装置66和扩增装置64相连。从 感兴趣样品中提取的多聚核苷酸在扩增装置64中扩增。然后通过第一连接装置66
将扩增多聚核苷酸产物中的部分样品转移到分析装置68中。分析装置68进行扩增 产物的检测和定量。
在一个实施方案中，所述设备能够进行多聚核苷酸的聚合酶链式反应(PCR) 扩增，扩增产物通过电泳进行分析。优选釆用毛细管电泳分析扩增产物。
如图2所示，本发明中绘制表达谱的设备还能够制备用于扩增反应的DNA模 板。设备10包括多聚核苷酸提取装置20、扩增装置64和分析装置68。第一连接装 置66将扩增装置64和分析装置68连接，第二连接装置40将多聚核苷酸提取装置 20和扩增装置64连接。生物样品引入到多聚核苷酸提取装置20中，多聚核苷酸从 生物材料提取。提取的多聚核苷酸通过第二连接装置40转移到扩增装置64中，使 得多聚核苷酸在扩增装置64中得以扩增。扩增多聚核苷酸产物的部分样品通过第一 连接装置66转移到分析装置68中。分析装置68进行扩增产物的检测和定量。
在优选的实施方案中，多聚核苷酸提取装置从生物材料中提取RNA。在一个更 优选的实施方案中，在多聚核苷酸提取装置20中进行mRNA从生物样品的提取。
所述设备的分析装置68能够生成所需的表达谱绘制数据，基本如图5所示。设 备10由扩增装置64和分析装置68组成，所述的分析装置68通过第一连接装置66 和扩增装置64相连。从感兴趣样品提取的多聚核苷酸在扩增装置64中得以扩增。 然后，扩增多聚核苷酸产物的部分样品通过第一连接装置66转移到分析装置68中。 分析装置68进行扩增产物的检测和定量，生成表达谱绘制数据。
作为替代实施方案，本发明中绘制表达谱的设备还可以包括分离的数据生成装 置，如图3所示。设备10由扩增装置64、分析装置68和数据生成装置120组成， 第一连接装置66将扩增装置64和分析装置68连接，第三连接装置80将分析装置 68和数据生成装置120连接。
如图4所示，绘制表达谱的设备的扩增装置能够通过逆转录生成cDNA。设备 10由扩增装置64和分析装置68组成。第一连接装置66将扩增装置64和分析装置 68连接。将提取的RNA (例如，总RNA或mRNA)引入到扩增装置64中，在扩 增装置64中从RNA合成cDNA。然后，合成的cDNA在扩增装置64中得以扩增。 扩增多聚核苷酸产物的部分样品通过第一连接装置66转移到分析装置68中。分析
装置68进行扩增产物的检测和定量。
多聚核苷酸提取装置20
如图2和图7所示，根据本发明的多聚核苷酸提取装置20能够直接从生物样品 (例如，细胞样品或组织样品)中提取多聚核苷酸(即DNA或RNA)。
优选的是，多聚核苷酸提取装置20被设计以提供提取的多聚核苷酸，来用作扩 增装置64中逆转录反应和/或PCR扩增反应的模板。在一个实施方案中，多聚核苷 酸提取装置20提供制备的多聚核苷酸，其质量和体积对应于用来扩增多聚核苷酸的 现有或将有系统的要求。可通过商业途径获得的扩增系统包括但不局限于Applied Biosystems (Forster City, CA)的GeneAmp PCR System 9700; Hercules, CA的 iCycler Thermal Cycler; Eppendorf 的 Eppendorf Mastercycler Gradient; Cepheid(Sunnyvale, CA)的Smart Cycler TD System; Roche (Indianapolis, IN)的 LightCycler; AMPLICORTM自动化PCR系统(Roche, Indianapolis, IN)和这些仪器的 后继产品。提取装置可被设计来提供任意适当输出体积的流体，其包含提取的多聚 核苷酸，例如约100 ml至约750 pi,优选500 ml至约500 pl，较优选约1 pi至约250 Hl，更优选约1 pi至约100 pl。
在一个实施方案中，多聚核苷酸提取装置20能够从生物材料中分离mRNA。 在另一个实施方案中，多聚核苷酸提取装置20能够从多个生物材料中分离mRNA。
提取多聚核苷酸的技术和试剂是本领域所公知的，例如，在Basic Methods in Molecular Biology, (1986， Davis et al" Elsevier, NY)和Current Protocols in Molecular Biology (1997， Ausubel et al.， John Weley & Sons, Inc.)中所描述的。
使用上述多聚核苷酸提取技术的各种多聚核苷酸提取设备都可以和本发明联 用。例如，日本专利申请No. 125972/1991描述了一种多聚核苷酸提取设备，其设计 用来预防病毒感染和提高提取效率，包括多关节的工业机器人和DNA提取及纯化所 必须的外周元件。日本专利申请No.131076/1992公开了一种提取设备，其通过转移 多聚核苷酸提取容器至离心机的装置的紧凑排列，以提高多聚核苷酸从小量血液或 其他生物材料中的提取效率。日本专利申请No.47278/1997公开了一种提取设备，其
采用带有真空泵而非离心机的过滤系统。为了实现完全自动化的提取装置，可将离 心机或真空泵和相关的硬件组建成仪器。
在一个实施方案中，多聚核苷酸提取装置20是一种多聚核苷酸提取设备。本发 明的多聚核苷酸提取设备可以包括(1) 一组提取容器，每个提取容器包括一个反 应管，其中将生物材料、试剂溶液和磁力载体混合并反应、 一个用于收集非必需组 分溶液的放泄杯和一个多聚核苷酸回收管，都固定在支架上；(2)将溶液引入每个 提取容器的分配装置；(3)混合反应管中溶液和磁力载体的搅拌装置；(4)使容器 中磁力载体保持静态的控制装置；(5)从反应管中排出溶液而使磁力载体保持不动 的排出装置；(6)加热反应管中溶液和磁力载体的加热装置；和(7)连续转移容器 到给定位置的转移装置。这种设备描述在美国专利No.6，281，008中，其整体内容通过 引用并入本文。
