专利名称：A型流感病毒核蛋白捕获elisa抗原诊断试剂盒及专用单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒及专用单克隆抗体。
背景技术：
禽流感的频繁暴发，给养殖业带来了巨大的经济损失；对流感病毒做出快速诊 断或早期诊断以及进行禽流感在养殖业禽类中的净化，是控制该病的重要环节。A 型流感病毒亚型包括16个HA亚型和9个NA亚型，各亚型之间血凝素抗原差异较 大，针对HA进行亚型抗原诊断有一定难度。而核蛋白(NP)蛋白在A型流感病毒 各亚型之间变异程度很低，具有良好的保守性，可以作为A型特异性抗原对A型流 感病毒进行诊断。
目前应用于AIV病原诊断的方法主要有病毒分离、血凝和血凝抑制试验、琼脂 扩散试验和RT—PCR等。病毒分离和RT—PCR方法是目前最为常用的两种方法，但 病毒分离法耗时较长，不易作为快速诊断；RT—PCR方法，虽然用时较短，但成本 较高，不易作为大规模调查。血凝和血凝抑制试验，又需要在病毒分离的基础上， 在基层又难以实现和推广，不宜用来进行大规模的样品检测。
发明内容
本发明的目的是提供A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒及专用单 克隆抗体。该试剂盒可用于对临床采集拭子或病毒尿囊液进行流感病毒核蛋白检
本发明所提供的抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体，是由对A型流感病毒NP 蛋白杂交瘤细胞株C4 (CGMCCNo.2575)分泌产生的，对A型流感病毒NP蛋白杂交 瘤细胞株C4已于2008年7月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮 编100101)，保藏编号为CGMCC No. 2575。
保藏号为CGMCC No. 2575的对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4也属于本 发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂。
本发明所提供的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒，包括已包被 所述的抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的固体载体和酶标记的所述的抗A型禽 流感病毒核蛋白单克隆抗体。所述酶具体可为辣根过氧化物酶。
其中，为了便于检测，所述试剂盒中还包括阴性和阳性对照。所述阳性对照为 昆虫杆状病毒表达系统表达的重组禽流感病毒核蛋白或所述昆虫杆状病毒表达系 统表达的重组禽流感病毒核蛋白溶液；所述阴性对照为未感染禽流感病毒的SPF鸡 胚尿囊液或其稀释液。所述昆虫杆状病毒表达系统表达的重组禽流感病毒核蛋白溶 液中，所述重组禽流感病毒核蛋白的浓度为15ug/ml;所述未感染禽流感病毒的SPF 鸡胚尿囊液的稀释液是将所述鸡胚尿囊液稀释40倍得到的。
本发明的抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体效价和特异性高。本发明的A型 流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒，能敏感而特异地从临床采集的拭子和 鸡胚繁殖的尿囊液中检测到A型流感病毒核蛋白抗原。操作简单，敏感性高，特异 性强。可用于A型流感病毒临床检测和实验室检测，具有很高的应用价值。
具体实施例方式
实施例1、对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4 CGMCC No. 2575分泌的单 克隆抗体
1)制备抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体
a. 动物免疫
将用甲醛灭活的H9N2亚型禽流感病毒注入到Balb/c小鼠体内，使其产生多克 隆抗体血清。
b. 细胞融合和克隆化
小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7: 1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融 合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔 进行克隆化，直到得到能稳定分泌抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞 株，将该抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为对A型流感病毒 NP蛋白杂交瘤细胞株C4，该细胞株已于2008年7月4日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科 学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2575。
c. 细胞冻存和复苏
将抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株用冻存液制成1X 109个 /ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37t:水浴中速 融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的生产与纯化
