一种永生化猪肝细胞大规模培养的方法

专利名称：一种永生化猪肝细胞大规模培养的方法
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，涉及一种永生化猪肝细胞大规模培养的 方法。
背景技术：
近年来，以肝细胞为基础的生物型人工肝或肝细胞移植成为目前肝衰竭 治疗基础与临床研究的重点和热点；肝细胞是生物型人工肝的生物部分，起 着核心作用；由于原代人肝细胞因其同源性和良好细胞代谢等功能，可视为 生物型人工肝最理想的细胞材料；但是，由于肝脏来源的短缺、肝细胞无法 长期培养和体外增殖等问题是困扰人肝细胞作为生物型人工肝的细胞源的最 大障碍。
由于猪肝细胞与人肝细胞具有类似的大小、结构和生物学特性，其代谢 功能和免疫功能与人肝细胞相比具有较高的相似性；因而，目前生物型人工 肝的基础和临床研究(文献:QianY， Lanjuan L， Jianrong H， et al. Study of severe hepatitis treated with a hybrid artificial liver support system. Int J Artif Organs, 2003; 26(6) :507-513)以及肝细胞移植(文 献NagataH， Nishitai R， ShirotaC, et al. Prolonged survival of porcine h印atocytes in cynomolgus monkeys. Gastroenterology, 2007; 132(1) :321-329)也使用原代猪肝细胞作为肝细胞源，结果均显示猪肝细 胞能够明显延长肝衰竭病人或动物的生存时间和临床症状等。
通过细胞永生化的技术，能够获得无限传代、并具有原代肝细胞功能的 肝细胞系；已有研究报道将SV40大T抗原基因和人端粒酶逆转录酶导入到原 代猪肝细胞，建立了永生化猪肝细胞系(文献潘小平，杜维波，郝邵瑞， 等。永生化猪肝细胞的建立及其鉴定。中华传染病杂志，2008， 26 (7): 406-409);该永生化猪肝细胞系具有分泌白蛋白等原代猪肝细胞生物学特性 和功能，而且增殖能力强、无致瘤性，克服了原代猪肝细胞在体外培养时功
能维持时间短、培养条件要求高、难以传代等缺点；
但是，要想真正实现永生化猪肝细胞来代替原代猪肝细胞在生物型人工 肝或肝细胞移植等方面的应用，获得足够数量并具有高度活性和良好功能的 永生化猪肝细胞、以及解决异种肝细胞的免疫排斥问题是生物型人工肝或肝 细胞移植获得成功的关键；因此，要想解决上述两个问题，必须建立一种永 生化猪肝细胞大规模培养的方法。
细胞微囊化技术就是将细胞采用无毒性的高分子材料包裹，形成直径为 数十微米甚至数百微米的微囊。微囊内的细胞生存所需要的营养物质、氧气、 代谢产物及其分泌的生物活性物质能够透过半透膜进入微囊内，而宿主免疫 细胞、免疫球蛋白、补体等则不能通过半透膜进入微囊内；总之，细胞微囊 化技术具有利于细胞大量生长的三维空间和具有避免细胞移植中的免疫排斥 反应等作用；在细胞治疗的基础研究及临床疾病的替代治疗领域中，细胞微 囊技术均显示出巨大的应用价值(文献0riveG， Herndndez賜，Gasc6n AR， et al. Cell encapsulation: promise and progress. Nat Med. 2003; 9(1):104-107; Dove A. Cell-based therapies go live. Nat Biotechnol. 2002:20(4) :339-343)。