在另一个实施方案中，多聚核苷酸提取装置20是一种自动化多聚核苷酸分离仪 器。该仪器包括可移动的盒(cassette)，其中所述盒包括可分离的样品转移/存储带 (strip)。所述的盒可以密封或开放，优选是密封的。优选的盒还具有可移动的输入 转移条(transfer bar),并装在箱中。该仪器还包括具有顶侧、外侧、内侧的中空体、 用于放置所述盒的至少一个狭槽和用于放置样品容器的至少一个孔。另外，所述盒 包括将盒移出/入箱的装置，以及活化输入转移样品条的装置。优选的仪器还包括和 这些装置相通的、存储或生成加压空气的空气喷嘴，和密封所述盒的样品输入通道 的装置。另外，该仪器还包括位于内部的阀驱动器，用于开启或关闭所述盒中的阀， 和一个或多个泵驱动器，用于移动流体出/入所述盒中的流体室。该仪器还优选包括 磁铁、电源、用户界面和条码读取装置。优选的是，该仪器还包括位于狭槽或孔中 的感应装置，当所述盒或样品容器已经插到其中时，其显示狭槽或孔已被占据的信 号。这种仪器公开在美国专利No.6，281，008中，其整体内容通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，多聚核苷酸提取装置20还包括存储装置。在另一个实施 方案中，多聚核苷酸提取装置20还包括将带与盒的其他部分分离的分离装置。分离 装置优选为一种刀，其具有与之相通的加热装置，其用途是将带与盒的其他部分密 封。优选的装置具有多个孔；更优选的是，所述装置具有约24个孔，或48个孔，或96个孔，或386个孔。所述装置优选包括具有下述部分的盒(1)位于输入转移 样品条上的一个或多个样品输入端口，其分别连续地与该装置中相同数目的孔相通， 其中所述端口还与盒的样品输入存储库相通；(2) —个或多个反应流道，其分别连 续地通过流体交换通道与相同数目的样品输入存储库相通；(3)与流体交换通道相 通的流体室，其中流体室是反应试剂的供应室、样品池或反应室；(4)控制流体交 换通道中流体流动的阀；和(5)样品转移/存储条，其具有至少一个与反应流道相通 的流体室。
多聚核苷酸提取装置20用来从任意生物样品中制备多聚核苷酸。用于本发明上 下文中的生物样品可以是包含多聚核苷酸，即RNA或DNA的任意材料。这种样品 可以是一个完整的生物有机体，如昆虫；或多个生物有机体，如分析细菌或酵母时； 或者样品可以是生物有机体的一部分，如组织、体液或分泌物。可以从中获得多聚 核苷酸组分的适当组织包括但不局限于皮肤、骨、肝脏、脑、叶、根等；即可以是 活的或死亡的生物有机体的任意组织。所述的组织可以基本上不被原生物有机体的 其他组织污染，或可以被污染，或甚至被来自不同生物有机体的组织污染。优选的 是，从中获得特定生物样品的生物有机体的来源在实施本发明方法之前是已知的； 但是，并不总是能够获得这种知识，如法医样品。
生物样品还可以是临床样品或样本。例如，由外源材料所致的疾病或病症可以 通过测试来自某种临床样本中样品的多聚核苷酸中特定病原体的存在来验证，例如 通过鉴定该病原体所具有的特征性多聚核苷酸序列来验证，所述的样品如尿液、排 泄物、脊髓液、唾液、血液或血液组分、或任意其他的合适样本。还可以测试个体 中某些先天性遗传性疾病或病症的存在或倾向。这些遗传性疾病包括但不局限于亨 丁顿舞蹈症、TaySach，s症等，检验分离自适当临床样品，如受试个体任意细胞材料 的多聚核苷酸中的这种遗传疾病或倾向所特有的多聚核苷酸序列，但需要说明的是， 单独使用和胚系干细胞相比具有重排DNA或更少可测DNA的细胞，如红细胞和抗 体形成细胞可能并不足以进行这种检验。
通过多聚核苷酸提取装置提取,即分离的多聚核苷酸是任意合适的多聚核苷酸， 其中适用性取决于所需测试的类型。例如，测试个体中某种病原体的存在时，优选
测试识别性多聚核苷酸序列或取自临床样品的DNA组分中发现的序列，如果受试个 体感染了该病原体的话，病原体和宿主的已知生物学特征将提示能够发现病原体。 或者，对于测试特定基因是否在个体中表达时，可以寻找识别性多聚核苷酸序列或 取自组织的RNA组分中的序列来验证这种表达,其中潜在的生物学/病理学特征指示 表达应该被发现或不应该被发现，与待测病症或疾病相对应。根据表达受监控的基 因，还可以使用本领域中公知的方法提纯RNA组分，使之主要包括多聚腺苷化的或 非多聚腺苷化的RNA物质。作为替代方案，或进一步的方案，还可以在本发明的范 围内选择RNA物质的大小类型。
生物样品可以新鲜取自个体或从自然界分离，或者将这种样品保存在适当的条 件下，例如在冰上。例如，可以使用标准方法从个体中采集血液样品，例如用位于 个体静脉内、与标准排出管相连的皮下针将血液从个体抽到管中。该血液可以直接 使用或保存在冰上。优选的是存在抗凝剂，如肝素、柠檬酸盐或EDTA。对于长期保 存来说，优选将样品冷冻、冻干，或涂到适当的基质上并在其上干燥，例如DNA的 保存。这种适当的基质包括任何吸收纸，如Whatman滤纸，或可释放性地结合DNA 的处理膜材料。优选的膜包括在IsoCode.TM. Stix商品中(Schleicher & Schuell， Inc., Keene， N.H.)，除了能够可逆地结合DNA,其还能够可逆地结合血色素(某些多聚 核苷酸扩增方法的抑制剂)。根据本发明，基质结合的多聚核苷酸可以从基质中提取， 然后以与新鲜样品相同的方式纯化。
优选的是，多聚核苷酸提取装置20能够从一种或多种生物样品中进行核酸提 取。在一个实施方案中，借助包括能够插入仪器狭槽中的可移取盒的装置来实现这 一点。优选的是，该装置包括适于同时、先后或以交错方式运行四个的不同盒(例 如，每个盒对应一个样品)的狭槽。
样品制备装置还可用作扩增反应混合物的容器，从而在每次将扩增产物转移到 分析装置之后，向反应混合物补充与部分样品等量的扩增反应混合物。
扩增装置64
如图1所示，根据本发明的扩增装置64可以是能够扩增多聚核苷酸的任意仪器， 优选通过多聚核苷酸链式反应(PCR)扩增的仪器。通常，PCR反应通过热循环仪
进行。有用的热循环仪包括但不局限于Applied Biosystems (Forster City, CA)的 Gene Amp PCR System 9700; Bio-Rad (Hercules, CA)的iCycler Thermal Cycler; Eppendorf的Eppendorf Mastercyder Gradient; Cepheid (Sunnyvale, CA)的Smart Cycler TD System; Roch (Indianapolis, IN)的LightCycler; AMPLICORTM自动化 PCR系统(Roche, Indianapolis, IN)。根据本发明有用的PCR仪包括但不局限于在美 国专利No. 5,475,610; 5,602,756; 5,720,923; 5,779,977; 5,827,480; 6,033,880; 6,326,147; 6,1716,785中公开的仪器，其整体内容都通过引用并入本文。
聚合酶链式反应的目的是制备与初始供应的小量"模板"DNA相同的大量 DNA。该反应涉及复制DNA链，并在随后的循环中使用这些拷贝产生其他的拷贝。 理想情况下,每个循环都使DNA的量加倍，从而导致存在于扩增反应混合物中的"靶" 或"模板"DNA链的拷贝数以几何级数增加。