将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0. 5ral/只，7天后腹腔注射抗禽流感病毒 核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株106个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸 铵法进行腹水纯化，得到单克隆抗体，-2(TC保存。
实施例2、 A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒 一、A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒的组成 A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒其组成为1)已包抗A型禽流 感病毒核蛋白单克隆抗体的固体载体；2)辣根过氧化物酶标记的抗禽流感病毒核 蛋白的单克隆抗体；3)酶的底物存储液；4)阴性对照和阳性对照；5)酶联物及 标本的稀释液；6)洗涤液；7)酶反应终止液。
1) 已包被抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的固体载体的制备 用包被缓冲液将对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4 CGMCC No. 2575分泌
的单克隆抗体稀释至蛋白质含量为1.5" g/mL，在每个96孔EIA高效结合酶标板(美 莱博公司)的反应孔中加0.1ml， 37'C放置2h后4r过夜。次日，弃去孔内溶液， 用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟，然后再每孔中加入15(^1封闭液，37°。温育2h， 倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
其中，包被液Na2C03 1.59g， NaHC03 2.93g，加蒸馏水至1L， 121。C高压灭菌 30min， 4。C保存；洗涤液NaCl 80. 0g， KC1 2. 0g， Na2HP04 12H20 2. 9g， KH2P04 2 . 0g， 去离子水10L， pH值调至7. 3, 121。C高压灭菌30min，加入0. 05%Tween 20;封闭 液明胶(Sigma公司进口分装)l.Og加入lOOmL包被液，配成1%工作浓度。
2) 辣根过氧化物酶标记的抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体
将对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4 CGMCC No. 2575分泌的单克隆抗体 与辣根过氧化物酶(HRP)采用过碘酸盐氧化法进行偶联。
3) 酶的底物存储液
辣根过氧化物酶的底物为3，3，5，5-四甲基联苯胺(Serva公司)，3, 3, 5, 5-四 甲基联苯胺溶于二甲亚砜配制成3， 3， 5， 5-四甲基联苯胺浓度为10mg/ml的酶的底 物存储液。
4) 阴性对照和阳性对照
阳性对照经昆虫杆状病毒表达系统表达的禽流感病毒重组核蛋白(购自
AnaSpec, Inc.目录号为61024)，蛋白浓度600Pg/mL，使用时稀释到15Pg/mL。 阴性对照未感染禽流感病毒的SPF鸡胚尿囊液，使用时1:40稀释。
5) 酶联物及标本的稀释液
明胶(Sigma公司进口分装)0. lg加入lOOmL包被液，配成O. 1%工作浓度。
6) 洗涤液
NaC180.0g， KCl 2. Og， Na2HP04 12H20 2. 9g， KH2P04 2. Og，去离子水IOL， pH 值调至7. 3， 121。C高压灭菌30min，加入0. 05%Tween 20。
7) 酶反应终止液
H2S04 (96%) 22. 2mL，蒸馏水177. 8mL， 4。C保存。
二、 A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒的使用方法
1) 待检样品裂解物
取待检的拭子或尿囊液，按4:1比例加入裂解液，4'C裂解18h，得到待检样品 裂解物。其中，裂解液Tris*碱O. 303g， Triton-100 25nL， KC1 0. 223g，加PBS (pH7. 5)至5mL。
2) 加入待检样品裂解物
将待检样品裂解物加入已包被抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的反应板 中，100uL/孔，同时每板设阴阳性抗原对照，各两孔，37"C作用1.5h。
3) 洗板 洗涤液洗板3次，每次3min。
4) 加入酶标抗体 反应板的每孔加入1:1000稀释的酶标抗体，37。C作用lh。
5) 洗板
洗涤液洗板3次，每次3min。
6) 加入底物溶液
加入新鲜配置的底物溶液，100ul/孔，37。C避光作用15min;