同样，微囊化原代肝细胞在人工肝或肝细胞移植治疗 肝衰竭动物等方面也同样取得了较大的进步(文献l: AokiT， JinZ， Nishino N， et al. Intmsplenic transplantation of encapsulated hepatocytes decreases mortality and improves liver functions in fulminant hepatic failure from 90% partial hepatectomy in rats. Transplantation. 2005; 79(7):783-790;2:Dixit V， Gitnick G. The bioartificial liver: state-of-the-art. Eur J Surg Suppl. 1998 ;( 582) :71-76)。这样，总结 已有的研究经验，利用微囊化技术的优点，我们就可以实现永生化猪肝细胞 的高活性的大规模培养，微囊化后永生化猪肝细胞具有避免免疫排斥反应的 作用。
与传统静止单层培养相比，细胞转瓶培养能够有效增加细胞培养的面积、 促进细胞与气体的交换次数，有利于细胞生长和收集，能大大提高细胞培养 的产量，是实验室细胞培养、生物制药业小试、中试及批量生产的理想设备。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种永生化猪肝细胞大
规模培养的方法，包括以下步骤
(1) 将收集的永生化猪肝细胞接种至含有10%胎牛血清的180-250ml DMEM的Bellco转瓶中，置于37。C、 5% C02的3L三层转瓶培养系统中旋转培 养，转速为1转/分；待细胞长满汇合后，永生化猪肝细胞经过消化、收集、 离心、弃上清后，制成细胞悬液，计数细胞活率；用1.5-2. 0%浓度的海藻酸 钠溶液调整永生化猪肝细胞的浓度为1-2.5X106个/mL，冰浴中备用；
(2) 在无菌环境下进行，用步骤(1)中调整浓度后得到的永生化猪肝 细胞，采用一步法海藻酸-壳聚糖制备永生化猪肝细胞微囊；将永生化猪肝细 胞微囊转移至Bellco转瓶中，并加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液 180-250 ml，置于37。C、 5% C02的3L三层转瓶培养系统中旋转培养，转速为 l转/分；每间隔2-4天，用100-200目的细胞筛网过滤培养中的微囊细胞， 更换培养基后继续培养；直至培养14天后，收集微囊化永生化猪肝细胞。
步骤(1)中所述的收集的永生化猪肝细胞，是指在含有10%胎牛血清的 DMEM的两个75 cm2细胞培养瓶中分别接种1-5.0乂106个永生化猪肝细胞，置 于37'C、 5%<:02培养箱培养，待细胞长满汇合后，以0.25%胰蛋白酶消化细胞， 将消化后的细胞制成细胞悬液，按l: 2传代培养，经过3-5天后；共收集4 瓶75ci^培养瓶中的永生化猪肝细胞。
步骤(1)中的消化、收集、离心、弃上清，制成细胞悬液，是指待细胞 长满汇合后，PBS洗涤3遍，以50ml的0. 25%胰蛋白酶消化转瓶中细胞至部 分脱落，总需3-5分钟；然后加入70-100 ml含有10%胎牛血清的DMEM终止 消化，并经过细胞收集、转速为1000 rpm/min的离心5分钟、弃上清后，将 永生化猪肝细胞沉淀制成细胞悬液。
步骤(2)中更换培养基，是指更换含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液 180-250 ml。
本发明还提供乐以上任一所述制备的一种微囊化永生化猪肝细胞。 本发明提供的微囊化永生化猪肝细胞，可作为肝细胞源应用于生物型人 工肝或肝细胞移植。