例如，典型的PCR温度循环需要反应混合物被精确地控制在每个孵育温度下 一定时间，相同或相似的循环重复多次。典型的PCR程序开始于将样品在约94'C下 保持约30秒，以使反应混合物变性。然后，将反应混合物的温度降至约30'C-约60 'C，保持l分钟，使引物杂交。然后，反应混合物的温度升高至约50'C-约72'C的温 度，保持约2分钟，以促进延伸产物的合成。这就完成一个循环。再次将反应混合 物的温度升高至约94'C来对前面循环(变性)中形成的延伸产物进行链分离，从而 开始下一个PCR循环。通常，重复所述循环25-30次。本领域中可以理解的是，PCR 反应中PCR循环的温度和循环数可以根据反应目的和模板特征加以改变，例如tm。 基本的PCR方案和策略是本领域中所公知的，例如，描述在Basic Me也ods in Molecular Biology, (1986， Davis et al" Elsevier, NY)和Current Protocols in Molecular Biology (1997， Ausubel et al" John Weley & Sons, Inc.)中。
在一个实施方案中，反应混合物保存在用盖封闭的一次性塑料管中。这种管的 典型样品体积约为50-100微升。通常，所述仪器使用装有样品DNA和反应混合物 的许多管，其插入到金属模具中称作样品孔的孔中。为了进行PCR过程，金属模具 的温度根据用户在PCR方案文件中指定的预定温度和时间加以控制。电脑和相关的 电子器件根据用户在PCR方案文件中提供的限定了循环时间、循环温度和循环次数
等的数据进行控制。金属模具改变温度时，各孔中的样品也随之发生相同的温度改 变。
一般说来，希望形成金属模具内各位置之间均一的温度，因为模具金属内存在 的温度梯度会使在循环的特定时间上一些样品具有和其他样品相比不同的温度。还 希望将从样品模具向样品热传递的延迟减到最小，因为这种延迟对于所有样品来说 并不相同。当设计本发明的PCR仪时应考虑这些因素。
在一个实施方案中，PCR仪的金属模具足够大，能够容纳以工业标准微滴定板 形式排列的96个样品管。微滴定板是生物化学领域和生物技术领域中处理、加工和 分析大量小样品时广泛使用的装置。有用的微滴定板可以包含24孔、48孔、96孔、 196孔或384孔。典型地，微滴定板是宽为35/8英寸、长5英寸、具有96个相同样 品孔的板，以9毫米的间隔以8孔乘12孔的矩形排列。可以获得具有各种材料、样 品孔形状和体积的微滴定板，优化用于许多不同的用途。优选的是，微滴定板以9 毫米的间隔具有全部外形尺寸和同样8x12排列的孔。可以获得能够以这种标准微滴 定板格式自动处理、加工和分析样品的各种仪器。本领域中微滴定板是可以通过商 业途径获得的，例如得自MWG biotech Inc. (High Point, NC)。可以通过本领域中 公知的方法制造微孔板，例如美国专利 0.5，602,756中描述的方法，其通过引用并入 本文。
优选的是，用于微滴定板的管是薄壁样品管，以减小样品模具的样品温度变化 和反应混合物的相应温度变化之间的延迟。与所用的任何热交换器相接触的样品管 部分的壁厚度应尽可能薄,只要能够承受PCR循环的热应力和正常使用的应力即可。 通常，样品管由可以高压灭菌的聚丙烯如HimontPD701制成，圆锥部分的壁厚度为 0.009-0.012英寸加减0.001英寸。
在另一个实施方案中，PCR仪加热或冷却样品模具导致样品与样品之间的均一 性，和快速的热循环速率、不受控的环境温度改变，其他操作条件如电源电压和冷 却温度的变化无关。如下文所述，可以使用加热盖来防止冷凝和样品体积损失。
在另一个实施方案中，PCR仪防止样品在接近其沸点的温度下孵育时反应混合 物中溶剂的损失。加热板覆盖样品管的顶部，并和提供气密密封的每个样品管的各
个盖相接触。来自热板的热量加热每个样品管的上部和盖至高于冷凝点的温度，使 任何样品管中都不发生冷凝和回流。冷凝意味着较多的热传递，因为当水蒸汽冷凝 时散发与蒸发热等量的热量。如果冷凝的发生不均一，则会导致样品与样品之间较 大的温度变化。加热板防止在样品管中发生任何冷凝，从而可以将潜在的温度误差 来源降至最小。使用加热板还减小了试剂用量。
在一个优选的实施方案中，本发明的扩增装置64还能够进行逆转录以合成 cDNA。逆转录反应指体外酶催化的反应，其中发生与RNA模板互补的DNA链的模 板依赖性聚合。逆转录通过将退火的寡核苷酸引物延伸至RNA模板进行，最通常使 用病毒逆转录酶如AMV (鸟白血病病毒)逆转录酶或MMLV (莫洛尼氏小鼠白血 病病毒)逆转录酶。逆转录条件和方法是本领域所公知的。逆转录示例性的条件如 下AMV逆转录酶——于37'C下，在包含50 mM Tris-HCI, pH8.3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.8 mM dNTP， 50单位逆转录酶和1-5吗模板RNA
的缓冲液中反应；MMLV逆转录酶-^ 37'C下，在包含50 mM Tris-HCl， pH 8.3,
30 mM KC1， 8 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.8 mM dNTP, 50单位逆转录酶和1-5吗 模板RNA的缓冲液中反应。
在另一个优选的实施方案中，逆转录使用96孔板进行，其中cDNA使用与微 孔板的孔内壁化学连接的一种或多种寡核苷酸引物加以合成。合成这种化学连接的 寡核苷酸的技术公开在 McGall et al.， International application No, PCT/US93/03767; Pease et al" (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.， 91: 5022-5026; Sou也ern and Maskos， International application PCT/GB89/01114; Maskos and Southern (同 上)；Southern et al., (1992) Genomics, 13:1008-1017;和Maskos and Southern, (1993) Polynucleotides Research, 21:4663-4669中，每个文献的整体内容都通过引用并入本 文。
在某些实施方案中，使用与微滴定板的孔内壁化学连接的一种或多种寡核苷酸 进行逆转录。在其他的实施方案中，使用与微滴定板的孔内壁或反应管的内壁化学 连接的至少一个寡核苷酸引物进行扩增反应。结果是合成的cDNA或扩增的多聚核 苷酸产物与微滴定板的内壁结合，易于分离和纯化。
寡核苷酸还可以在单一 (或几个)固相支持物上合成，如在微滴定板的孔内壁 或反应管的内壁上合成，形成均匀包被有合成寡核苷酸的区域的阵列。合成这种阵 列的技术公开在McGall et al" International application No. PCT/US93/03767; Pease et al" (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.， 91: 5022-5026; Southern and Maskos， International application PCT/GB89/01114; Maskos and Southern (同上)；Southern et al.， (1992) Genomics, 13:1008-1017;和Maskos and Sou仇ern， (1993) Polynucleotides Research, 21:4663-4669中。
