利用微生物酶改善烟叶膨胀梗丝品质的方法

专利名称：：利用微生物酶改善烟叶膨胀梗丝品质的方法
技术领域：
：本发明涉及烟叶梗丝处理
技术领域：
，具体地说是利用微生物酶改善烟叶膨胀梗丝品质的方法。技术背景随着巻烟生产技术的发展，在主要原料烟丝中添加梗丝可显著改善巻烟单支重量、吸阻、主流烟气及感官质量等，具体表现为巻烟单支重量、吸阻呈下降趋势；同时可达到降低巻烟主流烟气总粒相物、焦油和CO量的目的。因此，在巻烟原料中添加一定量梗丝己经成为国内外巻烟生产企业为进一步提高巻烟品质、降焦减害而普遍采用的关键技术环节之一。然而，由于梗丝自身的物理性状与主要化学成分(主要是纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等)，导致添加梗丝的巻烟制品在吸食过程中表现出香气量不足、劲头下降及木质味增加的缺陷，从而阻碍了梗丝在巻烟原料中的有效利用。所以，如何改善梗丝可用性、提高其应用效果己经成为长期困扰巻烟企业的技术难题。针对梗丝在巻烟原料应用中存在的一系列问题，首先从生产工艺入手，即利用物理学原理改善梗丝物理性状，增加梗丝细胞和组织空间结构从而促进巻烟在燃烧过程中的氧化反应，减少了抽吸时的焦油及有害物质释出量，因此也就减少了每支烟的抽吸口数，进而也大大降低了抽吸时巻烟焦油及有害物质的摄入量。这一梗丝膨胀技术在一定程度上改善了梗丝的可用性。然而，梗丝的主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质、木质素。尤其是其中的木质素在原始状态下经吸食过程中的高温氧化会产生儿茶酚和垸基儿茶酚，这些热解成分不但会产生涩口的不愉快感观反应，同时具有促癌活性，这一弊端又成为膨胀梗丝进一步应用的主要障碍。木质素是结构复杂、稳定、多样的无定形三维大分子。在自然界中广泛存在参与降解木质素的微生物种类，如真菌、放线菌和细菌。其中，真菌能把木质素彻底降解为C02和水。为此，利用生物或生物酶技术适当降解梗丝中细胞壁物质，促进其向香气物质(或前体)的转化，从而改善梗丝在巻烟生产中的可用性已经成为可能。木质素的结构复杂，具有芳香族特性，其结构单元为苯丙垸单体，通过醚键和碳-碳键连接的复杂的无定型高聚物。烟草中的木质素主要由愈创木基丙烷单体和紫丁香基丙烷单体及对羟基苯丙烷单体所构成。在木质素生物降解过程中，氧化反应占主要地位，同时需要还原反应的辅助。主要包括以下五个方面的反应1、木质素化合物的Ca-Cp断裂参与氧化反应的有木质素过氧化物酶(Ligninperoxidase,简称Lip)、锰过氧化物酶(Mn-d印endentperoxidase，简称MnP)、漆酶等酶类和活性氧。通过单电子转移机制，LiP催化e-l非酚型木质素模型化合物为其芳香正离子自由基，经Ca-Ce断裂形成3，4-二甲氧基苯乙醇自由基和质子化形式的藜芦醛。有氧存在时，前者加氧后再释放超氧离子形成羰基，或形成醇；无氧存在时，则溶剂水参与而形成醇。2、藜芦醇及其衍生物的氧化藜卢醇(VA)被木质素过氧化物酶分解，主要产生藜戸醛(70%90%)，其次是开环产物(约20%)和醌(约10%)，产物的分布受pH值控制。因此可以说藜卢醇在木质素降解中起着重要的作用。漆酶是一种含铜的酚氧化酶，它能催化酚型二聚体模型物e-i和e-o-4结构等经过Cci-芳烃断裂，产生甲氧基取代的醌/氢醌。3、Ccr氧化机制LiP催化P-0-4木质素模型化合物的主要反应是，Cci-"断裂形成的藜卢醛和2-甲氧基苯酚，后者在反应条件下易于聚合，同时还有相当一部分形成Ca氧化产物。这种氧化产物是正离子自由基中间体失去质子或直接失去氢形成的。在活性氧存在时，后者更容易发生。4、氧的活化木质素氧化的一种普遍现象是，分子氧与羟基取代的苯自由基间的反应中，能引起氧的活化，氧被还原成超氧离子，又与质子反应生成^02与02，这个过程是发生在分子氧与苯基自由基中间体之间的纯化学过程。这个反应也出现在木质素过氧化物酶的催化循环中，其结果是02成为最终的电子受体。5、醌、氢醌的形成漆酶是一种含铜的酚氧化酶，它能催化酚型二聚体模型物e-i和e-0-4结构等经过Cci-芳烃断裂，产生甲氧基取代的醌/氢醌。漆酶催化木质素氧化的机制漆酶在氧气存在下，能催化苯酚氧化生成苯氧自由基，而且不需要HA参与，对于木质素而言，其反应包括脱甲氧基、脱羟基、C-C键断裂过程等。根据这一基本原理，利用生物酶对烟叶梗丝中的木质素进行降解和还原，可产生一些香味化合物，如香兰素、苯甲醇、l-苯基乙醇、2-苯基乙醇和其他芳香族化合物。其中，苯甲醇、1-苯基乙醇和2-苯基乙醇具有花香和水果香，可使烟气柔和。