本发明的具有以下有益效果本发明利用细胞微囊化技术和细胞转瓶培 养的各自优点，将两者相结合的方法来实现永生化猪肝细胞的大规模培养； 经过微囊化技术和转瓶大规模培养后，能够获得足够数量的微囊化永生化猪 肝细胞，每个Bellco转瓶的永生化猪肝细胞经微囊化转瓶培养后可达到2. 7 X 109-7. 5X 109个；所获得的大量微囊化永生化猪肝细胞仍具有原代肝细胞的 生物学特性和功能，例如白蛋白合成、安定代谢、以及尿素合成等功能，该 微囊化永生化猪肝细胞可望用于生物型人工肝、异种肝细胞移植等方面的应 用。
具体实施例方式
下面结合具体实施方法对本发明作进一步详细描述
永生化猪肝细胞的获得如文献所述(文献潘小平，杜维波，郝邵瑞，
等。永生化猪肝细胞的建立及其鉴定。中华传染病杂志，2008， 26 (7): 406-409)。
一、 永生化猪肝细胞的转瓶培养，细胞计数、细胞存活率分析 在含有10%胎牛血清的DMEM的两个75 cn^细胞培养瓶中分别接种1-5.0
X 106个永生化猪肝细胞，培养瓶中含有10-15ml的DMEM，然后置于37°C 、5%C02 培养箱培养，待细胞长满汇合后，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，将消化后的细 胞制成细胞悬液，按l: 2传代培养，继续培养3-5天后；共收集4瓶75cm2 培养瓶中的永生化猪肝细胞，并将其接种至含有10%胎牛血清的DMEM (溶液 量为180-250ml)的Bellco转瓶(美国Bellco公司)中，置于37°C、 5%C02 的新型3L三层转瓶培养系统(美国Bellco公司)中旋转培养(转速1转/ 分钟)。待细胞长满汇合后，PBS洗涤3遍，以50ml的0. 25%胰蛋白酶消化转 瓶中细胞至部分脱落，总需3-5分钟；然后加入70-100 ml含有10%胎牛血清 的DMEM终止消化，并经过细胞收集、离心5分钟(转速为1000 rpm/min)、 弃上清后，将永生化猪肝细胞沉淀制成细胞悬液，并经台盼蓝(Sigma公司) 染色，计数细胞数量和活率， 一个长满永生化猪肝细胞的Bellco大转瓶细胞 总数可达1.5-2, 5X1()8个；用1.5-2.0%海藻酸钠(美国Sigma公司)溶液调 整永生化猪肝细胞的浓度为1-2.5X107mL，冰浴中备用。以永生化猪肝细胞 的活率大于95%以上，作为细胞活率的判断标准，并方可进一步试验。
二、 微囊化永生化猪肝细胞的制备和转瓶培养
采用一步法海藻酸-壳聚糖(AC法)制备微囊化永生化猪肝细胞，整个过 程在百级实验室(无菌环境)进行。其步骤包括
1、将经高压灭菌后的微囊发生器(瑞士， Nisco公司)按厂家要求说明
连接微囊发生器的各个部件，使仪器处于正常可待用状态。
2、 调节微囊发生器参数，将上述步骤一所得的永生化猪肝细胞(永生化 猪肝的浓度为1-2.5X106个/mL)的海藻酸钠溶液形成大小一致的小液滴，微 囊直径控制在200-300um之间。
3、 将上述步骤2所得的海藻酸钠溶液滴入到含有0. lmol/L CaCL2、 13 mmol/L HEPES (中文名4-羟乙基哌嗪乙磺酸)的0. 5%壳聚糖(济南海得贝 海洋生物工程有限公司)溶液中，边滴边搅拌，并持续30分钟。
4、 蒋步骤3后的微囊化永生化猪肝细胞再经无血清的DMEM洗涤3-5遍。
5、 将步骤4后的微囊化永生化猪肝细胞移入Bellco转瓶中，加入含有 10。/。胎牛血清的DMEM高糖培养液180-250 ml，置于37。C、 5%0)2的新型3乙三 层转瓶培养系统中旋转培养(转速l转/分钟)。
6、 每间隔2-4天，用100-200目细胞筛网(瑞士Nisco公司)过滤培养 的微囊细胞，更换培养基后继续培养(培养基含有10%胎牛血清的DMEM高 糖培养液180-250 ml);直至培养14天后，收集微囊化永生化猪肝细胞，此 时细胞增殖的倍数为18至30倍，即每个Bellco转瓶的永生化猪肝细胞经过 微囊化转瓶培养后可达到2. 7 X 109-7. 5 X 109。
7、 如果需要进一步增加收获的细胞数量，可以按照此方法扩大Bellco 转瓶培养的瓶数即可达到。