在一个实施方案中，扩增装置生成标记的扩增产物。例如，可以使用标记的引 物生成扩增产物。根据本发明方法标记的多聚核苷酸(例如，寡核苷酸引物)被标 记在5，端、3，端、或两端、或内部。标记物可以是"直接的"，例如染料，放射性标 记物。标记物还可以是"间接的"，例如抗体表位、生物素、地高辛、碱性磷酸酶(AP)、 辣根过氧化物酶(HRP)。为了检测"间接标记物"，必须加入其他组分，如标记的 抗体或酶底物，从而使捕获的、释放的、标记的多聚核苷酸片段可视化。在一个优 选的实施方案中，寡核苷酸引物用荧光标记物标记。适当的荧光标记物包括荧光染 料,如若丹明和衍生物(如Texas Red)、荧光素和衍生物(如5-溴甲基荧光素)、Lncifer Yellow、 IAEDANS、 7-Me;rN-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯、 7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、 monobromobhnane、三磺酸芘，如Cascade Blue 和 monobromorimethy- amminobimane ( 例如, 参见 DeLuca， 7m/MM o_/7"omsce ce ^4冊/戸's， in JwriAorfj; fl 7bo/， Marchalonis, et al" eds" John Wiley & Sons, Ltd., (1982),其通过引用并入本文)。
分析装置68——^^细管电泳仪
毛细管电泳是分析本发明扩增产物的优选方法。如图l所示，本发明提供了一 种设备，其包括扩增装置64和分析装置68，例如毛细管电泳仪。毛细管电泳仪是本 领域所公知的。根据本发明有用的毛细管电泳仪包括但不局限于Applied Biosystems (Foster City, CA)的ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer 、 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer、 ABI PRISM 377 DNA Sequencer、 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer; Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway， NJ)的MegaBACE 100 Capillary Array
Electrophoresis System; Beckman Coulter (Ful!erton， CA)的CEQTM 8000 Genetic Analytic System ; Caliper Technologies (Mountain View, CA)的 Agilent 2100 Bioanalyzer; Convergent Bioscience Ltd. (Toronto, Canada)的iCE280 System。有用 的毛细管电泳重复(r印eat)仪可以如美国专利No.6，217，731！ 6,001，230; 5，963,456; 5,246,577; 5,126,025; 5,364,521; 4,985,129; 5,202,010; 5,045,172; 5,560,711; 6,027,624; 5,228,969; 6,048,444; 5,616,228; 6,093,300; 6,120,667; 6,103,083; 6,132,582; 6,027,627; 5，938,卯8和5,916,428所述，其整体内容都通过引用并入本文。
在毛细管电泳中，包含背景电解液的两个池通过含有相同溶液的毛细管相连通。 每个池都配有电极。待分析样品作为一个短的区带引入毛细管的一端。对于样品的 引入来说，毛细管的一端通常转移到一个池中，将所需量的样品溶液注入毛细管， 然后将该毛细管末端转移到背景溶液中。借助池中的电极，对毛细管施加电场，通 常为200-1000 V/cm，使带电的粒子在毛细管中迁移。如果粒子在电场中具有不同的 速度，则不同的粒子彼此分离。粒子区带在不同的时间通过毛细管另一端的检测器， 其信号得以测定。
在一个实施方案中，毛细管电泳仪提供多个毛细管、电紛毛细管阵列、多腔管、 管架、光学检测区、毛细管束和高压T装置。毛细管的样品端安置在电极/毛细管阵 列中，第二末端由高压T装置所接收。
优选的是，电紛毛细管阵列包括电极和毛细管的样品端，其从毛细管电泳仪的 底部突出。电极和毛细管样品端的排列应能够浸入到96孔或384孔微滴定板的相应 样品孔中。这需要96或384个毛细管，以充分利用微滴定板上的每个孔。
还优选的是，毛细管位于牢固安置在管架上的相应多腔管中。毛细管的暴露部 分并排排列，不受多腔管的保护，然后通过带有照相机装置的光学检测区。照相机 装置捕获在暴露的毛细管中迁移的样品图像。然后将毛细管暴露的第二末端捆在一 起，安装到高压T装置上。
在一个实施方案中，扩增装置64和分析装置68位于相同的机壳60中，如图6 所示。机壳60中的第一连接装置66将扩增装置64和分析装置68连接。
数据生成装置120
如图5所示，本发明的分析装置68可以进行数据生成。作为替代方案，数据由 图3所示单独的数据生成装置120生成。
数据生成可以通过本领域中公知的方法实现，如美国专利No. 6,217,731; 6,001,230; 5,963,456; 5,246,577; 5,126; 025; 5,364,521; 4,985,129; 5,202,010; 5,045,172; 5,560,711; 6,027,624; 5,228,969; 6,048,444; 5,616,228; 6,093,300; 6,120,667; 6,103,083; 6,132,582; 6,027,627; 5,938，卯8; 5，卯0934; 6，184，9卯和5,916,428中所述，其整体 内容都通过引用并入本文。
在一个实施方案中，所述的数据生成装置包括信号检测仪、监视器和连接控制 电路与监视器的计算机处理器。计算机处理器包括配置来与控制电路通信的输入/输 出(I/O)界面，和储存在监视器上显示图形用户界面的显示程序的第一计算机存储器。