其中底物溶液为底物缓冲液10mL，酶的底物存储液100yL， 30% H202 10 yL， 现用现配；底物缓冲液0. lmol/L柠檬酸(21.0g/L) 24. 3mL， 0. 2mol/L Na2HP04 12H20 (71.6g/L) 25. 7mL，蒸馏水50mL， 4。C保存。 7) 终止反应
加入终止液终止反应，50uL/孔。
8) 读数 读取450nm的光吸收值。
9) 结果判定
将12份空白尿囊液分别加入封闭后的酶标板中，每个样品设一个重复对照孔， 加入1:1000稀释的酶标抗体，之后将配好的底物溶液加入酶标板，终止反应后， 在酶标仪上读取0D45。nm的光吸收值。
结果表明阳性对照的浓度达到15ug/mL，阴性对照1:40稀释时，阳性对照OD 值接近1. 000， 二者的比值最大，说明它们可以作为A型流感病毒核蛋白捕获ELISA 抗原诊断试剂盒的对照。
然后按公式阴阳临界值二OD平均值+3X标准差(3SD)计算得出临界值为0. 092。 待检样品的OD值大于0. 092判为阳性，OD值小于0. 092判为阴性。
实施例3、使用实施例2的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒检 测A型流感病毒核蛋白抗原
1)特异性的测定
为了验证本发明的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒的特异性， 使用实施例2的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒对13株A型流感 病毒(均稀释到2°狀单位)进行检测，同时设新城疫病毒(NDV) (Wei HL， Bai GR， A. S. Mweene, Zhou YC， Cong YL， Pu J， Wang S， Kida H, Liu JH. Rapid detection of avian influenza virus A and subtype H5N1 by single step multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction. Virus Genes 2006， 32(3) 261-267.)
(中国农业大学)作交叉反应验证(表1) 。 13株A型流感病毒分别为Ck/BJ/l/95、 Ck/HB/l/96、 Ck/BJ/2/97、 Ck/GD/97、 Ck/HB/2/98、 Ck/HB/3/98、 Ck/SD/98、 Ck/HN/98、 Ck/BJ/3/99、Ck/LN/99、Ck/BJ/l/00、 Ck/HB/1/01和Ck/SD/l/02。 (LiuJH， Okazaki K， 0zaki H， Sakoda Y， Wu QM， Chen FY, Kida H. H9N2 influenza viruses prevalent in poultry in China are phylogenetically distinct from A/quail/Hong Kong/Gl/97 presumed to be the donor of the internal protein genes of the H5N1 Hong Kong/97 virus. Avian Pathology 2003， 32: 551-560; Liu JH， Okazaki K， Mweene A, Shi WM， Wu QM， Su几，Zhang GZ， Bai GR， Kida H. Genetic
conservation of hemagglutinin gene of H9 influenza virus in chicken population in Mainland China. Virus Genes. 2004， 29(3): 329-334.)(中国 农业大学)
表1特异性测定
Ck/BJ/1/952. 199Ck/HB/1/962.647
Ck/BJ/2/970. 284Ck/GD/972. 570
Ck/HB/2/982. 758Ck/HB/3/982. 805
Ck/SD/982,749Ck/HN/982. 741
Ck/BJ/3/992. 702Ck/LN/991. 426
Ck/BJ/1/002. 764Ck/HB/1/012.686
Ck/SD/1/022. 840阳性对照2, 766
阴性对照0. 049丽0. 058
实验结果表明，检测(不同亚型)A型流感病毒的0D450值在0. 284与2. 840 之间，与NDV不发生交叉反应(0D450=0.058)，显示了良好的特异性。
2、敏感性的测定
为了验证本发明的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒的敏感性， 选择HI (PR8 / 34) 、 H3 (Dk/Ukraine/63) 、 H4 (Dk/Czech/56) 、 H5 (Dk/HK/820/80)、 H7 (Dk/服/301/78)和H9 (Tk/WI/1/66)(世界卫生组织动物流感监测网)(中国 农业大学)；六种不同亚型A型流感病毒，2倍倍比稀释后进行检测，确定本发明 方法的最低检出量。
Hl、 H3、 H4、 H5、 H7、 H9亚型流感病毒检测的实验方法相同，具体步骤如下
1) 待检样品裂解物
分别取H1、 H3、 H4、 H5、 H7、 H9亚型流感病毒尿囊液，按4:1比例加入裂解 液，4。C裂解18h，得到样品裂解物。其中，裂解液Tris'碱0.303g， Triton-100 25ML， KC1 0.223g，加PBS (pH7. 5)至5mL。