三、微囊化永生化猪肝细胞的形态、数量，以及功能分析
1) 、倒置相差显微镜及激光共聚焦显微镜的形态学观察 永生化猪肝细胞在微囊内的生长状态是转瓶培养1天后，微囊内永生
化猪肝细胞呈圆形， 一般单个、均匀分布；转瓶培养至7天后，囊内细胞开
始聚集，出现大小不一的团块，细胞聚集体的个数达到6-10个；随着培养时
间的延长，团块逐渐变大，转瓶培养至14天后，细胞聚集体的个数达到10-17 个。
2) 、微囊化永生化猪肝细胞的计数
将在转瓶培养中微囊化永生化猪肝细胞，于一定时间培养后，取出部分 微囊，并机械破碎微囊，经离心后获得微囊内的细胞，经台盼蓝染色后显微
镜下观察并计数，结果为转瓶培养1天后每个微囊内细胞数为10-19个；
培养7天后每个微囊内细胞数为63-136个；转瓶培养至14天后，细胞增殖 至生长平台期，每个微囊内细胞为198-385个。然而，微囊内永生化猪肝细
3)、微囊化永生化猪肝细胞功能检测
(1) 白蛋白含量采用美国Bethyl公司的酶连免疫吸附试验(ELISA) 试剂测定培养上清的猪白蛋白含量。按试剂盒说明书来操作(并参考文献 Dawei Yang， Toshie Koyama， Ai 0kamura, et al. Materials Science and Engineering: C. 2004; 24(3) :323-327)，其简要步骤如下以抗猪白蛋白 抗体(美国Bethyl公司)(10ug/ml， 100ul/孔)4。C过夜包被96微孔板；经 洗涤3遍后，每孔加入200ul封闭液37。C孵育30分钟；经洗涤3遍，每孔加 入100ul猪白蛋白标准品(美国Bethyl公司产品)(6. 25-400ng/ml)和微囊 化永生化猪肝细胞培养上清，37'C水浴孵育1小时；洗涤5遍，然后加入辣 根过氧化物酶标记抗猪白蛋白抗体(美国Bethyl公司)，37t:水浴孵育1小 时；洗涤5遍，每孔加入底物液(试剂盒自带)100ul， 37。C水浴孵育10分 钟；硫酸终止，450nm酶标仪(美国伯乐BIO-RAD公司)读取OD值。结果显 示微囊化永生化猪肝细胞培养上清的猪白蛋白含量，随着转瓶培养的天数 的增加，其白蛋白含量显著地增加，并于微囊化永生化猪肝细胞转瓶培养后 14天，上清的白蛋白含量达到高峰。
(2) 肝细胞的尿素合成功能采用美国Sigma-Aldrich公司试剂盒检测 微囊化永生化猪肝细胞的尿素合成功能，按照试剂盒说明书来操作(参考文 献Yin C， Mien Chia S， Hoon Quek C， et al. Microcapsules with improved mechanical stability for h印atocyte culture. Biomaterials, 2003; 24: 1771-1780)。结果显示微囊内永生化猪肝细胞显示出良好的尿素合成功能， 随着转瓶培养的天数的增加，其尿素氮含量显著地增加，并于微囊化永生化 猪肝细胞转瓶培养后14天，细胞上清的尿素氮含量达到高峰。
(3) 微囊化永生化猪肝细胞安定代谢功能检测 微囊化永生化猪肝细胞安定代谢功能检测如文献所述(文献王宁。
H印G2-GS-3A4细胞应用于人工生物肝脏以增强安定与氨的代谢。中国医科大 学，2004中国优秀博士学位论文全文数据库)。每间隔48小时后，分别收集 经转瓶培养后的微囊化永生化猪肝细胞，无血清DMEM培养基洗涤3-5遍，加 入含有50ug/L安定的无血清画EM高糖培养液，37。C转瓶培养2小时后，取 上清用HPLC法测定安定浓度。结果显示微囊化永生化猪肝细胞安定代谢功 能从2天起，安定转化功能逐步增强，至12天达到高峰；然后，至14天时