优选的是，数据生成装置能够检测和定量荧光团所产生的荧光信号。所述的荧 光团包括但不局限于若丹明和衍生物(如Texas Red)、荧光素和衍生物(如5-溴甲 基荧光素)、Lucifer Yellow、 IAEDANS、 7-Me;jN-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香 豆素-3-乙酸酯、7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、 monobromobimane、三 擴酸花，如Cascade Blue和monobromorimethy-ainminobiinane。
在一个实施方案中，所述的装置安装有凹面反射镜，其位于毛细管流动池的一
侧，作为第一高数值孔径(N.A.)收集器；透镜收集器，其位于流动池的相对侧，作 为第二高N.A.收集器；和光学纤维，其紧靠流动池，用于发送激发光，使流动池中 所含的样品发出发射光。反射镜具有能反射发射光的凹面，收集器具有接收发射光 的近凸面和校准发射光的远凸面。这种排列能够获得跨越流动池两侧的较大立体收 集角，因此收集效率增加。可以使用两个或多个光学纤维从不同的光源发送发射光。 光学纤维与反射镜、收集器的光轴呈平面正交排列，以减小发散的背景光的影响， 从而提高信噪比。校准的发射光可以通过例如光倍增管检测器检测。
级分收集器160
在本发明中，所述的设备可以包括与分析装置相连的级分收集器，以从分析装 置收集任何所需的多聚核苷酸样品。如图8所示，级分收集器160可以通过第四连 接装置140和分析装置68相连。另外，如图10所示，级分收集器160还可以通过 第五连接装置180和序列鉴定仪200相连。
传统上，将级分收集器大致分为两类。在第一类中，收集管以一般的矩形阵列 排列，操作分配头以选择性地流入各个收集管。在第二类中，收集管以螺旋模式排 列，安装在通常为环形的转盘上。当分配头放射状移动时，转盘转动，以沿螺旋模 式跟踪各收集管。本发明中可以使用任何级分收集器。这种级分收集器的例子包括 但不局限于美国专利No. 4,862,932; 3,004,567; 3,945,412; 4,495,975; 4,171,715中 公开的级分收集器，每个专利的整体内容通过引用并入本文。
已经开发了级分收集器来满足高通量分析系统的需要，这些收集器也可以整合 到本发明的设备中。例如，美国专利No. 6,309,541 (其整体内容通过弓l用并入本文) 公开了自动的级分收集装置，其将微滴定板维持在固定的位置上，将样品部分分配 到微孔板中的选定孔中。级分收集装置包括一个分配针，样品部分可以通过该分配 针分配到一次性的膨胀室中，然后分配入微滴定板中。分配针安装在适于延伸至一 次性膨胀室的分配头上，样品部分可以冷凝至膨胀室中，然后分配到微滴定板。
本发明中有用的另一种类型级分收集器是借助电泳的级分收集器，例如，它们 描述在美国专利No. 5,541,420; 5,635,045; 5,439,573; 4,964,961; 4,608,147; 4,049,534; 4,040940; 3,989,612 (每个专利的整体内容通过引用并入本文)中。在一个实施方案 中，根据本发明的级分收集器具有以指定间隔分布的一个或多个电泳泳道，以通过 电泳分离样品，然后将分离的组分从电泳泳道中洗脱。使一个或多个转移毛细管样 品的管的末端以指定的间隔靠近电泳泳道的末端，转移洗脱自每个电泳泳道的分离 组分。任选的是，使用连接装置向间隙处提供缓冲液，通过缓冲液的鞘流动 (sheathflow)将分离的组分携带至样品转移管。
其他有用的级分收集器包括但不局限于美国专利申请No. 6,106,710; 6,004,443; 5,205,154和6,355,164，每个专利的整体内容通过引用并入本文。
序列鉴定仪200
本发明的设备还可以包括序列鉴定仪，以提供所需多聚核苷酸的序列，例如通 过分析装置鉴定的目的多聚核苷酸的序列。如图10所示，序列鉴定仪200可以和级 分收集器160相连，以鉴定所收集的每个级分中的多聚核苷酸序列。在如图9和图 12所示的另一个实施方案中，序列鉴定仪200通过第五连接装置180和分析装置相 连。在如图ll所示的另一个实施方案中，分析装置68本身可以充当序列鉴定仪。优 选的是，包含目的多聚核苷酸的样品加载到分析装置上进行其序列分析。DNA测序 通常通过Sanger等人(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:5463， 1977)的方法进行，涉及 从单链DNA模板与引物以酶法合成单链DNA。单链DNA模板和与模板相杂交的引 物一起提供。使用DNA聚合酶将引物延伸，通过掺入适当的链终止试剂，例如双脱 氧核苷酸，每个反应都终止于特定的碱基(鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T或胞 嘧啶C)。然后根据在多聚核苷酸的每个位置上掺入的链终止剂，确定多聚核苷酸的 核苷酸序列。但是，还建立了其他的DNA测序仪和方法，也可用作本发明的序列鉴 定仪。
在优选的实施方案中，所述设备中不存在单独的序列鉴定仪。扩增装置和分析 装置(如毛细管电泳仪)行使序列鉴定的功能。可以向扩增反应中加入测序试剂混 合物以进行测序反应，将部分测序反应物转移到分析装置(例如，毛细管电泳仪) 中进行序列鉴定。用于测序反应和序列鉴定的方法和试剂是本领域所公知的，例如 参见Short Protocols In Molecular Biology, (Ausubel et al., 1995,同上)。
本发明中有用的序列鉴定仪可以包括但不局限于美国专利No.6，270，961; 6,025,136; 5,955,030; 5,846,727; 5,821,058; 5,608,063; 5,643,798; 5，556，7卯；5,453,247; 5,332,666; 5,306,618; 5,288,644; 5,242,796; 5,221,518和5,122,345中公开的序列鉴 定仪，每个专利的整体内容通过引用并入本文。
鉴定到的目的多聚核苷酸的序列可以和各种数据库，如Geiibank中的已有序列 相比较。
连接装置40、 66、 80、 140或180 本发明的连接装置40、 66、 80、 140或180能够使两个仪器之间的流体和/或信
号相通，如图1-12所示。优选的是，本发明的连接装置可以水平移动和垂直移动以 转移流体。连接装置可以是管或通道，或机器手。连接装置可以包含两个或多个管。 所述的两个或多个管可以结合在一起。连接装置所结合的区室，如扩增装置的反应 室可以是封闭的(除了连接装置存在时)，或者具有一个或多个开放侧，同时使可用 体积和本发明的目标和目的相一致。例如，可以使用能够施加选定电压水平，包括 接地电压的电压控制器将样品通过连接装置电动转移。可以使用多个分压器和多个 继电器来行使电压控制器的功能，以获得选定的电压水平。使用电动转运是样品操 作的可行方法，作为泵机制发挥作用。本发明还需要使用电渗流、以受控且可重复 的方式混合各种流体。当合适的流体置于由相应合适的材料制成的管中时，管表面 的官能团可以离子化。电渗作用可以用作程序控制的泵机制。