2) 加入样品裂解物
分别将H1、 H3、 H4、 H5、 H7、 H9亚型流感病毒尿囊液裂解物作2倍倍比稀释， 得到22-2—3HA单位的裂解物稀释液，然后使用本发明的A型流感病毒核蛋白捕获 ELISA抗原诊断试剂盒检测不同稀释度的裂解物。Hl、 H3、 H4、 H5、 H7、 H9六种亚 型A型流感病毒的0D450值如表2。
_表2.敏感性测定_
HA单位4_^_^_0. 5 0. 25 0. 125
Hl 1.635 0.815 0.697 0.379 0.203 0.097
H31.1220. 7460. 4580. 2200. 1280. 085
H41.9541. 4781. 1090. 6250. 3060. 100
H51.8221. 2770. 7230. 4050. 1470. 085
H71.4040. 8670. 5450. 2760. 1850. 077
H91.5400. 7360. 4790. 2860. 1420. 080
实验结果表明本发明的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒检测此 6个亚型流感病毒均可检测到2—2个HA单位，说明该试剂盒具有较好的敏感性。 3、与病毒分离法比较本发明的试剂盒的符合率
为了验证本发明的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒与其他病毒 检测方法相比的符合率，使用本发明的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试 剂盒与病毒分离法(参见《哺乳动物、禽和蜜蜂A'B类疾病诊断试验和疫苗标准 手册》，国际兽疫局编著，1996:136-137)对同一批144份临床采集拭子进行检测。
实验结果表明，144份临床釆集拭子中病毒分离方法检测出8份阳性样品，其 余136份为阴性样品。在病毒分离方法检测出的8份阳性样品中，本发明的A型流 感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒检出7份为阳性；144份临床采集拭子中 本发明的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒检出137份为阴性。
权利要求
1、对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4，其保藏号为CGMCC No.2575。
2、 A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No. 2575的对A型流 感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4分泌产生的。
3、 A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒，包括已包被权利要求2所述 的单克隆抗体的固体载体和酶标记的权利要求2所述的单克隆抗体。
4、 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述酶为辣根过氧化物酶。
5、 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括阴性 和阳性对照。
6、 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述阳性对照为昆虫杆状病毒 表达系统表达的重组禽流感病毒核蛋白或所述昆虫杆状病毒表达系统表达的重组禽 流感病毒核蛋白溶液；所述阴性对照为未感染禽流感病毒的SPF鸡胚尿囊液或其稀释 液。
7、 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述昆虫杆状病毒表达系统表 达的重组禽流感病毒核蛋白溶液中，所述重组禽流感病毒核蛋白的浓度为15ug/ml; 所述未感染禽流感病毒的SPF鸡胚尿囊液的稀释液是将所述鸡胚尿囊液稀释40倍得 到的。
8、 权利要求1所述的单克隆抗体在制备A型流感病毒核蛋白ELISA诊断试剂盒 中的应用。
9、 权利要求3所述试剂盒在A型流感病毒核蛋白检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒及专用单克隆抗体。该抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.2575的对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4分泌产生的。该试剂盒，包括已包被所述的单克隆抗体的固体载体和酶标记的所述的单克隆抗体。本发明的抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体效价和特异性高。所述的试剂盒操作简单，敏感性高，特异性强，可用于A型流感病毒临床检测和实验室检测，具有很高的应用价值。
文档编号C12N5/20GK101348777SQ20081011722
公开日2009年1月21日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者刘芹防, 刘金华, 娟 蒲, 阎春梅, 马广鹏 申请人:中国农业大学