安定转化功能保持稳定。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能 从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保 护范围。
权利要求
1、一种永生化猪肝细胞大规模培养的方法，其特征依次包括以下步骤(1)将收集的永生化猪肝细胞接种至含有10％胎牛血清的180-250mlDMEM的Bellco转瓶中，置于37℃、5％CO2的3L三层转瓶培养系统中旋转培养，转速为1转/分；待细胞长满汇合后，永生化猪肝细胞经过消化、收集、离心、弃上清后，制成细胞悬液，计数细胞活率；用1.5-2.0％浓度的海藻酸钠溶液调整永生化猪肝细胞的浓度为1-2.5×106个/mL，冰浴中备用；(2)在无菌环境下进行，用步骤(1)中调整浓度后得到的永生化猪肝细胞，采用一步法海藻酸-壳聚糖制备永生化猪肝细胞微囊；将永生化猪肝细胞微囊转移至Bellco转瓶中，并加入含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液180-250ml，置于37℃、5％CO2的3L三层转瓶培养系统中旋转培养，转速为1转/分；每间隔2-4天，用100-200目的细胞筛网过滤培养中的微囊细胞，更换培养基后继续培养；直至培养14天后，收集微囊化永生化猪肝细胞。
2、 根据权利要求1所述的一种永生化猪肝细胞大规模培养的方法，其特征在 于步骤(1)中所述的收集的永生化猪肝细胞，是指在含有10%胎牛血清的DMEM 的两个75 cm2细胞培养瓶中分别接种卜5.0X106个永生化猪肝细胞，置于37'C、 5°/￡02培养箱培养，待细胞长满汇合后，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，将消化后的 细胞制成细胞悬液，按l: 2传代培养，经过3-5天后；共收集4瓶75cm2培养瓶 中的永生化猪肝细胞。
3、 根据权利要求1所述的一种永生化猪肝细胞大规模培养的方法，其特征在 于步骤(1)中的消化、收集、离心、弃上清，制成细胞悬液，是指待细胞长满 汇合后，PBS洗涤3遍，以50ml的0. 25%胰蛋白酶消化转瓶中细胞至部分脱落， 总需3-5分钟；然后加入70-100ml含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，并经过 细胞收集、转速为1000rpm/min的离心5分钟、弃上清后，将永生化猪肝细胞沉 淀制成细胞悬液。
4、 根据权利要求1所述的一种永生化猪肝细胞大规模培养的方法，其特征在 于步骤(2)中更换培养基，是指更换含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液180-250 ml。
5、 权利要求1至4中任一所述制备的一种微囊化永生化猪肝细胞。
6、 权利要求5所述的微囊化永生化猪肝细胞，可作为肝细胞源应用于生物型人工肝或肝细胞移植。
全文摘要
本发明公开了一种永生化猪肝细胞大规模培养的方法，包括将收集的永生化猪肝细胞接种至转瓶中，经三层转瓶培养系统中旋转培养，用1.5-2.0％浓度的海藻酸钠溶液调整永生化猪肝细胞的浓度为1-2.5×10⁶个/mL；再调整浓度后得到的永生化猪肝细胞，采用一步法海藻酸-壳聚糖制备永生化猪肝细胞微囊；本发明还公开了一种微囊化永生化猪肝细胞。本发明提供的微囊化永生化猪肝细胞，可作为肝细胞源应用于生物型人工肝或肝细胞移植，本发明制备出的抗HCMV gBn1抗体，其优点为特异性强、灵敏度高。
文档编号C12N5/06GK101392235SQ20081012199
公开日2009年3月25日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者吕国良, 喻成波, 李兰娟, 杜维波, 潘小平, 章益民, 虞晓鹏 申请人:浙江大学