例如，还可以使用蠕动泵来实现泵作用，其机制是一个辊向下推动流体室的可 变形膜以减小室体积，挤压流体室的可变形膜以减小其体积的活塞和其他泵作用模 式是本领域所公知的。这些机制包括微机电装置，如Shoji et al.， "Fabrication of a Pump for Integrated Chemical Analyzing Systems," Electronic and Communications in Japan, Part 2， 70， 52-59 (1989)或Esashi et al., "Normally closed microvalve and pump fabricated on a silicon Wafer," Sensors and Actuators, 20， 163-169 (1989沖所 报道的微机电装置。
用于本发明的连接装置40、 66、 140或180可以是机器手。机器手有形地将样 品、包含样品的管或板从一个位置转移到另一个位置。易于作为常规程序实施自动 化的取样过程，并避免人为取样误差(即，样品大小的误差和跟踪样品特性的误差) 和人为取样污染的可能性。能够从热循环仪中取出部分样品的机器手是本领域中可 以得到的。例如，Mitsubishi RV-E2 Robotic Arm可以和SciCloneTM Liquid Handler 或Robbins Scientific Hydra 96 pippttor联用。优选的是，本发明的机器手可以包括 机动化平台，其能够水平移动和垂直移动以转移样品。
在一个实施方案中，第一连接装置66将扩增装置64和分析装置68相连，使流 体可以转运并进行特定的分析。在一个优选的实施方案中，第一连接装置66能够自 动将流体样品加到分析装置68的加样孔中。置于加样孔中的样品体积或样品"塞
(phlg)"下降到分析通道中，在此处进行所需的分析。在一个优选的实施方案中，分 析装置68是毛细管电泳装置。因此，对于这种操作来说，主通道或分析通道通常包 括筛分基质、置于其中的缓冲液或介质，以优化样品中组份的电泳分离。但是，通 过阅读本申请可以理解，所述的分析装置68还可以是各种非CE仪，可用于对样品 进行许多不同分析反应中的任意反应。
优选的是，用来转移样品的连接装置66能够在扩增过程中从扩增反应物中取出 部分样品。连接装置66可以包括移液tip头或针，其在一次取样后就除掉，或在每 次取样后引入一个或多个洗涤针或tip头的步骤。作为替代方案，连接装置可以将用 于毛细管电泳的毛细管直接和扩增反应物接触，以将部分样品加到毛细管中。
在一个实施方案中，在每个PCR循环结束时，第一连接装置66将PCR扩增 反应混合物的部分样品从扩增装置转移到分析装置。
在另一个实施方案中，第二连接装置40将多聚核苷酸提取装置和扩增装置相 连。在另一个实施方案中，第二连接装置还可以用于将包含dNTP、引物、必要试剂 和DNA聚合酶的混合物补充至扩增反应混合物，其浓度与起始反应混合物相同。在 另一个实施方案中，使用不同的连接装置补充扩增反应混合物。这种连接装置可以 以本申请中所述的相同方式制造，以转移流体。
优选的是，本发明的第一连接装置能够将扩增反应混合物的部分样品加到分析 装置上，如加到毛细管电泳仪上。这种加样功能可以通过本领域中公知的方法实现， 例如美国专利No. 6,280,589; 6,192,768; 6，1卯，521; 6,132,582和6,033,546中所公开 的方法，其整体内容都通过引用并入本文。
在一个实施方案中，样品作为样品塞注入连接装置中，连接装置包括至少一个 电解缓冲液通道和样品供应和排放通道。供应和排放通道在分析装置68的各个供应 口和排放口处进入电解液通道。供应口和排放口之间的距离在几何学上限定样品体 积。样品塞向电解液通道的注入通过跨供应和排放通道施加电场一段时间而电动完 成，其中所述的时间至少应使具有最小电泳迁移率的样品组分包含在几何学上限定 的体积中。每个供应和排放通道都倾向电解液通道。提供了将样品电动注入样品体 积的装置。供应源和排放通道对电解缓冲液的流动阻力至少比电解液通道的流动阻
力低约5%。
在另一个实施方案中，使用本领域中公知的水力方法将样品引入第一连接装置。 样品通过压力差注入到毛细管中。压力差通过将毛细管末端置于不同的水平上而产 生，由此产生水力压力差，或者借助气体在可密封的样品池中产生超压力，超压力 将样品溶液注射入毛细管中。通过选择压力差和其有效时间来控制通过毛细管的样
品量°
在另一个实施方案中，通过将样品注射毛细管放置在毛细管区带电泳设备中毛 细管的入口端附近，借助固定的或可移动的样品注射毛细管来注射样品，其方式应 使样品溶液完全包围入口端。借助电泳电流或以其他的方式将样品转移到分离毛细 管中，预定的时间后，将溶液从入口端附近取出，其中样品溶液换为背景溶液。
但是，在一个不同的实施方案中，不使用第一连接装置将扩增装置和毛细管电
泳分析装置连接。相反，通过将电泳仪的毛细管和电极直接浸在PCR反应物中，将 扩增多聚核苷酸样品的一部分加到电泳仪上。优选的是，可以在电极上施加一定的 电流一段时间，迫使多聚核苷酸样品在上述电动力的作用下进入毛细管。施加电流 的时间，例如，约0.001秒、0.01秒、0.1秒、1秒或10秒或更长，取决于毛细管需 要取来用于毛细管电泳分析的样品体积。该实施方案提供了将样品加到分析装置上 的更简单方法。
第三连接装置80将分析装置68和位于分析装置外部的数据生成装置120连接。 第四连接装置140用在一个实施方案中，将分析装置68和级分收集器160连接。
但是，在本发明的另一个实施方案中，在分析装置和级分收集器之间不使用连接装置。
第五连接装置180用在某些实施方案中，将序列鉴定仪200和分析装置68或级 分收集器160连接，从而可以获得目的多聚核苷酸的序列鉴定。
在某些实施方案中，第一、第二、第四和第五连接装置可以是单一的连接装置， 例如，将流体从一个仪器转移到另一个仪器的机器手。单一的机器手将流体从一个 仪器转移到第二个仪器，自我洗涤和清洗，然后将流体从一个仪器转移到第三个仪 器。
可用于制造本发明连接装置的适当基材可以由各种材料的任意一种或材料的组 合制成。通常，连接装置使用本领域中公知的固体基材制成，例如二氧化硅基基材, 如玻璃、石英、硅或多晶硅，以及其他公知的基材，即砷化镓。作为替代方案，聚 合物基材可以用于制造本发明的连接装置，包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基 丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯、 聚甲基戊烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、ABS (丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物) 和类似材料。