目前，应用酶制剂对烟叶和梗丝进行处理以提高其质量和可用性的报道和发明专利主要有厦门巻烟厂和仲恺农业技术学院申请的发明专利(CN1955281)"—种复合酶制剂及将该复合酶制剂用于烟梗生产的工艺"，该方法可显著降低杂气(25-60%)、剌激性(20-50%)，香气质、香气量及余味均有改善，然而其酶制剂组成主要为木质素酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶及脂酶；云南瑞升烟草技术(集团)有限公司发明专利(CN200610048647.7)"—种降低巻烟烟气一氧化碳量的复合添加剂及其应用"、"一种降低巻烟烟气中有害成分的复合添加剂及其应用"(CN200710065703.2)，其添加剂主要成分为烟草提取物、碱金属盐、过渡金属氢氧化物等，这两个复合添加剂主要针对一氧化碳、亚硝铵及稠环芳烃等有害成分。
发明内容本发明的目的是提供一种利用黑曲霉来自然合成LiP酶(锂依赖过氧化物酶，Li-dependentperoxidase)、MnP酶(f孟依赖过氧化物酶，Mn-dependentperoxidase)禾卩漆酶(Lac)等木质素降解酶及纤维素酶，经过酶群提取纯化及活性保护，改善烟叶膨胀梗丝品质的方法。本发明的生物酶来源产酶菌株为保藏号CGMCC0571的黑曲霉。黑曲霉(Aspergillusniger)属半知菌亚门真菌，该菌具有木质素降解能力。由于黑曲霉在生长过程中不产生毒素，因此已被许多国家批准作为食品用酶制剂生产菌，一些国家已实现黑曲霉制剂商品的工业化生产。黑曲酶对木质素降解是LiP、MnP、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果。本发明的技术方案如下1、木质素降解复合酶的制备1)黑曲霉的活化和培养黑曲霉菌种为保藏号CGMCC0571的黑曲霉，经马铃薯蔗糖培养基活化培养后接入灭菌后的种子培养基中，于28'C、250rmin"下摇床培养24h;按l(P/。接种量将种子液接入灭菌后的500ml摇瓶中(含产酶培养液100ml)，于25'C进行产酶培养96小时后得发酵液；2)木质素降解复合酶的提取发酵液经滤纸过滤后，于1500rpm低速离心分离，上清液经(NH4)2S04分段盐析至饱和度为0.7得粗酶液，粗酶液经超滤透析(截留分子量20150kD)后得木质素降解复合酶，酶组分活性LiP350U/L;MnPllU/L;Lac5.6U/L;以上所述的种子培养基主要成分(g七—"葡萄糖50，KC10.2,KH2P040.15，MgSO4'7H2O0.12，(NH4)2HPO40.6，酵母膏3，蛋白胨2。以上所述的产酶培养基主要成分葡萄糖10g，酒石酸铵0.1g，MgSCV7H200.5g，KH2P04lg，Na2HPO40.2g，MnSO40.035g，CuS045H200.007g，加蒸馏水IOOOral。初始pH值自然，灭菌条件121°C，23min。2.酶活性测定木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)活性测定采用毕鑫等的方法进行(纤维素科学与技术，2002，10(4):41-48)。LiP酶一个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化黎芦醇产生lwmol黎芦醛所需的酶量；MnP酶一个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化酚红产生l11mol产物所需的酶量；Lac酶一个活单位(U)定义为每小时600nm吸光度变化O.Ol所需的酶量。3.改善烟叶膨胀梗丝品质的方法称取膨胀梗丝巻烟用，分为两份。在28。C左右，分别均匀喷施(膨胀梗丝量)0.20.4%木质素降解复合酶液(蒸馏水稀释)和蒸馏水，至含水率1921%;置密闭容器内酶解9597小时；自然风干至含水率12.5%-15%;以梗丝为单一原料巻烟后进行二者的评吸鉴定，同时对两种不同处理的梗丝进行木质素、纤维素等成分的化学分析。评吸结果表明，采用木质素复合酶处理对烟叶品质有较明显改善，表现为劲头、刺激性减弱，香气质、口感得到改善。纤维素、木质素化学成为分析结果见下表。膨胀梗丝细胞壁物质测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上表显示，经木质素复合酶处理，样品全纤维素含量有所上升，木质素含量有所下降(降低11.4%)。纤维素含量的升高是因为在酶处理过程中，随着木质素和非纤维素含量的减少导致全样品量的减少，因此造成全纤维素所占比例增加。感观评吸结果表明该复合酶制剂处理梗丝可有效降低其木质素含量，促进香气物质的转化，香气质和口感均得以改善。具体实施方式实施例l:1.生物酶来源产酶菌株为保藏号CGMCC0571的黑曲霉。2.