本发明提供用于绘制转录谱的自动化设备。所述设备能够扩增目标多聚核苷酸， 对目标多聚核苷酸的扩增产物进行定量分析。所述设备还能够进行多聚核苷酸提取 和逆转录。所述设备还能够鉴定目的多聚核苷酸(例如，在两个或多个样品中差异 表达的基因)，并对目的多聚核苷酸进行序列鉴定。
图13所示为使用本发明的设备绘制表达谱过程的示意图。例如，该过程可以使 用图IO所示的设备进行。在一个优选的实施方案中，图10中所有的仪器都位于一 个机壳中。可以分别提取RNA，或通过如图2所示与扩增装置相连的多聚核苷酸提 取装置进行提取(步骤1)。扩增装置64能够进行cDNA合成和扩增(例如，通过 PCR，步骤2)。在每个PCR循环结束时，取出扩增产物的部分样品，在分析装置 68上进行分析(例如，毛细管电泳仪，步骤3)。差异表达的多聚核苷酸可以通过级 分收集器160收集(步骤4), 一个或多个差异表达的多聚核苷酸的序列可以通过序 列鉴定仪200鉴定(步骤5)。对于步骤5来说，可以加入测序试剂总混合物，测序 反应混合物可以根据本领域中的公知方法进行孵育。在一个实施方案中，随后将测 序反应混合物加到分析装置68 (例如，毛细管电泳仪)上进行序列鉴定。在另一个 实施方案中，级分收集器60所收集的部分级分可以返回到扩增装置64上进行随后 的反应。然后将反应产物加到分析装置68上进行序列鉴定。
在一个实施方案中，本发明的设备用于分析基因组DNA样品(例如，对基因 的基因组拷贝数进行定量)。这种技术和基于探针的分析或在整个基因组基础上的染 色体组型分析相比具有更低的成本和更髙的分辨率。基因组DNA分析的过程可以与 RNA分析的过程(如上所述)类似，只是使用基因组DNA时不需要进行逆转录和
cDNA合成。基因组DNA分析的过程可以自2个或多个待比较的样品中分离基因组 DNA开始。样品可以分成多份(如5、 10、 20或30或更多份)。每一份可以用不同 的引物组(例如，对于所有待分析样品份来说，共5、 10、 20或30或更多个引物组) 扩增。对于每个引物组来说， 一个引物可以与共有重复序列互补，或只是随机序列， 其具有样品特异性序列标签，从而具有样品特异性。其他引物可以是随机引物。在 一个实施方案中，两个或多个样品在相同的条件下使用相同的引物扩增，随之形成 PCR产物梯带，其来自于随机散布在整个基因组中的基因座位点。然后测定每个PCR 产物的量，在样品之间进行比较。这样就可以鉴定到基因组范围的不同基因座位点 处拷贝数的差异。这些差异指示为局部复制或扩增；三染色体性；和丧失杂合性。
作为替代方案，基因座特异性引物组(即，在耙基因座处识别特异序列的引物) 可用于PCR扩增，确定两个或多个样品之间特定基因座位点处的拷贝数变化。
上述实施方案说明了在制造和实施本发明中本发明人所进行的实验和使用的技 术。应该认为这些实施方案包括报告实施本发明的技术并说明其有用性的技术内容。 本领域的技术人员将理解本文所公开的技术和实施方案仅是优选的实施方案，一 般来说可以采用多种等价的方法和技术来获得相同的结果。
本文上面所述所有参考文献的整体内容都通过弓I用并入本文。
权利要求
1.一种绘制表达图谱的设备，包括扩增反应混合物中的多聚核苷酸以产生扩增产物的扩增装置；和通过第一连接装置与所述扩增装置相连的分析装置，所述的第一连接装置将反应混合物的部分样品从所述的扩增装置转移到检测和定量所述扩增产物的所述分析装置；其中所述的第一连接装置是机器手。
2. 权利要求1的设备，其还包括通过第二连接装置和所述扩增装置相连的多聚核苷 酸提取装置，所述的第二连接装置将提取的多聚核苷酸样品从所述的多聚核苷酸提 取装置转移到所述的扩增装置。
3. 权利要求l的设备，其还包括级分收集器。
4. 权利要求3的设备，其中所述的级分收集器通过第四连接装置和所述的分析装置 相连，以收集定量产物。
5. 权利要求l的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序列 鉴定仪通过第五连接装置和所述的分析装置相连，所述的第五连接装置将定量产物 从所述的分析装置转移到所述的序列鉴定仪。
6. 权利要求3的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序列 鉴定仪通过第五连接装置和所述的级分收集器相连，所述的第五连接装置将收集的 产物从所述的级分收集器转移到所述的序列鉴定仪。
7. —种绘制表达图谱的设备，包括 扩增反应混合物中的多聚核苷酸以产生扩增产物的扩增装置；通过第一连接装置与所述扩增装置相连的分析装置，所述的第一连接装置将反应 混合物的部分样品从所述的扩增装置转移到检测和定量所述扩增产物的所述分析装 置；和通过第二连接装置和所述扩增装置相连的多聚核苷酸提取装置，所述的第二连接 装置将提取的多聚核苷酸样品从所述的多聚核苷酸提取装置转移到所述的扩增装 置。
8. 权利要求7的设备，其还包括级分收集器。
9. 权利要求8的设备，其中所述的级分收集器通过第四连接装置和所述的分析装置 相连，以收集定量产物。
10. 权利要求7的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序 列鉴定仪通过第五连接装置和所述的分析装置相连，所述的第五连接装置将定量产 物从所述的毛细管电泳仪转移到所述的序列鉴定仪。
11. 权利要求8的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序列 鉴定仪通过第五连接装置和所述的级分收集器相连，所述的第五连接装置将收集的 产物从所述的级分收集器转移到所述的序列鉴定仪。
12. —种绘制表达图谱的设备，包括 扩增反应混合物中的多聚核苷酸以产生扩增产物的扩增装置；通过第一连接装置与所述扩增装置相连的分析装置，所述的第一连接装置将反应 混合物的部分样品从所述的扩增装置转移到检测和定量所述扩增产物的所述分析装 置；和通过第三连接装置和所述分析装置相连的数据生成装置，所述的第三连接装置将 信号从所述分析装置转移到所述的数据生成装置。
13. 权利要求12的设备，其还包括通过第二连接装置和所述扩增装置相连的多聚核 苷酸提取装置，所述的第二连接装置将提取的多聚核苷酸样品从所述的多聚核苷酸 提取装置转移到所述的扩增装置。
14. 权利要求12的设备，其还包括级分收集器。
15. 权利要求14的设备，其中所述的级分收集器通过第四连接装置和所述的分析装 置相连，以收集定量产物。
16. 权利要求12的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序 列鉴定仪通过第五连接装置和所述的分析装置相连，所述的第五连接装置将定量产 物从所述的分析装置转移到所述的序列鉴定仪。
17. 权利要求12的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序 列鉴定仪通过第五连接装置和所述的级分收集器相连，所述的第五连接装置将收集 的产物从所述的级分收集器转移到所述的序列鉴定仪。
18. —种绘制表达图谱的设备，包括 扩增反应混合物中的多聚核苷酸以产生扩增产物的扩增装置； 通过第一连接装置与所述扩增装置相连的分析装置，所述的第一连接装置将反应 混合物的部分样品从所述的扩增装置转移到检测和定量所述扩增产物的所述分析装 置；和收集定量产物的级分收集器。
19. 权利要求18的设备，其中所述的级分收集器通过第四连接装置和所述的分析装 置相连，以收集定量产物。
20. 权利要求18的设备，其还包括通过第二连接装置和所述扩增装置相连的多聚核 苷酸提取装置，所述的第二连接装置将提取的多聚核苷酸样品从所述的多聚核苷酸 提取装置转移到所述的扩增装置。
21. 权利要求18的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序 列鉴定仪通过第五连接装置和所述的级分收集器相连，所述的第五连接装置将收集 的产物从所述的级分收集器转移到所述的序列鉴定仪。
22. —种绘制表达图谱的设备，包括 扩增反应混合物中的多聚核苷酸以产生扩增产物的扩增装置；通过第一连接装置与所述扩增装置相连的分析装置，所述的第一连接装置将反应 混合物的部分样品从所述的扩增装置转移到检测和定量所述扩增产物的所述分析装 置；和鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序列鉴定仪通过第五连接装置和所 述的分析装置相连，所述的第五连接装置将定量产物从所述的分析装置转移到所述 的序列鉴定仪。
23. 权利要求22的设备，其还包括通过第二连接装置和所述扩增装置相连的多聚核 苷酸提取装置，所述的第二连接装置将提取的多聚核苷酸样品从所述的多聚核苷酸 提取装置转移到所述的扩增装置。
24. 权利要求22的设备，其还包括级分收集器。
25. 权利要求24的设备，其中所述的级分收集器通过第四连接装置和所述的分析装 置相连，以收集定量产物，其中所述的级分收集器还通过另一个第五连接装置和所 述的序列鉴定仪相连，所述的第五连接装置将收集的产物从所述的级分收集器转移 到所述的序列鉴定仪。
26. 权利要求1、 7、 12、 18和22中任意一项的设备，其中所述的扩增装置和所述 的分析装置还能够进行多聚核苷酸的序列鉴定。
27. —种绘制表达图谱的设备，包括 扩增反应混合物中的多聚核苷酸以产生扩增产物的扩增装置；和 检测和定量所述扩增产物的毛细管电泳仪，其中所述毛细管电泳仪的毛细管浸在所述的反应混合物中，将所述反应混合物的部分样品从所述的扩增装置转移到所述 的毛细管电泳仪。
28. 权利要求27的设备，其还包括通过第二连接装置和所述扩增装置相连的多聚核 苷酸提取装置，所述的第二连接装置将提取的多聚核苷酸样品从所述的多聚核苷酸 提取装置转移到所述的扩增装置。
29. 权利要求27的设备，其还包括级分收集器。
30. 权利要求27的设备，其中所述的级分收集器通过第四连接装置和所述的毛细管 电泳仪相连，以收集定量产物。
31. 权利要求27的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序 列鉴定仪通过第五连接装置和所述的毛细管电泳仪相连，所述的第五连接装置将定 量产物从所述的毛细管电泳仪转移到所述的序列鉴定仪。
32. 权利要求27的设备，其中向毛细管电泳仪的电极上施加电流，使浸在所述反应 混合物中的所述毛细管电泳仪的毛细管将所述反应混合物的部分样品从所述的扩增 装置转移到所述的毛细管电泳仪。
33. 权利要求27的设备，其中所述的扩增装置和所述的毛细管电泳仪还能够进行多 聚核苷酸的序列鉴定。
34. 权利要求29的设备，其还包括鉴定定量产物序列的序列鉴定仪，其中所述的序 列鉴定仪通过第五连接装置和所述的级分收集器相连，所述的第五连接装置将收集 的产物从所述的级分收集器转移到所述的序列鉴定仪。
35. 权利要求1、 7、 12、 18、 22和27中任意一项的设备，其中所述的扩增装置是 聚合酶链式反应(PCR)扩增装置。
36. 权利要求35的设备，其中所述的第一连接装置在每个PCR循环结束时将反应 混合物的部分样品从所述的扩增装置转移到所述的分析装置。
37. 权利要求1、 7、 12、 18、 22和27中任意一项的设备，其中所述的扩增装置能 够进行逆转录，生成cDNA。
38. 权利要求37的设备，其中用于逆转录的一个或多个引物与反应管内壁或微滴定 板的孔内壁化学连接。
39. 权利要求1、 7、 12、 18、 22和27中任意一项的设备，其中所述的设备能够检 测和定量一种或多种荧光标记物所产生的信号。
40. 权利要求l、 7、 12、 18、 22和27中任意一项的设备，其中所述的第一、第二、 第四或第五连接装置是机器手。
41. 权利要求l、 7、 12、 18、 22和27中任意一项的设备，其中所述的第一、第二、 第三、第四或第五连接装置是管或通道。
42. 权利要求l、 7、 12、 18、 22和27中任意一项的设备，其中所述的第一、第二、 第四和第五连接装置是单一的连接装置。
43. 权利要求1、 7、 12、 18、 22和27中任意一项的设备，其中电流施加在所述的 第一、第二、第四或第五连接装置上，以进行转移。
44. 权利要求1、 7、 12、 18和22中任意一项的设备，其中所述的分析装置是毛细 管电泳仪。
45. 权利要求2、 7、 12、 20、 23和28中任意一项的设备，其中所述的多聚核苷酸 提取装置从一种或多种生物材料中分离总RNA或mRNA。
全文摘要
用于表达谱分析、将生物材料进行多聚核苷酸提取、扩增和分析的设备。该设备包括扩增多聚核苷酸的扩增装置和对扩增的多聚核苷酸产物进行定量的分析装置。设备中的扩增装置还可以提取多聚核苷酸以制备扩增用模板，或对定量多聚核苷酸产物进行序列鉴定。级分收集器可以包括在所述设备中，以在序列鉴定前收集定量的多聚核苷酸产物。分析装置还能够进行数据生成，或者作为替代方案，通过与所述设备联用的分离的数据生成装置来生成数据。所述设备中的装置通过连接装置相连，这些连接装置能够传输用作扩增和分析的流体或信号。
文档编号C12N15/09GK101348763SQ20081009471
公开日2009年1月21日 申请日期2003年6月19日 优先权日2002年6月20日
发明者弗拉基米尔·I·斯列普尼奥夫 申请人:普里梅拉生物系统有限公司