黑曲霉的活化和培养黑曲霉菌种经马铃薯蔗糖培养基活化培养后接入灭菌后的种子培养基中，于28°C、250r'min1下摇床培养24h;按10%接种量将种子液接入灭菌后的500ml摇瓶中(含产酶培养液100ml)，于25'C进行产酶培养96h后得发酵液。其中种子培养基主要成分(g丄—i):葡萄糖50，KC10.2,KH2PO40.15，MgS04.7H200.12，(NH4)2HPO40.6，酵母膏3，蛋白胨2。产酶培养基主要成分葡萄糖10g，酒石酸铵O.lg，MgS04.7H200.5g，KH2P04lg，Na2HPO40.2g，MnSO40.035g，CuS045H200.007g，加蒸馏水1000ml，初始pH值自然，灭菌条件121°C，23min。3.木质素降解复合酶的提取发酵液经滤纸过滤后，于1500rpm低速离心分离，上清液经(NH4)2804分段盐析至饱和度为0.7得粗酶液，粗酶液经超滤透析(截留分子量20150kD)后得木质素降解复合酶，酶组分活性LiP350U/L;MnPllU/L;Lac5.6U/L。4.酶活性测定-木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)活性测定釆用毕鑫等的方法进行(纤维素科学与技术，2002，10(4):41-48)。LiP酶一个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化黎芦醇产生1umol黎芦醛所需的酶量；MnP酶一个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化酚红产生l!xmol产物所需的酶量；Lac酶一个活单位(U)定义为每小时600nm吸光度变化0.01所需的酶量。5.改善烟叶膨胀梗丝品质取400g巻烟用膨胀梗丝在28'C左右，均匀喷施膨胀梗丝量0.20.4%的木质素降解复合酶液(蒸馏水稀释25倍后喷施)，置密闭容器内在28。C土2酶解9597小时，自然风干至含水率12.5%-15%即可。权利要求1.一种利用微生物酶改善烟叶膨胀梗丝品质的方法，其特征在于以下步骤进行1)生物酶的制备①黑曲霉菌种经马铃薯蔗糖培养基活化培养后接入灭菌后的种子培养基中，于28℃、250r·min-1下摇床培养24h；按10％接种量将种子液接入灭菌后的500ml摇瓶中，含产酶培养液100ml，于25℃进行产酶培养96小时后得发酵液；②木质素降解复合酶的提取发酵液经滤纸过滤后，于1500rpm低速离心分离，上清液经(NH4)2SO4分段盐析至饱和度为0.7得粗酶液，粗酶液经超滤透析后得木质素降解复合酶，酶组分活性LiP350U/L；MnP11U/L；Lac5.6U/L2)改善烟叶膨胀梗丝品质称取卷烟用膨胀梗丝，在28℃±1℃，均匀喷施膨胀梗丝量0.2～0.4％的蒸馏水稀释后的木质素降解复合酶液，置密闭容器内酶解95～97小时，自然风干至含水率12.5％-15％。2.根据权利要求1所述的利用微生物酶改善烟叶膨胀梗丝品质的方法，其特征在于种子培养基主要成分葡萄糖50，KC10.2,KH2P040.15，MgS04'7H200.12，(NH4)2HPO40.6，酵母膏3，蛋白胨2，以上单位均为g七一1。3.根据权利要求1所述的利用微生物酶改善烟叶膨胀梗丝品质的方法，其特征在于产酶培养基主要成分萄糖10g，酒石酸铵0.1g，MgS04'7H200.5g，KH2P04lg，Na2HP040.2g，MnSO40.035g，CuS045H200.007g，加蒸馏水1000ral，初始pH值自然。全文摘要本发明是一种利用微生物酶改善烟叶膨胀梗丝品质的方法。按以下步骤进行1)生物酶的制备①黑曲霉菌种经马铃薯蔗糖培养基活化培养后接入灭菌后的种子培养基中，于28℃、250r·min^-1下摇床培养24h；按10％接种量将种子液接入灭菌后的500ml摇瓶中(含产酶培养液100ml)，于25℃进行产酶培养96小时后得发酵液；②木质素降解复合酶的提取发酵液经滤纸过滤后，于1500rpm低速离心分离，上清液经(NH4)₂SO₄分段盐析至饱和度为0.7得粗酶液，粗酶液经超滤透析后得木质素降解复合酶，酶组分活性LiP350U/L；MnP11U/L；Lac5.6U/L；2)改善烟叶膨胀梗丝品质称取卷烟用膨胀梗丝，在28℃±1℃，均匀喷施膨胀梗丝量0.2～0.4％的蒸馏水稀释后的木质素降解复合酶液，置密闭容器内酶解95～97小时，自然风干至含水率12.5％-15％。感观评吸结果表明该复合酶制剂可有效降低梗丝中木质素含量，促进香气物质的转化，香气质和口感均得以改善。文档编号C12N9/02GK101288505SQ200810108379公开日2008年10月22日申请日期2008年6月6日优先权日2007年12月6日发明者何宝玉,陈应昆,伟韩申请人:云南万芳生物技术有限公司